Cómo realizar un cultivo de tejidos
1. Preparación del medio de cultivo
Hay dos formas de preparar el medio de cultivo. Una es comprar todos los productos químicos en el medio de cultivo y prepararlos según sea necesario; compre una mezcla de productos básicos en polvo de un buen medio de cultivo, como MS, B5, etc.
Prepararlo usted mismo puede ahorrar costos, pero desperdicia tiempo y mano de obra y, a veces, causa problemas. experimentos debido a problemas de calidad de los medicamentos en la actualidad, a juzgar por la situación, la mayoría de ellos se preparan por sí mismos. Por razones de conveniencia, el proceso principal de preparación del medio de cultivo se introducirá utilizando el medio de cultivo MS como ejemplo.
1. Preparar varias soluciones madre
1. Preparación de la solución madre de macroelementos MS
Generalmente, el macroelemento se prepara en una solución madre 100 veces mayor y luego se diluye 100 veces cuando se usa.
Pesar por separado
NH4NO3 165 g KH2PO4 17 g
KNO3 190 g CaCl2·2H2O 44 g
MgSO4·7H2O 37 g
Convierta cada uno en 1 litro de solución madre, viértalo en una botella de reactivo de 1 litro y guárdelo. En el frigorífico.
2. Preparación del licor madre de oligoelementos MS
Generalmente, los oligoelementos se preparan en un licor madre 100 veces mayor.
Péselos en secuencia
KI 0,083 g Na2MoO4· 2H2O 0,025g
H3BO3 0,62g CuSO4·5H2O 0,0025g
MnSO4·H2O 1,69g CoCl2·6H2O 0,0025g
ZnSO4·7H2O 0,86g
Preparado Vierta 1 litro de licor madre en una botella de reactivo de 1 litro y guárdelo en el frigorífico.
Dado que las cantidades de pesaje de CuSO4·5H2O y CoCl2·6H2O son muy pequeñas, si la precisión de la balanza no llega a la diezmilésima, puedes prepararlos primero Pesar por separado
CuSO4·5H2O 0,05g CoCl2·6H2O 0,05g
para preparar 100ml de solución de ajuste, y luego tomar 5ml. También existe una cantidad de 0,0025g.
3. Preparación de licor madre orgánico MS
Generalmente prepare 100 veces licor madre orgánico MS.
Pesar en secuencia
10 g de mioinositol y clorhidrato de tiamina (VB1) 0,01 g
Niacina 0,05 g Glicina 0,2 g
Clorhidrato de piridoxina (VB6) 0,05 g
Prepare 1 litro de solución madre, viértalo en una botella de reactivo de 1 litro y guárdelo en el refrigerador.
4. Prepare licor madre de sal de hierro MS
Generalmente prepare 100 veces el licor madre de sal de hierro MS.
Pesar en secuencia
EDTA disódico 3,73 g FeSO4 · 7H2O2,78 g
Prepare 1 litro de licor madre, viértalo en una botella de reactivo de 1 litro y guárdelo en el refrigerador.
Entonces, el licor madre MS tiene 5 tipos de licor madre de macroelementos, además de oligoelementos MS. licor madre y licor madre orgánico MS y licor madre de sal de hierro MS, ***8 tipos de licor madre.
Preparación del licor madre hormonal
Varias auxinas y citoquininas deben prepararse por separado y no se pueden mezclar entre sí, generalmente deben disolverse primero con una pequeña cantidad de alcohol al 95% o 1 equivalente de NaOH. Por lo general, las citoquininas deben disolverse primero con 1 equivalente de ácido clorhídrico y luego agregarse con agua destilada. volumen Generalmente se toman 100 mg para hacer 100 ml de solución madre.
2. Preparación del medio de cultivo
Tome como ejemplo la preparación de 1 litro de medio de cultivo MS y realice las siguientes operaciones en orden:
1. Primero pon un poco de agua destilada en el vaso.
2. Tome 10 ml de las ocho licores madre anteriores y viértalos.
3. Generalmente pesa 30 g de sacarosa y viértelo, revuelve para disolver.
4. Añade agua destilada y utiliza una probeta graduada para disolver hasta 1 litro.
5. Agregue varias hormonas de acuerdo con el plan diseñado, dado que la dosis de hormonas es muy pequeña y las hormonas son cruciales para el crecimiento de las plantas de cultivo de tejidos, es mejor usar una pipeta microajustable para absorberlas si es posible y reducir los errores. p>
6． Use papel de prueba de precisión o un acidómetro para ajustar el pH a 5,7-5,8 (use un acidómetro si es posible, que es más preciso). Puede mezclar 1 equivalente de HCL y 1 equivalente de N.
se utiliza aOH para ajustar el valor de pH de la solución.
Preparación de 1 equivalente de HCL: Utilice una probeta graduada para medir 8,3 ml para obtener 100 ml de solución.
Preparación de 1 equivalente de NaOH: Pese 4 g de NaOH para obtener 100 ml de solución.
7. Pesar unos 5 g de agar en polvo (agar en polvo de buena calidad), verterlo en la solución preparada anteriormente y calentarlo en una estufa eléctrica hasta que hierva hasta que el agar en polvo se derrita.
8. Después de enfriar un poco, colóquelo en recipientes de cultivo descubiertos. Los recipientes de cultivo descubiertos deben sellarse con una película selladora o papel kraft y atarse firmemente con bandas elásticas o cuerdas.
