¿Cuáles son los pasos básicos para la clonación de genes?
Los pasos básicos de la clonación de genes son los siguientes:
1. Obtención del fragmento de ADN objetivo:
El primer paso en la clonación de ADN es la obtención del objetivo. gen que incluye el gen diana. Un grupo de moléculas de ADN, que se derivan del ADN genómico del organismo diana o de moléculas de ADNc bicatenario sintetizadas mediante transcripción inversa del ARNm de la célula diana.
Dado que el ADN genómico es grande y no es propicio para la clonación, es necesario procesarlo en pequeños fragmentos de ADN adecuados para la clonación. Los métodos comúnmente utilizados incluyen el corte mecánico y la digestión con endonucleasas de restricción de ácidos nucleicos. Si la secuencia del gen es conocida y relativamente pequeña, se puede sintetizar directamente mediante química artificial. Si se conocen las secuencias parciales de ambos extremos del gen, se pueden diseñar cebadores basándose en las secuencias conocidas y el gen diana se puede obtener a partir de ADN genómico o ADNc mediante tecnología de PCR.
2. Selección de vectores:
Los vectores comúnmente utilizados para la clonación de genes incluyen: vectores plásmidos, vectores fagos, vectores cósmidos, vectores fagos de ADN monocatenario, vectores fagémidos y vectores artificiales de levadura. Cromosomas, etc. En términos generales, según el propósito de utilizar el vector, el vector se puede dividir en vector de clonación, vector de expresión, vector de secuenciación, vector lanzadera, etc.
3. Recombinación in vitro:
La recombinación in vitro es el proceso de conectar el fragmento diana y la molécula portadora in vitro. La mayoría de las endonucleasas de restricción de ácidos nucleicos pueden cortar moléculas de ADN para formar extremos adhesivos. Los mismos extremos adhesivos se pueden obtener cortando los múltiples sitios de clonación de vectores apropiados con la misma enzima o una enzima homóloga. Los extremos adhesivos se hibridan entre sí y pasan a través de recombinantes. Puede formarse por la acción de la ADN ligasa T4, que es una ligadura de extremos pegajosos.
Cuando el fragmento de ADN objetivo tiene un extremo romo, se puede conectar directamente al vector con un extremo romo. Esta es una ligadura de extremos romos, pero la eficiencia de la ligadura es menor que la ligadura de extremos adhesivos. A veces, para diferentes propósitos de clonación, como insertar una molécula de ADN con extremos romos en un vector de expresión con extremos adhesivos para lograr la expresión, la molécula de ADN con extremos romos debe modificarse mediante algunas modificaciones;
Como agregar un cola a un polímero, agregando un enlazador Materiales o enlazadores artificiales, métodos de PCR para introducir sitios de corte de enzimas, etc. pueden obtener los extremos adhesivos correspondientes y luego conectarlos. Esta es la ligadura de extremos adhesivos modificados.
4. Introducción en las células receptoras:
La molécula de ADN vector tiene un sitio de origen de replicación que puede ser reconocido por las células huésped procarióticas, por lo que puede replicarse en células procarióticas como E. coli. El gen diana en el vector recombinante se amplifica junto con el vector y finalmente se obtiene una gran cantidad de moléculas de ADN recombinante idénticas.
5. Cribado de recombinantes:
El proceso de identificación de transformantes que contienen el gen diana, es decir, clones positivos, a partir de transformantes obtenidos a partir de diferentes moléculas de ADN recombinante es el cribado. Los métodos de detección maduros desarrollados son los siguientes:
(1) Método de inactivación por inserción: se insertan fragmentos de ADN exógenos en el sitio de clonación múltiple ubicado en el gen marcador de detección (gen del antibiótico o gen de la β-galactosidasa). el gen marcador se inactivará y la correspondiente resistencia a los antibióticos del transformante desaparecerá o el color del transformante cambiará. A través de estos, el transformante puede identificarse preliminarmente como recombinante o no recombinante. El método colorimétrico de β-galactosidasa comúnmente utilizado es el método de detección azul y blanco (las colonias blancas son plásmidos recombinantes).
(2) Método de digestión con enzimas de restricción y detección por PCR: extraiga las moléculas de ADN recombinante en los transformantes como plantillas, diseñe cebadores específicos basados en las secuencias conocidas de ambos extremos del gen diana y cribe clones positivos mediante Tecnología PCR. Los clones positivos seleccionados mediante PCR se identificaron además mediante digestión con endonucleasa de restricción para determinar el tamaño del fragmento insertado.
(3) Método de hibridación molecular de ácido nucleico: prepare sondas de ácido nucleico específicas para el gen objetivo y seleccione clones objetivo de numerosos transformantes mediante hibridación molecular de ácido nucleico. La sonda de ácido nucleico específica para el gen diana puede ser un fragmento parcial del gen diana que se haya obtenido, o un grupo de oligonucleótidos obtenidos deduciendo la secuencia parcial de la proteína de expresión del gen diana, o genes homólogos de otras especies.
(4) Método de detección inmunológica: después de obtener el anticuerpo proteico expresado por el gen diana, se puede utilizar el método de detección inmunológica para obtener el clon del gen diana. Estos anticuerpos pueden purificarse del propio organismo para expresar la proteína del gen diana, o pueden clonarse a partir del fragmento ORF parcial del gen diana en un vector de expresión para obtener el anticuerpo que expresa la proteína.
Información ampliada:
Notas sobre la clonación de genes:
1. Ligadura de extremos romos: la ADN ligasa puede catalizar las mismas y diferentes escisiones de endonucleasas de restricción. La conexión entre los extremos planos.
En principio, los extremos romos generados después de que las enzimas de restricción cortan el ADN también son extremos compatibles y pueden conectarse entre sí si los extremos pegajosos generados se tratan con enzimas especiales para llenar o aplanar los salientes monocatenarios y convertirlos en extremos romos. Esto también se puede hacer.
2. Conexión de cola: la conexión de cola de homopolímero utiliza el efecto de recocido entre secuencias de homopolímero, como poli A y poli T, para completar la conexión. Bajo la acción de la transferasa terminal, se crean extremos adhesivos en los extremos de los fragmentos de ADN y luego se conectan. Este es un método para mejorar artificialmente la eficiencia de la conexión y también es una forma especial de conexión de extremo adhesivo.
3. Ligadura de conector artificial: para fragmentos de ADN de extremos romos o ADN vector, se puede conectar un conector fosforilado (enlazador) o una molécula apropiada al extremo romo antes de la ligación para generar nuevos puntos de endonucleasa de restricción. Luego se utilizan enzimas de restricción que reconocen el nuevo sitio para escindir el extremo distal del adaptador, creando extremos pegajosos.
Enciclopedia Baidu-Clonación de genes
Enciclopedia Baidu-Clonación de ADN