Cómo detectar la expresión de genes extraños en plantas
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Identificación del nivel de transcripción de genes extraños
La expresión génica se puede dividir en dos etapas: transcripción y traducción. La transcripción es el proceso de producir ARNm utilizando ADN (gen) como plantilla, y la traducción es el proceso de producción de proteínas utilizando ARNm como plantilla. Detectar la expresión de genes extraños es detectar la producción de ARNm específico y proteínas específicas. Por tanto, la detección de la expresión génica se divide en dos niveles: la detección de ARNm específico a nivel de transcripción y la detección de proteínas específicas a nivel de traducción. El método principal para la detección del nivel de transcripción es la hibridación Northern, que utiliza ADN o ARN como sonda para detectar cadenas de ARN. Al igual que la hibridación Southern, la hibridación Northern también incluye la hibridación por puntos y la hibridación por transferencia.
RT-PCR (PCR con transcripción inversa) también se puede utilizar para detectar la transcripción y expresión de ADN exógeno en plantas. El principio es utilizar ARN total o ARNm de la planta como plantilla para la transcripción inversa y luego amplificarlo mediante PCR. Si se obtiene una banda de amplificación de ADNc específica del extracto de ARN total de la célula, indica que se ha transcrito el gen extraño. Este método es simple y rápido, pero la determinación final de la transcripción de genes extraños debe combinarse con los resultados experimentales de la hibridación Northern.
Detección de proteínas expresadas por genes extraños
Existen tres métodos para detectar proteínas expresadas: ① método de detección de reacción bioquímica: principalmente mediante reacción enzimática ② método de detección inmunológica: utilizando la proteína objetivo; (Se detecta la combinación específica de antígeno) y su anticuerpo. Los métodos específicos incluyen hibridación de proteínas, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, inmunoprecipitación, etc. ③ Detección de actividad biológica.
La hibridación occidental consiste en inmovilizar el antígeno separado mediante gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) sobre un soporte sólido (como membrana de nitrocelulosa, membrana NC). Las proteínas de diferentes pesos moleculares tienen diferentes movilidades en geles, lo que puede usarse para determinar la presencia y abundancia relativa de antígenos específicos, o si la proteína ha sido degradada. Después de la electroforesis de proteínas, transfiérala a una membrana NC, colóquela en una solución de proteína (como albúmina sérica bovina BSA) o de leche en polvo, incube para bloquear sitios no específicos y luego hibride con anticuerpos específicos que contengan marcadores radioactivos o marcadores enzimáticos, y el antígeno el anticuerpo se une y luego utiliza la autorradiografía radiactiva o la observación cromogénica.
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