9. Colóquelo en la olla de esterilización para esterilizarlo y esterilícelo durante unos 20 minutos.
10. Después de la esterilización, saque el medio de cultivo del recipiente de esterilización y colóquelo sobre la mesa experimental para que se enfríe y solidifique.
2. Esterilización
La esterilización es una de las tareas importantes de cultivo de tejidos 1. Los principiantes deben tener claras las categorías de bacterias y esterilidad. La categoría de bacterias es: todos los objetos expuestos al aire y los objetos que entran en contacto con fuentes naturales de agua, al menos en sus superficies, son bacterias. Desde este punto de vista, la esterilidad: lugares no tratados como habitaciones, la superficie de una mesa limpia, medios de cultivo simplemente hervidos, los cuchillos y tijeras que utilizamos antes de procesarlos, toda la apariencia de nuestro cuerpo y la superficie interior conectada con el mundo exterior. , como todo el tracto digestivo y el tracto respiratorio, es decir, el gas que exhalamos y los recipientes de cultivo están llenos de bacterias sin importar cuán limpios estén.
Las bacterias a las que se hace referencia aquí incluyen bacterias, hongos, actinomicetos, algas y otros microorganismos. Las características de las bacterias son: extremadamente pequeñas, invisibles a simple vista, están presentes en todo momento y son omnipresentes. Tiene una gran resistencia en condiciones naturales, requiere condiciones de vida simples y. tiene una fecundidad extremadamente fuerte y puede reproducirse en grandes cantidades cuando las condiciones son adecuadas.
El alcance de la esterilidad es: objetos que han sido quemados a altas temperaturas o cocinados durante un cierto período de tiempo, objetos que han sido quemados a altas temperaturas o cocinados durante un cierto período de tiempo. tratados con otros métodos de esterilización físicos o químicos (por supuesto, estos métodos deben haber demostrado ser efectivos), la atmósfera superior, el interior de las rocas, el interior de los tejidos de animales y plantas sanos que no están en contacto con el exterior, la superficie y en el interior los ácidos y álcalis fuertes, los esterilizantes de elementos químicos, etc. son todos estériles. De lo anterior se puede ver que el mundo estéril en la superficie de la tierra es estéril que el mundo con gérmenes es mucho más pequeño.
La esterilización se refiere al uso de métodos físicos o químicos para matar todos los microorganismos u organismos en la superficie y en los poros de los objetos, es decir, matar todas las sustancias vivas. Un concepto relacionado es la desinfección, que se refiere a matar. , eliminando o inhibiendo completamente algunos microorganismos para que ya no tengan efectos nocivos. Obviamente, después de la desinfección, muchas esporas bacterianas, clamidosporas de moho, etc. no desaparecerán por completo, es decir, debido a que todavía quedan microorganismos vivos en los desinfectados. ambiente y en los objetos, de modo que el espacio de operación estrictamente esterilizado (inoculación, mesa limpia, etc.) y los utensilios utilizados, así como la ropa y las manos del operador, no contengan microorganismos vivos. Las operaciones realizadas en tales condiciones se denominan asépticas. operaciones.
Los requisitos de condiciones asépticas para el cultivo de tejidos vegetales son muy estrictos, superando incluso los requisitos para el cultivo microbiano. Esto se debe a que el medio de cultivo contiene ricos. Si no se tiene cuidado, se puede provocar contaminación con otros. bacterias para lograr el propósito de una esterilización completa, debe adoptar diferentes métodos de esterilización efectivos según los diferentes objetos para garantizar que no se vean afectados por diversas bacterias durante el cultivo y que las plántulas del tubo de ensayo puedan crecer normalmente.
Los métodos de esterilización comúnmente utilizados se pueden dividir en dos categorías: físicos y químicos, a saber: métodos físicos como calor seco (hornear y quemar), calor húmedo (presión normal o cocción a alta presión), medidas como el tratamiento con radiación (ultravioleta, ultrasonidos). , microondas), filtración, limpieza y grandes cantidades de agua esterilizada. Los métodos químicos incluyen el uso de cloruro de mercurio, formaldehído, peróxido de hidrógeno, permanganato de potasio, lisol, polvo blanqueador, hipoclorito de sodio, antibióticos y tratamiento químico con alcohol. ser seleccionados adecuadamente según los diferentes materiales y propósitos de la obra.
1. El medio de cultivo se esteriliza mediante calor húmedo
El medio de cultivo se esteriliza dentro de las 24 horas posteriores a la preparación. El principio de la esterilización a alta presión es: en un vaporizador cerrado, el vapor no puede escapar y la presión continúa aumentando. , lo que hace que el punto de ebullición del agua aumente continuamente y, por lo tanto, la temperatura en la olla también aumente. Bajo la presión de 0,1 MPa, la temperatura en la olla alcanza los 121 ° C. A esta temperatura del vapor, varias bacterias y su alto calor. la resistencia puede matar las esporas rápidamente.
Tenga cuidado de eliminar completamente el aire en la olla, de modo que toda la olla se llene de vapor de agua, para que la esterilización pueda ser completa. Existen varios métodos diferentes de. Esterilización y desinflado a alta presión, pero el propósito es eliminar el aire, calentar uniformemente la olla para garantizar una esterilización completa. El método común es: cerrar la válvula de ventilación, después de encenderla, cuando la presión aumente a 0,05 MPa, ábrala. la válvula de ventilación para liberar el aire, espere hasta que el manómetro
Después de que el puntero vuelva a cero, cierre la válvula de purga.
