Cómo determinar secuencias flanqueantes de ADN de secuencia conocida

Un método sencillo y eficaz para clonar fragmentos de ADN flanqueantes desconocidos

Red del Genoma de China Song Baoliang Qi Li Wei Liang Bo

Song Baoliang (Instituto de Ciencias Biológicas de Shanghai , Laboratorio Estatal Clave de Biología Molecular de la Academia China de Ciencias, Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Shanghai, 200031)

Laboratorio Estatal Clave de Biología Molecular, Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Instituto de Ciencias de la Vida de Shanghai, Academia China de Ciencias, Shanghai, 200031; Departamento de Ciencia y Tecnología Biológicas, Universidad de Nanjing, Nanjing, 210093)

Li (Laboratorio Estatal Clave de Biología Molecular, Instituto de Bioquímica y Biología Celular, Institutos para la Vida de Shanghai Sciences, Academia China de Ciencias, Shanghai, 200031)

Resumen: Para clonar ADN que contiene insertos largos, a menudo se requieren experimentos de subclonación y secuenciación. El método habitual consiste en obtener el espectro de endonucleasa de restricción del fragmento insertado, luego seleccionar la endonucleasa adecuada para digerir el ADN, aislar el fragmento diana y ligarlo en un vector plasmídico para el siguiente paso. Sin embargo, este método tiene una gran carga de trabajo y pasos complicados. A continuación se presenta un método que no requiere análisis del espectro de endonucleasas de restricción. Los experimentos de subclonación se realizan directamente basándose en las secuencias flanqueantes del fragmento diana. En primer lugar, se seleccionan enzimas de restricción apropiadas para digerir clones de ADN que contienen insertos largos, uno de los cuales corta en secuencias flanqueantes conocidas y el otro se selecciona al azar. La mezcla digerida con enzima se liga luego a un vector plasmídico linealizado y se obtiene una "biblioteca de subclones" transformando bacterias. Después de seleccionar los clones y cultivarlos en una placa de 96 pocillos, se obtiene la "biblioteca" correspondiente mezclando la solución bacteriana en filas o columnas. Finalmente, los clones positivos que contienen fragmentos de ADN diana se seleccionan mediante PCR, en la que un cebador se empareja con una secuencia de ADN flanqueante conocida y el otro se empareja con un vector plásmido, y el fragmento de ADN flanqueante conocido se amplifica mediante PCR para identificar clones positivos. Una gran cantidad de experimentos independientes han demostrado que este método es simple y eficaz, y puede usarse ampliamente en experimentos de subclonación y caminata del ADN.

También se puede utilizar PCR

Sección 5 Modo de aplicación fuera de sitio de PCR

1. Utilizar cebadores degenerados para PCR.

Los codones se fusionan, como se muestra en la tabla 22-4. No es exacto inferir la secuencia de ADN codificante sólo a partir de la secuencia de aminoácidos, pero se puede diseñar un par de cebadores combinados para amplificar todas las secuencias de ácidos nucleicos que codifican la secuencia conocida. Cuando se utilizan cebadores combinados, la secuencia de nucleótidos en el oligonucleótido puede variar, pero el número de nucleótidos debe ser el mismo. Cuanto menor sea el grado de consolidación, más especializado será el producto. Al diseñar cebadores, intente seleccionar aminoácidos con una tasa de fusión baja para evitar la fusión en el extremo 3' del cebador. La mezcla de cebadores utilizada para la fusión se ha utilizado con éxito para la amplificación, clonación y análisis de secuencia de ADN objetivo desconocido. En la actualidad, se han clonado con éxito el gen de la urato oxidasa porcina, el gen del péptido relacionado con la diabetes de mamíferos y aves de corral y el gen del virus hepatotrópico. La PCR cebada con desoxiinosina (desoxiinosina; DI) puede reemplazar las bases combinadas en varios codones combinados que codifican proteínas. La especificidad de DI se ve afectada principalmente por la concentración de ADNc.

Tabla 22-4 Fusión de codones

Aminoácidos

Número de codones

m, W

1

c, D, E, F, H, K, N, Q, Y

2

I

三

a, G, P, T, V

Cuatro

l, R, S

Seis

Nota : Al elegir una cadena peptídica, es mejor evitar los aminoácidos con 4 a 6 codones.

