¿Cómo eliminar las proteínas de la solución?
La sal diluida y la solución acuosa del sistema tampón tienen buena estabilidad y alta solubilidad para las proteínas, y son los disolventes más utilizados para la extracción de proteínas. La dosis habitual es 65.438+0-5 veces el volumen de la materia prima. Es necesario agitar uniformemente durante la extracción para facilitar la disolución de la proteína. La temperatura de extracción depende de la naturaleza del ingrediente activo. Por un lado, la solubilidad de la mayoría de las proteínas aumenta con la temperatura, por lo que la temperatura alta favorece la disolución y acorta el tiempo de extracción. Pero, por otro lado, la desnaturalización de las proteínas se inactiva con un aumento de temperatura. Por lo tanto, en base a esto, generalmente se utiliza baja temperatura (por debajo de 5 grados) para extraer proteínas y enzimas. Para evitar la degradación durante la extracción de proteínas, se pueden agregar inhibidores de proteasa (como fluorofosfato de diisopropilo, ácido yodoacético, etc.).
Lo siguiente se centra en la selección del valor de pH y la concentración de sal de la solución de extracción.
1. Valor de pH
Las proteínas y enzimas son electrolitos anfóteros y tienen puntos isoeléctricos. El valor de pH de la solución de extracción debe seleccionarse en ambos lados del punto isoeléctrico.
Dentro del alcance. Al extraer con ácido diluido o álcali diluido, es necesario evitar que los grupos disociables de la proteína cambien debido a un exceso de acidez o un exceso de base, lo que da como resultado cambios irreversibles en la conformación de la proteína. Generalmente, las proteínas básicas se extraen con extractos ligeramente ácidos y las proteínas ácidas se extraen con extractos ligeramente alcalinos.
2. Concentración de sal
La dilución y la concentración pueden favorecer la disolución de las proteínas, lo que se denomina disolución de la sal. Al mismo tiempo, dado que los iones de sal están unidos a proteínas, las soluciones salinas diluidas tienen la ventaja de proteger la proteína de la desnaturalización, por lo que se añade una pequeña cantidad de sal neutra como NaCl a la solución de extracción, generalmente 0,15 moles. Es aconsejable aumentar la concentración. Los tampones suelen utilizar soluciones isotónicas de fosfato y carbonato de 0,02 a 0,05 M.
(2) Método de extracción con disolventes orgánicos
Algunas proteínas y enzimas están fuertemente unidas a lípidos o tienen más cadenas laterales no polares en las moléculas, y son insolubles en agua y diluidas. sales. solución, ácido diluido o base diluida. Se pueden utilizar disolventes orgánicos como etanol, acetona y butanol. Tienen cierta hidrofilicidad y fuerte lipofilicidad, lo que las convierte en soluciones ideales para extraer lipoproteínas. Pero debe funcionar a bajas temperaturas. El método de extracción con butanol es particularmente beneficioso para extraer algunas proteínas y enzimas que están estrechamente unidas a los lípidos. En primer lugar, el butanol tiene una fuerte lipofilicidad, especialmente su capacidad para disolver fosfolípidos. En segundo lugar, el butanol es hidrófilo y no provocará desnaturalización ni inactivación de enzimas dentro del rango de solubilidad (6,6% a 10% y 40°C). Además, el método de extracción con butanol tiene un amplio rango de pH y temperatura y también es adecuado para materiales animales, vegetales y microbianos.
2. Separación y purificación de proteínas
Existen muchos métodos para la separación y purificación de proteínas, entre los que se incluyen principalmente:
(1) Métodos de separación basados en diferentes solubilidades de proteínas. .