Después de cerrar la válvula y encender la alimentación nuevamente, cuando el manómetro suba a 0,1 MPa, comience a cronometrar y mantenga la presión en 0,1-0,15 MPa. durante 20 minutos.
<3. Vacunación
Dado que hay un proceso abierto durante la vacunación, es un período extremadamente propenso a la contaminación. Este período es principalmente. causado por bacterias en el aire y el propio personal. La sala de vacunación debe desinfectarse estrictamente. El equipo, las paredes, los pisos, etc. deben limpiarse periódicamente con una solución de permanganato de potasio al 1% -3% además de esterilizarse. Con rayos ultravioleta y formaldehído antes de su uso, también se puede usar antes de su uso. Durante este período, use alcohol al 70% o spray Lysol al 3% para depositar las partículas de polvo en el aire. Se pueden realizar operaciones asépticas de acuerdo con los siguientes pasos: /p>
1. Fumigue la sala de inoculación con formaldehído 4 horas antes de la inoculación y encienda la lámpara ultravioleta del interior para la esterilización;
2. 20 minutos antes de la inoculación, encender el ventilador de la mesa de trabajo ultralimpia y la lámpara ultravioleta de la mesa;
3. El vacunador debe primero lavarse las manos, ponerse una bata de laboratorio especial, zapatillas, etc. en la sala de seguridad;
4. Después de subirse al banco de trabajo, límpiese las manos con bolas de algodón con alcohol, especialmente las uñas. Luego limpie el banco de trabajo;
5. Primero limpie la herramienta de inoculación con una bola de algodón con alcohol, luego frote las pinzas y las tijeras de principio a fin y luego frote repetidamente la punta para secar la placa de Petri;
6. Durante la vacunación, el vacunador no puede levantar las manos del banco de trabajo, ni hablar, moverse ni toser;
7. Una vez finalizada la inoculación, se debe limpiar la mesa de trabajo y esterilizarla con luz ultravioleta durante 30 minutos. Si se continúa con la inoculación, se debe realizar una esterilización intensiva cada 5 días.
La inoculación consiste en retirar las raíces esterilizadas, tallos y hojas. El proceso de cortar o recortar órganos aislados en pequeños segmentos o trozos y colocarlos en un medio de cultivo. Los procedimientos antes y después de la inoculación se presentan ahora de manera coherente.
Pasos de inoculación aséptica:
1. Coloque los materiales previamente lavados y cortados en un vaso de precipitados, llévelo a la mesa ultralimpia, esterilícelo con desinfectante, enjuáguelo con agua esterilizada, escurra el agua, sáquelo y colóquelo sobre una gasa o papel de filtro esterilizado.
2. Después de que el material se haya secado, use pinzas en una mano y tijeras o bisturí en la otra para cortar el material adecuadamente. Por ejemplo, las hojas deben cortarse en trozos pequeños de 0,5 cm cuadrados y el tallo debe cortarse en secciones pequeñas que contengan una. nodo. Las puntas del microtallo deben pelarse en pedazos del tamaño de la punta del tallo que contengan 1-2 hojas tiernas, etc. Durante el proceso de inoculación, el equipo de inoculación debe quemarse con frecuencia para evitar la contaminación cruzada.
3. Utilice instrumentos quemados y esterilizados para insertar o colocar los explantes cortados en el medio de cultivo. El proceso de operación específico (tomando los tubos de ensayo como ejemplo) es: primero desate el papel de regalo, sostenga el tubo de ensayo casi horizontalmente y coloque el tubo de ensayo. la boca cerca de la llama de la lámpara de alcohol y gire la boca del tubo sobre la llama para quemar el interior y el exterior de la boca del tubo durante unos segundos. Si usa un tapón de algodón para cubrir la boca, Primero puede quemar el exterior de la boca del tubo, quitar el tapón de algodón y luego quemar el interior de la boca del tubo. Luego use unas pinzas para recoger un trozo de explante cortado y colocarlo en el tubo de ensayo. insértelo suavemente en el medio de cultivo. Si las hojas están unidas directamente al medio de cultivo, es apropiado colocar de 1 a 3 piezas. En cuanto al método de colocación del material, excepto la punta del tallo, la sección del tallo debe colocarse en posición vertical (punta). arriba), no hay requisitos uniformes para otras cosas. Después de la inoculación, queme la boca del tubo en la llama durante unos segundos. Después de tapar, envuelva la boca con papel de regalo. también sobrecalentarse.
4. Cultivo
Cultivo significa colocar los materiales de cultivo en una sala de cultivo (con condiciones de luz, temperatura y esterilidad) para permitirles crecer, dividirse y proceso de diferenciación para formar callos o una mayor diferenciación en plantas regeneradas.
1. Métodos de cultivo
1. El método de cultivo sólido
es un método de cultivo de materiales vegetales utilizando un medio solidificado de agar. Es el método más utilizado en la actualidad. Aunque este método tiene un equipo simple y es fácil de implementar, la distribución de nutrientes es desigual y. la tasa de crecimiento es desigual y a menudo se produce envenenamiento por pardeamiento.
2. Método de cultivo líquido
El método de cultivo líquido es un método para cultivar materiales vegetales en un medio líquido sin agente de curado. Dado que el contenido de oxígeno en el líquido es bajo, generalmente es necesario asegurar el suministro de oxígeno mediante agitación. o hacer vibrar el medio de cultivo, utilice un agitador alternativo o un agitador giratorio para el cultivo, y la velocidad es generalmente de 50-100 r/min. Este método de inmersión regular no solo puede hacer que el medio de cultivo sea uniforme, sino que también garantiza el suministro de oxígeno. .