Segundo cebador anidado) PCR

Utilice el primer conjunto de cebadores para amplificar durante 15 a 30 ciclos y luego utilice el segundo conjunto de cebadores para amplificar el fragmento de ADN para amplificar. De 15 a 30 ciclos permiten que la secuencia sea amplificada de manera eficiente, pero la estructura secundaria rara vez se amplifica. Centrifugar utilizando el método de restricción de cebadores inicial o el filtro molecular Centricon 30 (Amicon) y retirar el primer conjunto de cebadores antes de agregar el segundo conjunto. Este método se ha utilizado con éxito para analizar mutaciones moleculares en AS52 en ovarios de hámster chino. Las células AS52 contienen una única copia del gen celular GPT (guanina fosforribonucleasa), que tiene homología con los mamíferos. La PCR con cebador anidado reduce la hibridación no específica de cebadores, lo que aumenta la amplificación específica y mejora la eficiencia de la amplificación.

Muy eficaz para la detección microbiana en muestras ambientales y la amplificación de ADN diana de genes de copia única.

Si los cebadores internos y externos de la PCR anidada se cambian ligeramente, la longitud del cebador externo se extiende (a 25 ~ 30 pb) y la longitud del cebador interno se acorta al mismo tiempo (15 ~ 17 pb), permitiendo que el cebador externo se amplificara a una temperatura de hibridación alta, y luego se cambió a un ciclo de tres temperaturas. Basado en la amplificación del cebador interno y el cebador externo, se realizó un ciclo de tres temperaturas a baja temperatura hasta el final. se completó la amplificación. Los dos ciclos se completan al mismo tiempo, lo que equivale a realizar una sola PCR, y la sensibilidad es la misma que la PCR secundaria anidada. Todos los procedimientos se pueden completar en nuestro termociclador PTc 51 Airflow DNA lanzado recientemente.

El éxito de la PCR única anidada permite completar todo el proceso de detección de PCR en 5 horas, haciendo realidad el informe de prueba del mismo día, y también proporciona una base realista para que las pruebas de PCR entren en la práctica clínica. .

En tercer lugar, la PCR múltiple (Multiplex PCR)

El método de utilizar múltiples pares de cebadores para amplificar varios fragmentos de ADN al mismo tiempo se denomina PCR compuesta. Este método fue desarrollado originalmente por Chanberlain et al. Posteriormente, Bej et al. desarrollaron un ensayo para la amplificación simultánea por PCR de secuencias de genes asociados con diferentes géneros de bacterias en muestras ambientales. Se combinaron dos genes diferentes de Legionella, uno el gen específico de pneumophila L (mip) y el otro el gen L-5SrRNA, mediante la adición escalonada de cebadores. Primero, se usaron cebadores mip durante 7 ciclos de amplificación por PCR y luego se agregaron cebadores 5SrRNA durante 38 ciclos de amplificación por PCR. La adición de diferentes cantidades de cebadores de los genes LacZ y LacB para la amplificación por PCR puede detectar E. coli y bacterias relacionadas con la contaminación fecal humana, incluidas E. coli, Salmonella y Shigella enteropatógenas.

En la PCR multiplex, los valores de Ta de todos los cebadores deben ser similares. Si la diferencia en los valores de Tq de dos pares de cebadores supera el 10%, las cantidades de productos amplificados serán significativamente diferentes, lo que dificultará la observación de uno de los productos amplificados o del ADN diana. Además, el ADN objetivo debe tener una longitud similar. Cuando la diferencia es grande, el ADN objetivo del fragmento corto se amplificará primero, por lo que se producirán productos de amplificación con rendimientos diferentes. Por lo tanto, es necesario utilizar amplificación por oscilación del ADN o agregar diferentes cebadores para resolver el problema.