1. Salación de proteínas
La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de las proteínas. Generalmente, en condiciones de baja concentración de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, aumenta la solubilidad de la proteína, lo que se denomina solubilidad de la sal. Cuando la concentración de sal continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita una tras otra. Este fenómeno se llama salazón. Cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, los iones de sal de alta concentración (como SO4 y NH4 del sulfato de amonio) tienen una fuerte fuerza de hidratación, que puede agarrar la capa de hidratación de las moléculas de proteína y "deshidratarlas". así las micelas de proteínas Condensación y precipitación. Durante la salazón, si el valor del pH de la solución está en el punto isoeléctrico de la proteína, el efecto será mejor. Debido a los diferentes tamaños de partículas y la hidrofilicidad de las distintas moléculas de proteínas, las concentraciones de sal necesarias para la salazón también son diferentes. Por lo tanto, ajustar la concentración de sal neutra en la solución de proteína mixta puede precipitar varias proteínas en etapas.
Los factores que influyen en el salado son: (1) Temperatura: Salvo las proteínas termosensibles que operan a bajas temperaturas (4 grados), generalmente se pueden realizar a temperatura ambiente. Generalmente, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas. Sin embargo, algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina) son menos solubles a temperaturas más altas (25 grados) que a 0 grados y es más probable que se salten. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas tienen la solubilidad más baja en soluciones salinas concentradas en su punto isoeléctrico. (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otras proteínas (* * * fenómeno de precipitación). Por lo tanto, antes de salar, el suero debe diluirse con una cantidad igual de solución salina fisiológica para que el contenido de proteína sea del 2,5 al 3,0%.
Las sales neutras comúnmente utilizadas en la salazón de proteínas incluyen principalmente sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio.
El sulfato de amonio más utilizado tiene las ventajas de un bajo coeficiente de temperatura y una alta solubilidad (la solución saturada a 25 °C es 4,1 M, o 767 g/L; la solubilidad saturada a 0 °C es 3,9 M). , o 676 g/L). Dentro de este rango de solubilidad, muchas proteínas y enzimas pueden salarse. Además, el efecto de eliminación progresiva de sal del sulfato de amonio es mejor que el de otras sales y es menos probable que provoque la desnaturalización de las proteínas. El pH de las soluciones de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo con ácido sulfúrico o amoníaco.
Después de separar la proteína mediante salazón y precipitación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método habitual es la diálisis, es decir, la solución de proteína se coloca en una bolsa para su análisis (comúnmente se usa celofán), se dializa con un tampón y el tampón se reemplaza constantemente. Debido a que la diálisis lleva mucho tiempo, es mejor realizarla a bajas temperaturas. Además, también se puede utilizar Glucosa Gel G-25 o G-50 para eliminar sales a través de la columna, lo que requiere menos tiempo.
2. Método de precipitación isoeléctrica
Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es mínima, por lo que la solubilidad es mínima. Varias proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos. La precipitación se puede lograr ajustando el valor del pH de la solución para alcanzar el punto isoeléctrico de la proteína, pero este método rara vez se usa solo y puede usarse en combinación con el método de sal.
3. Método de precipitación con disolventes orgánicos a baja temperatura
El uso de disolventes orgánicos miscibles en agua, como metanol, etanol o acetona, puede reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y precipitarlas. La resolución de este método es mayor que la del método de salazón, pero la proteína se desnaturaliza fácilmente y debe realizarse a baja temperatura.
(2) Diferentes métodos de separación según el tamaño de las moléculas de proteínas.
1. Diálisis y ultrafiltración
La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas de diferentes tamaños moleculares.
La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras pequeñas moléculas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas filtrantes con diferentes tamaños de poro para retener proteínas de diferentes pesos moleculares.
2. Filtración en gel
También conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, es uno de los métodos más eficaces para separar mezclas de proteínas en función del tamaño molecular. Los materiales de relleno más utilizados en las columnas son gel de glucosa (Sephadex
Ged) y gel de agarosa.
(3) Separar según las propiedades cargadas de las proteínas.
Las proteínas tienen diferentes propiedades de carga y cantidades de carga en diferentes entornos de pH, por lo que pueden separarse.