2. nutrir
Pasos
1. Cultivo primario
El cultivo primario tiene como objetivo la obtención de materiales estériles y líneas de propagación asexuales, es decir, las primeras generaciones de cultivo tras la inoculación de determinados explantes. En el cultivo primario se utilizan habitualmente medios de inducción o diferenciación. , cultivo La base contiene más citoquininas y una pequeña cantidad de auxinas. Las líneas de propagación asexual establecidas en el cultivo primario incluyen: puntas de tallo, racimos de yemas, cuerpos embrioides y protocormos. Según la dirección de desarrollo en el cultivo primario, puede ser. dividido en:
1) Desarrollo de yemas terminales y yemas axilares
El uso de citoquininas exógenas puede promover el crecimiento de yemas laterales latentes con yemas terminales o sin yemas axilares, formando así una polígono en miniatura. Una pequeña estructura parecida a un arbusto con muchas ramas y brotes. En unos pocos meses, una rama de este grupo de plántulas puede transferirse a otra generación, el cultivo de proliferación de brotes puede repetirse y la mayoría de los tallos jóvenes. Luego, una parte de los tallos jóvenes se puede transferir al medio de enraizamiento, se puede obtener una planta completa que se puede plantar en el suelo. Algunas plantas leñosas y algunas plantas herbáceas también se pueden regenerar y propagar en este. manera, como rosas, camelias, crisantemos, claveles, etc. etc. Este método de reproducción también se llama micropropagación. No se regenera mediante la formación de callos, por lo que es el mejor método de reproducción para permitir la descendencia clonada. para mantener la variedad original.
Adecuado para este tipo de regeneración. Para plantas propagadas, al tomar muestras solo se pueden utilizar yemas terminales, yemas laterales o esquejes de tallo con yemas. Otras ramas, como ramas después de la germinación de las semillas. , también se puede utilizar.
El cultivo de la punta del tallo se puede considerar como un método relativamente especial que utiliza el meristemo del ápice del brote de yemas terminales extremadamente jóvenes como explantes para la inoculación de algunos tejidos. incluido el meristemo del ápice del brote se utilizan para el cultivo, lo que facilita el funcionamiento y la supervivencia.
Los cultivos obtenidos mediante el cultivo de yemas fijas generalmente tienen nudos de tallo más largos y puntas de tallo erguidas hacia arriba. Se utiliza principalmente el método de corte de segmento de tallo, como incienso, petunias, crisantemos, etc. Pero en circunstancias especiales, también se producirán yemas adventicias para formar racimos de yemas.
2) El desarrollo de brotes adventicios. yemas
En cultivo, las yemas adventicias se forman a partir de explantes. Para producir yemas adventicias, las células generalmente primero se desdiferencian para formar callos y luego, después de la rediferenciación, se forman primordios orgánicos a partir de estos meristemas, que muestran polos unidireccionales en la superficie. eje longitudinal del órgano (Este es diferente del cuerpo embrioide). En la mayoría de los casos, forma yemas y luego raíces.
Otra forma es producir yemas adventicias directamente a partir de órganos. de crecer a partir de varios órganos. La capacidad de las yemas adventicias como petunia, flox, rubus, etc. Cuando se cultiva in vitro, el medio proporciona nutrientes, especialmente un suministro continuo de hormonas vegetales, de modo que las plantas tienen la capacidad de formar yemas adventicias. están muy estimulados. La superficie de muchos tipos de explantes está cubierta casi en su totalidad por yemas adventicias. Muchas especies que no pueden propagarse asexualmente mediante métodos convencionales pueden producir yemas adventicias y regenerarse fácilmente en condiciones de tubo de ensayo, como Cupressaceae, Pinaceae, Ginkgo y. algunas otras plantas. Los órganos de almacenamiento de muchas plantas monocotiledóneas pueden producir fuertemente brotes adventicios. Los bulbos adventicios se pueden formar en grandes cantidades cortando escamas de lirio.
También se usa comúnmente cuando se cultivan brotes adventicios. medio se utilizan generalmente para la propagación cultivos obtenidos mediante el cultivo de yemas adventicias, como gerberas, fresas, etc.
3) La aparición y desarrollo de cuerpos embrioides somáticos
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4) Explantes cultivados primarios Pardeamiento
Pardeamiento. de explantes se refiere al fenómeno de que la superficie de los explantes comienza a oscurecerse después de la inoculación, provocando en ocasiones incluso que todo el medio de cultivo se dore. Ocurre debido a que los polifenoles en los tejidos vegetales se activan, provocando cambios en el metabolismo celular. Durante el proceso se producen quinonas, que en su mayoría son de color marrón. Cuando se difunden en el medio de cultivo, inhiben la actividad de otras enzimas, afectando así el cultivo de los explantes expuestos.
Las principales razones del oscurecimiento son las siguientes:
a. La investigación sobre variedades de plantas muestra que el fenómeno de oscurecimiento es diferente entre las diferentes variedades debido a que existen diferencias en la actividad de la fenoloxidasa. Por lo tanto, es más probable que los explantes de algunas variedades de flores se doren después de la inoculación. mientras que los explantes de algunas variedades de flores no se doran fácilmente después de la inoculación, debe haber algunas diferencias durante el proceso de cultivo. Seleccione y procese diferentes variedades por separado.
