El concepto de diagnóstico genético y su aplicación en medicina.

El diagnóstico genético es un método de diagnóstico de enfermedades mediante la detección de la presencia de genes, el análisis de los tipos y defectos de los genes y si sus funciones de expresión son normales. Es la cuarta generación de tecnología de diagnóstico después del diagnóstico morfológico, bioquímico e inmunológico. Su nacimiento y desarrollo se benefician del rápido desarrollo de la teoría y la tecnología de la biología molecular.

Técnicas de diagnóstico genético habituales:

1.

El principio básico es que la membrana de nitrocelulosa o la membrana filtrante de nailon tienen una fuerte capacidad de adsorción de ADN monocatenario. Después de la electroforesis, el gel se desnaturaliza con ADN, se cubre con una membrana de filtro y luego se presiona con varias capas de papel absorbente seco encima. A medida que se absorbe hacia arriba desde la solución salina profunda, el ADN monocatenario del gel se transfiere a la membrana del filtro. La transferencia es in situ, es decir, la posición del fragmento de ADN permanece inalterada. Después de la transferencia, el ADN secado a 80°C se fijó in situ sobre la membrana.

Cuando un fragmento que contiene un gen específico se ha transferido in situ a la membrana, puede hibridarse con una sonda marcada con isótopos y mostrar una señal de hibridación. La hibridación se realiza normalmente en una bolsa de plástico y en la bolsa se coloca el filtro de hibridación mencionado anteriormente. Después de agregar la solución de hibridación que contiene la sonda desnaturalizada, el ADN de la sonda monocatenaria y las moléculas de ADN del gen monocatenario fijadas en la membrana se combinan completamente a una determinada temperatura según el principio de complementariedad de pares de bases. La unión es específica, por ejemplo, sólo el ADN del gen de la β-globina puede unirse a la sonda de β-globina. Después de la hibridación, la sonda no unida a la membrana se elimina con lavado, se aplica una película de rayos X a la membrana y se realiza una autorradiografía bajo la luz solar en una caja oscura. Aparecerá una banda de hibridación negra en el fragmento de ADN que se une a la sonda marcada con isótopos. La eliminación o mutación del gen puede provocar la eliminación o el cambio de posición de esta banda.

En segundo lugar, la reacción en cadena de la polimerasa

En los últimos años, el análisis genético y la tecnología de ingeniería genética han logrado avances revolucionarios, principalmente debido al desarrollo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y sus aplicaciones. Utilizando la tecnología PCR, un gen o fragmento de ADN específico se puede amplificar de cientos de miles a millones de veces en sólo 2 o 3 horas in vitro. Los fragmentos amplificados se pueden observar directamente mediante electroforesis y también se pueden utilizar para análisis posteriores. De esta manera, se puede observar directamente una pequeña cantidad de genes de copia única después de una amplificación de hasta un millón de veces sin utilizar isótopos para aumentar su sensibilidad. El diagnóstico que originalmente tomaba una o dos semanas se puede acortar a unas pocas horas.

3. Polimorfismo de longitud de fragmento amplificado

El ADN microsatélite y el polimorfismo de longitud del ADN microsatélite se pueden detectar mediante amplificación por PCR y electroforesis para analizar el enlace de genes que causan enfermedades. Este método de diagnóstico se denomina análisis de enlace del polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AMP-FLP). Después de la amplificación por PCR, la diferencia entre los productos, es decir, fragmentos alélicos, a veces es de sólo unos pocos nucleótidos y requiere electroforesis en gel de poliacrilamida para su separación e identificación. Este método se utiliza principalmente para análisis de ligamiento cuando se desconoce la naturaleza de la mutación.

IV.Método de diagnóstico con sonda oligonucleotídica específica de alelo

Cuando se comprende completamente el sitio de mutación y la naturaleza del gen, podemos sintetizar sondas oligonucleotídicas (ASO) específicas de alelo de forma isotópica o. diagnósticos no marcados isotópicamente. Las sondas suelen tener una longitud aproximada de 20 pb. Cuando se usa para detectar mutaciones puntuales, generalmente es necesario sintetizar dos sondas, que son completamente consistentes con la secuencia del gen normal y pueden hibridarse de manera estable con ella, pero no pueden hibridarse con la secuencia del gen mutado y la otra es consistente con la secuencia del gen mutado; y puede hibridarse con la secuencia del gen mutado. La secuencia se hibrida de forma estable, pero no con secuencias de genes normales, lo que permite distinguir genes con una sola mutación de base.

La PCR se puede combinar con ASO, es decir, la tecnología PCR-ASO, que primero amplifica el fragmento genético relevante que contiene el punto de mutación in vitro y luego se hibrida con la sonda ASO, lo que simplifica enormemente el método. Ahorra tiempo y sólo se puede realizar con una cantidad muy pequeña de ADN genómico.

5. Método de diagnóstico del polimorfismo de conformación monocatenario

El polimorfismo de construcción monocatenario (SSCP) se refiere al ADN monocatenario que puede causar polimorfismo debido a diferentes secuencias de bases. conducir a diferentes movilidades electroforéticas de ADN monocatenario de longitud igual o similar, por lo que puede usarse para sustituciones de bases simples, pequeñas deleciones o detección de manuscritos en ADN. Cuando se utiliza SSCP para detectar mutaciones genéticas, generalmente se diseña un par de cebadores cerca del fragmento de ADN mutado sospechoso para la amplificación por PCR, y luego el producto amplificado se desnaturaliza con formamida y se somete a electroforesis en un gel de poliacrilamida. Las diferencias en la conformación del ADN causadas por mutaciones aparecerán como diferencias en las posiciones de las bandas electroforéticas, lo que permitirá el diagnóstico.