1. Electroforesis
Bajo las mismas condiciones de pH, se pueden separar varias proteínas debido a diferentes pesos y cargas moleculares y a diferente movilidad en el campo eléctrico. Cabe destacar la electroforesis por enfoque isoeléctrico, que utiliza un anfolito como portador. Durante la electroforesis, los anfolitos forman un gradiente de pH que aumenta gradualmente desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Cuando una proteína con una determinada carga nada en ella, la posición del pH en su punto isoeléctrico se detiene. Este método se puede utilizar para analizar y preparar una variedad de proteínas.
2. Cromatografía de intercambio iónico
Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE? font
LANG = " ZH-CN "> Celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de la capa de intercambio iónico. Durante el análisis en columna, se adsorben proteínas con cargas opuestas al intercambiador de iones. en el intercambiador de iones, y luego las proteínas adsorbidas se eluyen cambiando el pH o la fuerza iónica. (Consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles)
(4) Cromatografía de afinidad, un método de separación basado en la especificidad del ligando.
Cromatografía de afinidad
Cromatografía) es un método muy eficaz para separar proteínas. A menudo, solo se necesita un paso para separar una determinada proteína que se va a purificar de una mezcla de proteínas muy compleja, y la pureza es muy alta. Este método se basa en el hecho de que algunas proteínas pueden unirse específicamente a otra molécula llamada ligando, en lugar de a un ligando. El principio básico es que las proteínas existen como mezclas complejas en tejidos o células, y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes, por lo que las proteínas se separan y purifican.
La caracterización es una parte importante de la bioquímica.
Hasta el momento, no existe un método único o fácilmente disponible para extraer una proteína de una mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se utiliza una combinación de varios métodos.
División celular
1. Trituración de tejidos a alta velocidad: convierta el material en una pasta fina, colóquelo en un cilindro con un volumen de aproximadamente 1/3 y cierre la tapa del cilindro. Con fuerza, primero ajuste el regulador de velocidad a la posición más lenta, luego encienda el interruptor y acelere gradualmente hasta la velocidad requerida. Este método es adecuado para despojos de animales, semillas carnosas de plantas, etc.
2. Homogeneizar con un homogeneizador de vidrio: primero poner el tejido cortado en el tubo de ensayo, luego introducirlo en la varilla de molienda y triturarlo hacia adelante y hacia atrás, moviéndolo hacia arriba y hacia abajo para triturar las células. Este método tiene un mayor grado de destrucción celular que un triturador de tejidos de alta velocidad y es adecuado para pequeñas cantidades y órganos y tejidos animales.
3. Método de tratamiento ultrasónico: Trate la suspensión celular con ondas ultrasónicas de cierta potencia para hacer que las células vibren violentamente y se rompan. Este método funciona mejor con materiales microbianos. Escherichia coli prepara varias enzimas, eligiendo a menudo una concentración de 50-100 mg de bacterias/ml y una frecuencia de 1 kg a 10 kg. Las personas sensibles a los ultrasonidos y a los ácidos nucleicos deben utilizarlo con precaución.
4. Método de congelación y descongelación repetida: congelar las células por debajo de -20 grados y descongelar a temperatura ambiente, repetido varias veces. Debido a la formación de partículas de hielo en las células y al aumento de la concentración de sal en el líquido celular residual, estas se hinchan y destruyen la estructura celular.
5. Quimioterapia: Algunas células animales, como las células tumorales, pueden ser destruidas por membranas celulares como el dodecilsulfato de sodio (SDS) y el desoxicolato de sodio. Las paredes celulares bacterianas son más gruesas y pueden tratarse con lisozima. Mejor trato.
No importa qué método se utilice para romper tejidos y células, las proteínas intracelulares o las hidrolasas de ácido nucleico se liberarán en la solución, lo que provocará la biodegradación de macromoléculas y la reducción de productos naturales. La adición de fluorofosfato de diisopropilo (DFP) puede inhibir o ralentizar la autólisis. La adición de ácido yodoacético puede inhibir la actividad de las enzimas proteolíticas que requieren grupos hidrofóbicos en el centro activo. La adición de fluoruro de fenilsulfonilo (PMSF) también puede eliminar la actividad de los chips proteolíticos, pero no todos. Seleccionando el pH, la temperatura y la fuerza iónica, estas condiciones se pueden adaptar a la extracción de las sustancias objetivo.