>b. Estado fisiológico Debido a los diferentes estados fisiológicos de los explantes, el grado de pardeamiento después de la inoculación también es diferente. En general, el grado de pardeamiento de los materiales vegetales en la etapa joven es superficial, mientras que los explantes se cosechan de plantas adultas. Contiene más quinonas, por lo que el pardeamiento es más grave. En términos generales, el grado de pardeamiento de los tejidos jóvenes después de la inoculación no es obvio, mientras que el grado de pardeamiento de los tejidos maduros es más grave después de la inoculación. Concentraciones demasiado altas de sales inorgánicas en el medio de cultivo aumentarán el grado de oscurecimiento de algunas plantas ornamentales. Además, niveles demasiado altos de citoquininas también estimularán el crecimiento de algunos explantes. La actividad de la fenol oxidasa intensificará el fenómeno de oscurecimiento.
d. Las condiciones de cultivo inadecuadas, como una luz demasiado intensa, una temperatura demasiado alta, un tiempo de cultivo demasiado prolongado, etc., pueden aumentar la actividad de la polifenol oxidasa, acelerando así el grado de oscurecimiento de los explantes cultivados. .
Para mejorar la tasa de plántulas del cultivo de tejidos, se debe controlar el fenómeno de pardeamiento de los explantes. Se pueden utilizar las siguientes medidas para prevenir y reducir la aparición del fenómeno.
1. Seleccione los explantes adecuados. En términos generales, es mejor elegir explantes que crezcan vigorosamente, lo que puede reducir significativamente el fenómeno del oscurecimiento.
2. Las condiciones de cultivo adecuadas, incluida la composición de sales inorgánicas, los niveles de sustancias de crecimiento de las plantas, la temperatura adecuada y el subcultivo oportuno, pueden reducir el fenómeno de oscurecimiento de los materiales.
3. Uso de antioxidantes En el medio de cultivo, el uso de antioxidantes como la cisteína y el ácido ascórbico puede evitar o reducir de manera más efectiva el fenómeno de pardeamiento de muchos explantes. Además, el uso de 0,1% -0,5% de carbón activado también es más efectivo. en la prevención del oscurecimiento.
4. Para la transferencia continua, los materiales que son propensos a oscurecerse se pueden cultivar durante 2 a 24 horas antes de transferirlos a un nuevo medio de cultivo. De esta manera, después de 7 a 10 días de tratamiento continuo, el fenómeno de oscurecimiento se controlará o reducirá considerablemente.
(2) Subcultivo
El número de yemas, plántulas, cuerpos embrioides y protocormos obtenidos a partir del cultivo primario no es suficiente y es necesario multiplicarlos aún más. hay cada vez más, aprovechando así al máximo la ventaja de una reproducción rápida.
El cultivo posterior es un proceso de cultivo de expansión de varias generaciones que sigue al cultivo inicial y tiene como objetivo generar un número considerable de plántulas sin raíces. Y finalmente puede lograr el propósito de enraizar mientras se propaga. La descendencia del subcultivo es un proceso de aumento en progresión geométrica. Si se utilizan 2 plántulas como base, se generarán 210 plántulas después de 10 generaciones.
Los métodos de subcultivo para la propagación media incluyen: cortar segmentos de tallo, separar grupos de yemas, aislar cuerpos embrioides, aislar protocormos, etc. El corte de segmentos de tallo se usa a menudo en cultivos con puntas de tallo alargadas y nudos de tallo obvios. Este método es simple. y fácil Puede mantener las características de la especie madre. El medio de cultivo suele ser el medio de cultivo básico MS; el racimo de yemas de separación es adecuado para los racimos de yemas producidos a partir de callos. El medio de cultivo suele ser el medio de diferenciación. cogollos más pequeños, se pueden cortar en pedazos primero. Coloque los racimos de cogollos en trozos pequeños y colóquelos en medio MS. Cuando sean un poco más grandes, sepárelos y continúe cultivando.
El medio utilizado para la proliferación es. casi lo mismo para una planta cada vez, porque el cultivo se encuentra en las mejores condiciones ambientales, suministro de nutrientes y control hormonal, eliminando la competencia de otros organismos, por lo que puede multiplicarse en una progresión geométrica.
En La reproducción rápida, el cultivo inicial es solo un proceso paso necesario, mientras que el subcultivo es un proceso regular y continuo. Sin embargo, después de alcanzar un número considerable, se debe considerar que algunos de ellos entran en la etapa de enraizamiento. solo para reservar la planta madre, y el enraizamiento es el desvío de materiales de multiplicación para producir productos terminados.
3. Vitrificación de materiales durante el subcultivo
La práctica muestra que cuando los materiales vegetales se propagan continuamente in vitro, los tallos y hojas jóvenes de algunos cultivos a menudo aparecen en forma de manchas de agua translúcidas. Este tipo de imaginación generalmente se llama. vitrificación. Su aparición ralentizará el crecimiento de las plántulas de probeta y reducirá el coeficiente de reproducción. La vitrificación es un trastorno fisiológico de las plántulas de probeta.