Cuatro. PCR inversa (PCR inversa o PCR inversa)

La finalidad de la PCR inversa es amplificar el ADN que flanquea una secuencia conocida, es decir, este sistema de reacción no es entre un par de cebadores sino que sintetiza ADN fuera de los cebadores ( ver Figura 22-2). La PCR inversa se puede utilizar para estudiar secuencias cromosómicas desconocidas conectadas a fragmentos de ADN conocidos, por lo que también se denomina desaceleración cromosómica o marcha cromosómica. En este momento, aunque los cebadores seleccionados son complementarios a las secuencias en ambos extremos de la región central del ADN, los extremos 3' de los dos cebadores son opuestos entre sí. Antes de la amplificación, la muestra de ADN se digiere con enzimas de restricción, luego se conecta en moléculas circulares de ADN mediante ADN ligasa y se utiliza PCR inversa para amplificar los fragmentos ascendentes y descendentes de los cebadores. Se han preparado sondas de hibridación para grandes fragmentos lineales de ADN de cromosomas artificiales de levadura (YAC), lo cual es muy importante para determinar la secuencia de inserción del transposón e identificar la secuencia del fragmento de ADN en el cromosoma del banco de genes.

Las desventajas de este método son: ① Es necesario seleccionar una enzima de restricción entre muchas enzimas, o debe elegir una enzima adecuada para la digestión para obtener fragmentos de ADN de tamaño razonable. Esta selección no escinde el ADN diana en sitios no restrictivos. ② La mayoría de los genomas nucleados contienen una gran cantidad de secuencias moderadas y altamente repetitivas. Estas secuencias a veces se encuentran en secuencias funcionales desconocidas en YAC o cósmidos, de modo que la sonda obtenida por PCR inversa puede hibridarse con múltiples secuencias de genes.

La PCR inversa se puede utilizar para analizar secuencias desconocidas amplificadas, explorar secuencias adyacentes a fragmentos de ADN conocidos, clonar molecularmente ADNc de longitud completa con solo secuencias parciales y establecer sondas de ADN de longitud completa. Adecuado para estudiar la migración de genes, elementos transponibles y análisis del sitio de integración de virus que flanquean el ADN con secuencias conocidas.

Figura 22-2 Diagrama esquemático del principio de la PCR inversa

La línea ondulada representa el ADN objetivo, el cuadrado representa la secuencia de búsqueda de alas y ▲ y △ representan la restricción. posicionamiento de enzimas.

Los puntos, las posiciones complementarias de los cebadores y plantillas de oligonucleótidos están marcados con flechas planas.

5. PCR Asimétrica (PCR Asimétrica)

El principio básico de la PCR asimétrica es utilizar un par de cebadores asimétricos para generar una gran cantidad de ADN monocatenario (ss-DNA). ). Estos dos tipos de cebadores se denominan cebadores restrictivos y cebadores no restrictivos, respectivamente; la proporción óptima es generalmente 1: 50 ~ 1: 100. La clave es limitar la cantidad absoluta de cebadores. Demasiados y muy pocos cebadores de restricción no favorecen la preparación de ADN ss. También puede utilizar la PCR ordinaria para preparar el ADN bicatenario del ADN objetivo (ADN-ds) y luego utilizar el ADN-ds como plantilla y utilizar solo uno de los cebadores sobrantes para preparar el ADN-ss mediante PCR con un solo cebador.

Debido a sus diferentes pesos moleculares, el ds-DNA y el ss-DNA generados se pueden separar mediante electroforesis para obtener ss-DNA puro.

La PCR asimétrica se utiliza principalmente para preparar ADN-ss para su secuenciación. En particular, la PCR asimétrica CD-Na es un buen método para estudiar los exones del ADN eucariótico.

6. PCR marcada (LP-PCR) y PCR en color.

La Lp-PCR (labeled primer PCR) utiliza isótopos, fluoresceína, etc. Etiquete el extremo 5' del cebador de PCR para detectar la presencia del gen de interés. En comparación con la PCR convencional, la LP-PCR es más intuitiva, omite pasos complejos como la digestión con endonucleasa de restricción y la hibridación molecular, y puede analizar múltiples componentes genéticos simultáneamente, lo que la hace particularmente adecuada para el diagnóstico genético de una gran cantidad de muestras clínicas. Actualmente, este método sólo puede identificar cualitativamente productos de PCR.