Concentración, secado y conservación
1. Concentración de la muestra
Durante el proceso de preparación de macromoléculas biológicas, debido a la purificación en columna, la muestra queda muy diluida. y la identificación a menudo requiere concentración. Métodos de concentración habituales:
1. Reducción de presión, calentamiento, evaporación y concentración
Reducir el punto de ebullición del líquido reduciendo la presión superficial. Cuanto mayor es el grado de descompresión al vacío, menor es el punto de ebullición del líquido y más rápido se evapora. Este método es adecuado para la concentración de determinadas macromoléculas biológicas térmicamente inestables.
2. Concentración de evaporación del flujo de aire
El flujo de aire puede acelerar la evaporación del líquido, haciendo que se extienda en una fina capa de solución, con la superficie pasando constantemente por el aire. flujo o macromoléculas biológicas La solución se coloca en una bolsa de diálisis y se coloca en una habitación fría. Utilice un ventilador eléctrico para soplar la solución para que el disolvente fuera de la membrana permeable no se evapore, logrando así el propósito de concentración. Este método tiene una velocidad de concentración lenta y no es adecuado para concentrar una gran cantidad de solución.
3. Método de coagulación
Las macromoléculas biológicas forman hielo a bajas temperaturas. Las sales y las macromoléculas biológicas no entran en el hielo, sino que permanecen en fase líquida. Durante la operación, la solución a concentrar se enfría hasta convertirla en un sólido y luego se funde lentamente, utilizando la diferencia en los puntos de fusión del disolvente y el soluto para eliminar la mayor parte del disolvente. Por ejemplo, cuando se concentra una solución salina de proteínas y enzimas con este método, los cristales de hielo puros sin proteínas ni enzimas flotan en la superficie del líquido, mientras que las proteínas y enzimas se concentran en la solución inferior. obtener una solución concentrada de proteínas y enzimas.
4. Método de absorción
Las moléculas de la solución son eliminadas directamente por el absorbente y concentradas. El absorbente utilizado no debe reaccionar químicamente con la solución, no adsorber macromoléculas biológicas y ser fácil de separar de la solución. Los adsorbentes de uso común incluyen polietilenglicol, polivinilpirrolidona, sacarosa, gel, etc. Cuando utilice un absorbente de polietilenglicol, primero debe colocar la solución de macromolécula biológica en una bolsa con una membrana semipermeable y luego cubrirla con polietilenglicol de 4 grados. El polietilenglicol absorberá rápidamente el disolvente de la bolsa. reemplazado por uno nuevo después de saturarlo con agua hasta alcanzar el volumen requerido.
5. Método de ultrafiltración
La ultrafiltración es un método que utiliza una membrana especial para filtrar selectivamente varias moléculas de soluto en una solución. Cuando ningún líquido atraviesa la membrana bajo una determinada presión (presión de nitrógeno o presión de bomba de vacío), los disolventes y las moléculas pequeñas penetran, y las moléculas grandes quedan bloqueadas y no pueden quedar atrapadas.