Debido a que los tallos tiernos vitrificados no son adecuados para la inducción del enraizamiento. reduciendo el coeficiente de reproducción. El grado de vitrificación de las plántulas de probeta también varía entre diferentes especies y variedades. Cuando el nivel de citoquinina en el medio de cultivo es alto, también es probable que se produzca vitrificación al agregar una pequeña cantidad de polivinilo. El alcohol, el ácido abscísico y otras sustancias pueden reducir la aparición de vitrificación hasta cierto punto.
Las plántulas de tubo de ensayo vitrificadas no tienen cera en la superficie de sus tallos y hojas, y compuestos polares en el cuerpo El nivel es de altura, las células tienen poca capacidad de retención de agua y las plantas tienen una fuerte transpiración, lo que imposibilita el trasplante normal. Esta situación se debe principalmente a la excesiva humedad del aire en el recipiente de cultivo.
Es causado por una alta permeabilidad al aire y una mala permeabilidad al aire. Las soluciones específicas son:
a. Aumentar el nivel de soluto en el medio de cultivo para reducir el potencial hídrico del medio de cultivo. >b. Reducir la cantidad de compuestos que contienen nitrógeno en el medio de cultivo;
c, aumentar la luz
d, aumentar la ventilación del contenedor y preferiblemente la fertilización con CO2, lo que reducirá significativamente la cantidad de compuestos que contienen nitrógeno en el medio de cultivo; vitrificación de plántulas en tubos de ensayo.
e. Bajar la temperatura del cultivo y realizar un cultivo a temperatura variable ayudará a reducir la aparición de vitrificación de plántulas en tubos de ensayo;
f. Reducir el contenido de citoquininas en el medio de cultivo puede considerar agregar una cantidad adecuada de ácido abscísico.
3. Cultivo de enraizamiento
Cuando el material prolifera hasta una cierta cantidad, parte del cultivo debe desviarse a la etapa de cultivo de enraizamiento. Si el cultivo no se puede transferir al medio de enraizamiento a tiempo, se eliminarán las plántulas que no hayan sido. transferido durante mucho tiempo se amarilleará y envejecerá, o el hacinamiento provocará un aumento de plántulas ineficaces, lo que provocará desperdicio. El cultivo de raíces es el proceso de enraizar plántulas sin raíces. El propósito de este proceso es hacer que las raíces adventicias producidas sean densas y fuertes. El cultivo de enraizamiento puede usar 1/2 o 1/4 de medio de cultivo MS, eliminar todas las citoquininas y agregar auxinas no alimentarias (NAA, IBA, etc.).
Se pueden usar los siguientes métodos para inducir el enraizamiento
a. Sumergir la base de los nuevos brotes en una solución de IBA 50 o 100*10-6 durante 4-8 horas;
b. Cultivar en un medio que contenga auxina durante 4-6. días
c. Trasplante directo a un medio que contenga hormona de crecimiento. En un medio de enraizamiento que contenga vitaminas.
Los tres métodos anteriores pueden inducir el enraizamiento de nuevos brotes, excepto los dos primeros. son más beneficiosos para el crecimiento y desarrollo de nuevas raíces. El tercer método es más beneficioso para el crecimiento de raíces jóvenes. Tiene un efecto inhibidor. La razón es que la presencia continua de mayores concentraciones de auxinas después de que se forma el cuerpo primitivo de la raíz. no favorece el crecimiento y desarrollo de raíces jóvenes, sin embargo, este método es más factible.
Además, también se pueden utilizar los siguientes métodos para echar raíces 1. Prolongar el tiempo de cultivo en la proliferación. medio 2. Reduzca deliberadamente algunas tasas de proliferación y reduzca la dosis de citoquinina (es decir, combine la proliferación y el enraizamiento en un solo paso). tener una etapa de enraizamiento puede ahorrar la producción de un medio de cultivo, y los esquejes cortados se pueden sumergir en una solución de auxinas, pero este método solo es adecuado para algunos cultivos que son fáciles de enraizar.
Cuando Es difícil que algunas plantas echen raíces, es necesario colocar un puente de papel de filtro en el medio de cultivo de modo que quede ligeramente por encima del nivel del líquido y confiar en la absorción de agua del papel de filtro para suministrar agua y nutrientes para inducir. enraizamiento.
Desde Las plántulas desarrolladas a partir del cuerpo embrioide a menudo tienen raíces originalmente diferenciadas, que pueden crecer sin la etapa de enraizamiento inducido, sin embargo, debido a que la cantidad de plántulas desarrolladas a partir del cuerpo embrioide es particularmente grande y el individuo. El tamaño es pequeño, a menudo es necesario una etapa de medio de cultivo con baja concentración o sin hormonas vegetales para fortalecer las plántulas y echar raíces.
La etapa de enraizamiento y fortalecimiento de las plántulas en el tubo de ensayo. es trasplantar con éxito las plántulas al ambiente fuera del tubo de ensayo para que las plántulas del tubo de ensayo puedan adaptarse a las condiciones ambientales externas. Por lo general, diferentes plantas tienen diferentes temperaturas de aclimatación adecuadas. Por ejemplo, 18-20 ℃ es adecuado para los crisantemos. La práctica ha demostrado que si la temperatura para el crecimiento de las plantas es demasiado alta, no sólo aumentará la transpiración, sino que también hará que los hongos se reproduzcan fácilmente. Problema. Si la temperatura es demasiado baja, el crecimiento de las plántulas será lento o difícil de sobrevivir. Cuando la temperatura es baja en primavera, se puede agregar un alambre calefactor al semillero para que la temperatura del sustrato sea ligeramente superior a la temperatura del aire en 2-3°C. Esto no solo favorece el enraizamiento y el desarrollo del sistema radicular. , pero también ayuda a avanzar el crecimiento de las plántulas.