Color PCR (ensayo de complemento de color) se traduce literalmente como "detección de complementación de color" y es un tipo de LP-PCR. La traducción libre de la PCR en color es más específica: marca el extremo 5' del cebador con un tinte fluorescente. Los tintes fluorescentes Qiao y FAM son fluorescentes de color verde; TAMRA es fluorescente de color rojo; COUM es fluorescente de color azul. Diferentes cebadores marcados con fluorescencia participan en la reacción al mismo tiempo, y los genes diana amplificados llevarán respectivamente los tintes en el extremo 5' de los cebadores. Mediante electroforesis o precipitación centrífuga, a simple vista se puede determinar si el gen diana existe y el tipo de gen amplificado en función de diferentes colores de fluorescencia. Por lo general, solo se necesitan dos cebadores con diferentes colores, uno de los cuales se usa como cebador de detección de genes y el otro se usa como condición de control interno para diagnosticar la deleción de genes, la translocación cromosómica o la infección viral. Al detectar múltiples mutaciones puntuales, se pueden usar más colores, como enfermedades genéticas con múltiples mutaciones puntuales, varias infecciones virales sospechadas y el análisis del locus HLA puede detectar múltiples loci al mismo tiempo.

7. Añadir PCR.

Add-PCR es una PCR en la que se añaden secuencias de ADN al extremo 5’ del producto amplificado. Al diseñar cebadores para PCR final, además de la parte emparejada con la plantilla, se agregan varias bases para agregar fragmentos de ADN adicionales a los extremos del producto amplificado, como secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción o funciones específicas de fragmentos de ADN. Stoflet et al. informaron que el promotor del fago T7 se agrega antes del gen estructural, pero también puede usarse para marcar los extremos de fragmentos de ADN o introducir mutaciones puntuales específicas. El número de bases que se pueden agregar al final está relacionado con la longitud del cebador. Cuando el cebador es lo suficientemente largo, incluso se pueden agregar de diez a docenas de bases al producto o a los extremos de la amplificación.

8. PCR anclada o PCR fija.

La PCR (anchored PCR, A-PCR) se utiliza principalmente para analizar secuencias de ADN con extremos variables. Loh et al. utilizaron A-PCR para analizar la variabilidad del ARNm de la cadena alfa del receptor de células T en linfocitos de sangre periférica humana. Primero, se sintetiza el ADNc y se agrega una cola PolyG al final de su región variable 3' mediante la desoxinucleotidil transferasa terminal. Un cebador se coloca en la unión de la región constante y la región variable, como Loh, y el otro cebador es un cebador con una cola 5'-polyG. El cebador con cola PolyG es un punto fijo que puede unirse a la cola PolyG y solo reconocer el final del fragmento, independientemente de la secuencia de otras partes. Usando este método, se pueden detectar al menos 20 secuencias diferentes a partir del ARNm mencionado anteriormente, y cada secuencia es única, lo que indica que la A-PCR no está sesgada hacia ninguna secuencia específica y puede usarse para anticuerpos en células T, tumores, etc. Investigación genética.

9. PCR en portaobjetos

La PCR se puede realizar sobre diversos materiales que contienen placas de membrana en tubos de polipropileno, utilizando directamente frotis de tejido o secciones en portaobjetos de microscopio. El método de amplificación de ADN se llama PCR. (Diapositiva-PCR).