Este es un nuevo método desarrollado en los últimos años. Es más adecuado para la concentración o desalinización de macromoléculas biológicas, especialmente proteínas y enzimas. Tiene las ventajas de bajo costo, fácil operación, condiciones suaves, buena retención de actividad de las macromoléculas biológicas y. alta tasa de recuperación. La clave para las aplicaciones de ultrafiltración es la selección de membranas. Los diferentes tipos y especificaciones de membranas tienen diferentes parámetros, como el caudal de agua y el valor de corte del peso molecular (es decir, el peso molecular mínimo de las moléculas que la membrana puede interceptar en circunstancias normales), que deben seleccionarse según las necesidades del trabajo. Además, la forma del dispositivo de ultrafiltración, la composición y propiedades del soluto y la concentración de la solución tienen un cierto impacto en el efecto de ultrafiltración. Diablo
Valor de corte de peso molecular de la membrana de ultrafiltración:
Nombre de la membrana Valor de corte de peso molecular Tamaño de poro promedio grande
XM-30030000140
XM-200100, 00055
XM-5050, 00030
PM-30 30, 00022
UM-2020, 00018
PM -1010, 00015
UM-21, 00012
UM05500 10
El tubo de fibra hueca está hecho de la membrana de ultrafiltración anterior y muchos de estos tubos están agregados. Los dos extremos del tubo están conectados a un amortiguador de baja fuerza iónica para que el amortiguador fluya continuamente dentro del tubo. Luego se sumerge el tubo de fibra en la solución de proteínas que se va a dializar. A medida que el amortiguador fluye a través del tubo de fibra, las moléculas pequeñas se difunden fácilmente a través de la membrana, mientras que las moléculas más grandes no. Este es el método de análisis de filtración de fibra, que acorta el tiempo de diálisis 10 veces debido al aumento del área de diálisis.
En segundo lugar, el secado
Para evitar el deterioro y facilitar el almacenamiento, los productos preparados a partir de macromoléculas biológicas a menudo necesitan secarse. Los métodos más utilizados son la liofilización y el secado al vacío. El secado al vacío es adecuado para secar y conservar sustancias que no son resistentes a las altas temperaturas y se oxidan fácilmente. Todo el dispositivo incluye un secador, un condensador y un principio de secado al vacío, al tiempo que aumenta el coeficiente de temperatura. Bajo la misma presión, la presión del vapor de agua disminuye a medida que disminuye la temperatura, por lo que a bajas temperaturas y bajas presiones, el hielo puede sublimar fácilmente hasta convertirse en gas. En funcionamiento, el líquido que se va a secar generalmente se congela por debajo del punto de congelación para volverlo sólido, y luego el disolvente se convierte en gas y se elimina a baja temperatura y baja presión. Los productos secados mediante este método tienen las ventajas de soltura, buena solubilidad y estructura natural, y son adecuados para el secado y conservación de diversas macromoléculas biológicas.
En tercer lugar, el almacenamiento
La estabilidad de las macromoléculas biológicas está estrechamente relacionada con el método de almacenamiento. El producto seco es generalmente relativamente estable y su actividad no cambiará significativamente a bajas temperaturas durante varios días o incluso años. Los requisitos de almacenamiento son muy simples. Simplemente selle la muestra seca en un desecador (con desecante en el interior) y guárdela en el refrigerador a 0-4 grados. Al almacenar en forma líquida, se deben tener en cuenta los siguientes puntos.
1. La muestra no puede estar demasiado diluida y debe concentrarse hasta una determinada concentración antes de poder envasarse y almacenarse. Las muestras demasiado diluidas pueden desnaturalizar fácilmente las macromoléculas biológicas.
2. Generalmente es necesario añadir conservantes y estabilizantes. Los conservantes más utilizados incluyen tolueno, ácido benzoico, cloroformo, timol, etc. Los estabilizadores comúnmente utilizados para proteínas y enzimas incluyen pasta de sulfato de amonio, sacarosa, glicerol, etc. Por ejemplo, las enzimas también pueden agregar sustratos y coenzimas para mejorar la estabilidad. Además, soluciones como el calcio, el zinc y el ácido bórico también tienen cierto efecto protector sobre determinadas enzimas. Las macromoléculas de ácido nucleico generalmente se almacenan en soluciones tampón estándar de cloruro de sodio o citrato de sodio.
3. Los requisitos de temperatura de almacenamiento son bajos. La mayoría se almacenan en el frigorífico a unos 0 grados, y algunos son más bajos, dependiendo de las diferentes sustancias.