La intensidad de la luz de las plántulas trasplantadas fuera del tubo de ensayo debe ser mayor que la anterior al trasplante, y debe poder adaptarse a temperaturas más altas. Luz difusa de intensidad (alrededor de 4000 lx) para mantener la intensidad de la luz necesaria para la fotosíntesis. Sin embargo, la luz excesiva estimula la transpiración y agudizará la contradicción del equilibrio hídrico.
5. Domesticación y trasplante
.El trasplante de plántulas de probeta es una parte importante del proceso de cultivo de tejidos. Si esta parte del trabajo no se realiza bien, todos los esfuerzos anteriores serán en vano. Para trasplantar las plántulas de probeta, debe elegir el. sustrato apropiado y cooperar con las medidas de manejo correspondientes para garantizar la finalización sin problemas de todo el trabajo de cultivo de tejidos.
Dado que las plántulas en tubo de ensayo se cultivan en condiciones estériles, con suministro de nutrientes, luz adecuada y temperatura de casi el 100% La humedad relativa, su fisiología, morfología y otros aspectos son muy diferentes de las plántulas cultivadas en condiciones naturales. Por lo tanto, es necesario refinar las plántulas, por ejemplo mediante control de agua, pérdida de peso, mejora del brillo, enfriamiento y otras medidas, para que puedan crecer. pueden adaptarse gradualmente al entorno externo, provocando así los cambios correspondientes en fisiología, forma y organización, haciéndolos más adecuados para el entorno natural. Sólo esto garantizará que la prueba.
Las plántulas tubulares se trasplantaron con éxito.
Mirando desde las hojas, la cutícula de las plántulas tubulares está poco desarrollada y las hojas generalmente no tienen pelos epidérmicos, o solo unos pocos pelos epidérmicos, e incluso una gran cantidad de Aparecen agujeros de agua en las hojas, y la cantidad y el tamaño de los estomas suelen ser mayores que los de las plántulas ordinarias. Se puede ver que las plántulas de tubo de ensayo son más adecuadas para crecer en un ambiente con alta humedad. En el entorno fuera del tubo de ensayo, la tasa de pérdida de agua de las plántulas del tubo de ensayo será muy alta, lo que es muy fácil de morir, para mejorar las características fisiológicas y morfológicas adversas antes mencionadas de las plántulas del tubo de ensayo. , deben someterse a un tratamiento de aclimatación para adaptarse al mundo exterior. Las medidas habituales son: aumentar la humedad y debilitar la luz al mundo exterior; hacer que el tubo de ensayo sea permeable al gas, aumentar la aplicación de fertilizante de dióxido de carbono y reducir gradualmente la humedad del aire. , etc.
Además, el sustrato de cultivo y aclimatación debe esterilizarse porque las plántulas de tubo de ensayo crecen en un ambiente estéril y son extremadamente resistentes a bacterias y hongos externos para mejorar su tasa de supervivencia. , se pueden agregar 200-500 veces de polvo humectable de clorotalonil al 75 % al medio de cultivo para su esterilización.
1. Sustrato y recipiente para trasplante
El sustrato adecuado para plantar plántulas de probeta debe tener permeabilidad al aire, retención de humedad y cierto grado de fertilidad, ser fácil de esterilizar y no favorecer el crecimiento de bacterias diversas. Generalmente se pueden utilizar perlas, roca, vermiculita, arena, etc. Para aumentar la adherencia y un cierto grado de fertilidad, se puede utilizar tierra de turba o tierra de humus. El tiempo de mezcla debe basarse en la proporción. de perlita, vermiculita, suelo de turba o suelo de humus es 1: 1:0,5. También puede utilizar arena: suelo de turba o suelo de humus en 1:1. Estos medios deben esterilizarse en autoclave antes de su uso o hornearse durante al menos 1 hora para eliminarlos. los microorganismos en ellos. Esto debe llevarse a cabo de acuerdo con los hábitos de cultivo de diferentes plantas. Preparación para obtener resultados de cultivo satisfactorios. A continuación se presentan varios sustratos comunes para el cultivo de plántulas en tubos de ensayo.
1. Arena de río
La arena de río se divide en dos tipos: arena gruesa y arena fina. La arena gruesa se conoce comúnmente como arena de río y su diámetro de partícula es de 1 a 2 mm. Su diámetro de partícula es de 0,1 a 0,2 nm. La arena de río se caracteriza por un fuerte drenaje, pero tiene poca capacidad de retención de agua y almacenamiento de fertilizantes. Generalmente no se usa sola para plantar directamente plántulas de probeta.
2. Suelo de turba
El suelo de turba se forma a partir de la descomposición prolongada de restos de plantas depositados en pantanos. Tiene buena retención de agua, gran capacidad de almacenamiento de fertilizantes y una reacción neutra o ligeramente ácida, pero normalmente no puede ser así. usado solo. Para plantar plántulas de tubo de ensayo, debe mezclarse con arena de río y otros tipos para formar tierra para macetas y usarse.
3. Suelo de humus
El suelo de humus se forma por la descomposición de las hojas caídas de las plantas. Uno se forma naturalmente y el otro es causado por el hombre. Cuando se elabora artificialmente, las hojas caídas en otoño se pueden recolectar y. luego enterrarlo en un hoyo, regarlo y humedecerlo, y luego tamizarlo para obtenerlo. Las hojas de humus contienen una gran cantidad de nutrientes minerales y materia orgánica, y generalmente no se pueden usar solas. El suelo de humus ayuda a la planta a desarrollar raíces.