Figura 22-3 Diagrama esquemático del principio de la PCR anclada

Frotis de células o monocapa de células, y luego utilizar metanol/ácido acético (3:1, V/V), Carnoy solución, etanol absoluto o solución de paraformaldehído al 4% durante 5 a 15 minutos. Enjuagar con agua destilada, secar y utilizar directamente o almacenar a -20°C para su uso posterior. Dibuje 20 mm × 28 mm en el portaobjetos como área de reacción inmunohistoquímica. Agregue 30 l de mezcla de reacción de PCR, que contiene 100 mmol/l de tris pH 8,3, 50 mmol/l de KCl, 1,5 mmol/l de MgCl2, 200 mmol/l de DNTPS, 100 nmol/l de cebador y 0,01% (V/V). Luego cúbralo con un cubreobjetos de 22 mm × 40 mm y selle los bordes con aceite de parafina. Coloque el portaobjetos sobre el bloque metálico del termociclador de PCR para que el bloque metálico esté en máximo contacto con la muestra y realice de 30 a 40 ciclos como en un tubo de polipropileno. Para fragmentos amplificados más cortos, la temperatura de desnaturalización se puede reducir en ciclos posteriores. Una vez completada la reacción, coloque los portaobjetos enfriados en cloroformo para eliminar la mayor parte del aceite de parafina, pero no retire el cubreobjetos. Utilice unas pinzas afiladas para recoger suavemente una esquina del cubreobjetos. La solución de reacción de PCR en la esquina opuesta será un nivel de líquido en forma de media luna y lo recogerá con una pipeta. Generalmente, se pueden recuperar 25 µl de la mezcla y el producto de la reacción se puede volver a amplificar mediante electroforesis en agarosa o PCR estándar con cebadores de PCR anidados. Los amplicones del chip se pueden visualizar mediante hibridación in situ.

En Slide-PCR, se requiere 0,1% ~ 1% de BSA. Agregar BSA puede garantizar resultados de amplificación, pero la eficiencia no es necesariamente alta. La gelatina (al menos 0,0001%) es muy importante para amplificar el ADN objetivo de aproximadamente 1 kb. Sin embargo, tiene poco efecto sobre los resultados de amplificación de fragmentos pequeños. Para Slide-PCR son posibles diferentes métodos de extracción de muestras o métodos de fijación.

El mecanismo de Silde-PCR puede ser que una parte del ADN se eluya de las células durante el proceso de desnaturalización inicial, y luego se realiza la PCR en la fase acuosa de las células y del portaobjetos. La hibridación de sondas de ADN de todo el genoma humano marcadas con digoxigenina reveló que el ADN era extremadamente traza en los ciclos iniciales pero abundante después de 30 ciclos. La tinción celular de rutina reveló sólo cambios morfológicos menores.

Silde-PCR proporciona un mejor método para muestras de células en portaobjetos y no requiere bloquear estas muestras de los portaobjetos, lo que simplifica su funcionamiento y reduce la contaminación. Este método tiene valor práctico para cantidades muy pequeñas de muestras originales que necesitan ser rastreadas y preservadas (como frotis o frotis cervicales).

X. Reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa para detectar ARN

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) es una combinación de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT) y PCR y se puede utilizar. Facilita la detección de virus de ARN al detectar menos de 65,438+00 copias de ADN específico en una sola célula o en una pequeña cantidad de células. También proporciona un método extremadamente ventajoso y eficiente para obtener ADNc complementario a la amplificación de ARN específico.

La amplificación del ARN consta de dos pasos: ① Síntesis del ADNc de la cadena complementaria; transcripción del ARN bajo la mediación de un cebador único y catálisis mediante transcriptasa inversa; ② Después del calentamiento, el ADNc se disocia de la cadena del ARN y luego; recocido con otro cebador, la ADN polimerasa catalizó la extensión del cebador para generar ADN diana bicatenario y finalmente amplificó el ADN diana.

El paso clave de la RT-PCR es la transcripción inversa del ARN. Las condiciones de la PCR del ADNc son las mismas que las de la PCR general. Debido a la alta selectividad de los cebadores, el ARN total de las células se puede utilizar directamente para la PCR de ARN sin fraccionamiento. Sin embargo, la RT-PCR tiene requisitos muy estrictos para los productos de ARN. Las moléculas de ARN utilizadas como plantillas deben estar completas y libres de impurezas como ADN y proteínas. Incluso si el ARN contiene una cantidad muy pequeña de ADN, se producirá una amplificación no específica después de que la proteína no se purifique y la unión al ARN afectará la transcripción inversa y la ARNasa residual puede degradar fácilmente el ARN de membrana; El método de tiocianato de guanidina (GaSCN)-CsCl o el método de tiocianato de guanidina ácido-fenol-cloroformo se pueden utilizar para extraer productos de ARN ideales, especialmente este último método, que es adecuado para laboratorios generales.