4. Contenedores
Los contenedores de cultivo pueden utilizar macetas de plástico blando de 6*6cm-10*10cm, o bandejas de semillero. Las primeras ocupan una gran superficie y consumen mucho sustrato, pero no es necesario trasplantar las plántulas. , mientras que este último requiere un segundo trasplante de plántulas, pero ahorrando espacio y sustrato.
2. Preparación antes del trasplante
Antes del trasplante, el cultivo se puede trasladar a la luz natural durante 2-3 días sin abrirlo, para que las plántulas del tubo de ensayo puedan recibir una luz intensa para que crezcan más fuertes, y luego trasplantar Abrir el plántulas durante 1-2 días y someterse a un tratamiento con menor humedad para adaptarse a futuras condiciones de humedad natural.
3. Trasplante y manejo de plántulas
Saque las plántulas con raíces del tubo de ensayo, lave el medio de cultivo adherido a las raíces con agua del grifo y retírelo todo para evitar que el medio de cultivo residual reproduzca bacterias. Pero retírelo con cuidado, se debe evitar dañar las raíces al trasplantar, use una vara de bambú tan gruesa como un palillo para insertar un pequeño agujero en el sustrato y luego inserte las plántulas para evitar daños. Después de plantar, compacte el sustrato alrededor de las plántulas. Antes de plantar, el sustrato debe compactarse abundantemente después de plantar. Luego, traslade las plántulas a un ambiente con alta humedad. /p>
1. Mantenga el equilibrio entre el suministro y la demanda de agua de las plántulas dentro de los 5 a 7 días posteriores al trasplante, se deben proporcionar condiciones de alta humedad del aire para reducir la evaporación del agua en la superficie de la hoja, lo más cerca posible de las condiciones de la botella de cultivo. que las plántulas siempre puedan permanecer altas y altas. Mantenga las plántulas para equilibrar el suministro y la demanda de agua, en primer lugar, se debe regar abundantemente el medio de cultivo del recipiente de nutrientes, y también se debe regar la superficie del lecho donde se coloca, y luego se debe instalar un pequeño cobertizo para reducir la evaporación del agua. En la etapa inicial, se debe rociar con frecuencia para mantener las gotas de agua en la película del cobertizo. Cuando se encuentre que las plántulas están creciendo después de 5 a 7 días, las plántulas. La humedad se puede reducir gradualmente y reducir el número de pulverizaciones de agua.
Después de unos días, abra ambos extremos del arco para ventilar para que las plántulas se adapten a las condiciones de menor humedad. Después de unos 15 días, retire la película del arco y controle la humedad, reduzca gradualmente el riego y promueva las plántulas. para crecer fuerte.
2. Prevenir el crecimiento de hongos Dado que el entorno original de las plántulas del tubo de ensayo es estéril, es difícil mantener una esterilidad completa después de su eliminación. Por lo tanto, debemos intentar no permitir que los hongos crezcan en grandes cantidades para facilitar su supervivencia. El sustrato debe esterilizarse en autoclave o tostarse. Se puede utilizar una cierta concentración de fungicidas de forma adecuada para proteger eficazmente las plántulas, como carbendazim y tiofanato, con una concentración de 800 a 1000 veces. La pulverización se debe realizar una vez cada 7 a 10 días. Para minimizar el daño a las plántulas y las heridas al trasplantar las plántulas, las causas de las plántulas muertas son demasiado y demasiado daño a las raíces. Al rociar agua, puede agregar 0,1% de urea o usar una solución acuosa de macroelementos de 1/2 MS como tapa. aderezo, que puede acelerar el crecimiento y la supervivencia de las plántulas.
3． Ciertas condiciones de temperatura y luz después de trasplantar las plántulas del tubo de ensayo, se deben mantener ciertas condiciones de temperatura y luz. La temperatura de enraizamiento adecuada es de 18 a 20 °C. Cuando la temperatura del suelo es baja en invierno y primavera, se pueden utilizar cables calefactores. calentarlas una temperatura demasiado baja provocará que el crecimiento de las plántulas sea lento o difícil de sobrevivir. Una temperatura excesiva hará que el agua se evapore, destruyendo así el equilibrio hídrico y favoreciendo el crecimiento de hongos.
Además. , se puede utilizar una luz más débil en la etapa inicial del manejo de la luz, como cubrir el arco pequeño con una red parasol o un periódico para evitar que la luz solar queme las plántulas y aumente la evaporación del agua. Cuando las plantas pequeñas tengan un nuevo crecimiento, aumente gradualmente la luz. En el período posterior, la luz natural se puede utilizar directamente para promover la acumulación de productos fotosintéticos para mejorar la resistencia y promover la supervivencia.
4. Mantener una correcta aireación del sustrato. Elegir un sustrato granular adecuado para asegurar una buena aireación. No regar demasiado durante el proceso de manejo, se debe drenar rápidamente para facilitar la respiración de las raíces. Durante el proceso de trasplante de plántulas de tubo de ensayo, siempre que el equilibrio hídrico, el medio adecuado, el control de bacterias diversas y las condiciones adecuadas de luz y temperatura estén bien controladas, las plántulas de tubo de ensayo se pueden trasplantar fácilmente.