Existen dos transcriptasas inversas de uso común, el virus del mieloblastoma aviar (AMV) y el virus de la leucemia murina de Moloney (Mo-MLV).

En general, Mo-MLV-RT se usa ampliamente, pero cuando la estructura secundaria del ARN molde afecta seriamente la transcripción inversa, se puede usar AMV-RT porque la temperatura óptima de este último es 72°C, que es más alta que Mo-MLV-RT. MLV-RT (37 ℃), la temperatura de reacción más alta ayuda a eliminar la estructura secundaria del ARN.

La amplificación en un solo paso se utiliza para detectar la expresión de ARNm de baja abundancia. Utilizando el mismo tampón, se agregaron transcriptasa inversa, cebadores, enzima Taq y cuatro dNTP al mismo sistema para la transcripción inversa directa del ARNm y la amplificación por PCR. Se descubrió que la enzima Taq no solo tiene la función de ADN polimerasa, sino que también tiene la actividad de transcriptasa inversa. Puede realizar directamente la transcripción inversa y la posterior amplificación por PCR utilizando ARNm como plantilla en el mismo sistema, simplificando así los pasos de la PCR. mRNA y convertir todo El tamaño de la muestra se reduce al mínimo, lo que es muy beneficioso para la detección de muestras clínicas pequeñas. La amplificación en un solo paso detecta ARNm de baja abundancia, menos de 65438 ± 0 ng en ARN total. Este método también se puede utilizar para construir bibliotecas de CD-NA y cD-NA específico de clon de ARNm de baja abundancia, y se puede combinar con la tecnología de secuenciación de la enzima Taq para permitir la transcripción inversa automática, la amplificación de genes y la secuenciación de la transcripción de genes en un solo tubo de ensayo. .

Recientemente, Sethus ha lanzado al mercado la transcriptasa inversa rTth con actividad ADN polimerasa, que ha favorecido enormemente el desarrollo del ARN. Para conocer el método de la transcriptasa inversa rTth, consulte la Sección 4.

XI. PCR cuantitativa

1. La cuantificación de ADN-PCR utiliza una sonda marcada con isótopos para hibridar con el producto de amplificación de PCR separado por electroforesis. El ADN molde se puede cuantificar en función de la intensidad de exposición negativa después de la autorradiografía. Abbot et al. utilizaron este método para estudiar cuantitativamente los retrogenes en la leucemia de células T humanas.

El producto de la amplificación por PCR se cuantifica con un fluorómetro especialmente diseñado para detectar ADN ds. El tinte H33258 se utiliza para unirse específicamente al ADN bicatenario y la fluorescencia se mejora 50 veces. La cantidad o el número de copias del ADN molde en la muestra se puede leer en la curva de volumen del producto de amplificación diluido de la serie de moldes estándar para lograr el propósito de la cuantificación por PCR.

El uso de múltiples plantillas de dilución para realizar una PCR de dilución en serie para encontrar el límite de detección más bajo (PCR-EB) para comparar también es un método de PCR semicuantitativo comúnmente utilizado.

2.Cuantificación de ARNm-PCR Debido a que la cuantificación de ARNm-PCR requiere dos enzimas (RT y Taq) para catalizarla, existen muchos factores que influyen. En 1989, Wang et al. publicaron un método de cuantificación absoluta para ARNm de baja abundancia. Utilizando ARNm de referencia interna con una concentración conocida y la misma secuencia que el ARNm-NA objetivo (las longitudes de sus fragmentos son diferentes para facilitar la separación de productos después de la amplificación por PCR), en el mismo sistema, use el mismo cebador marcado con 32P para la transcripción inversa. y amplificación por PCR. Después de someter a electroforesis los productos de amplificación, se miden respectivamente las intensidades radiactivas de los dos productos y se calcula la cantidad de ARNm específico para cada muestra a partir de la curva estándar preparada previamente. Los resultados de Gilliland et al. indican que se puede cuantificar menos de 1 pg de ARNm específico en 1 ng de ARN total. Este enfoque cuantitativo tiene implicaciones importantes en el estudio de tumores, trastornos metabólicos y regulación de la expresión genética.