Cómo comprender rápidamente nuevos plásmidos (ⅳ)
Las secciones anteriores introdujeron la clasificación de plásmidos, el origen de replicación, el promotor, la resistencia, la purificación de proteínas y las etiquetas de identificación, respectivamente. Esta sección presentará otra aplicación común de las etiquetas de proteínas: etiquetas de proteínas fluorescentes y genes indicadores de luciferasa, que también es la última parte de la introducción al mapeo de plásmidos. Los plásmidos y mapas de uso común se describirán lo más brevemente posible.
Las proteínas fluorescentes tienen una amplia gama de aplicaciones, como la observación de actividades de la vida celular, como el crecimiento, la invasión, la metástasis y la regeneración de células tumorales, y pueden usarse para etiquetar proteínas y organismos expresados.
? El sistema de gen indicador de luciferasa es un sistema indicador que utiliza luciferina como sustrato para detectar la actividad de la luciferasa de luciérnaga. La bioluminiscencia liberada durante la oxidación de la luciferina se mide con un analizador de fluorescencia, también conocido como luminómetro o analizador de centelleo líquido. La luciferina y la luciferasa son sistemas bioluminiscentes que pueden detectar la expresión genética de manera muy sensible y eficiente.
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Proteína fluorescente
Proteína verde fluorescente
Proteína verde fluorescente, GFP) es una Proteína compuesta por aproximadamente 238 aminoácidos con un peso molecular de 27 KDa. Puede excitarse con luz azul o luz ultravioleta para emitir fluorescencia verde. Esta proteína fue descubierta por primera vez por Shimomura et al. en 1962 en Aequorea victoria. En el proceso de brillar, las medusas necesitan la ayuda de proteínas luminiscentes, que pueden interactuar con los iones de calcio. El 8 de junio de 2008, el científico japonés Osamu Shimomura y los científicos estadounidenses Martin Chalfie y Yongjian Qian ganaron el Premio Nobel de Química por descubrir y transformar la proteína verde fluorescente.
¿Proteína fluorescente verde mejorada (EGFP)?
EGFP: La proteína fluorescente verde mejorada se refiere a la proteína fluorescente verde mejorada. EGFP es una proteína mutante verde fluorescente. ¿Cuáles son las aplicaciones más comunes? Mutante de GFP: la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP), cuya intensidad de fluorescencia es más de 6 veces mayor que la de GFP, es más adecuada que GFP como gen informador para estudiar la expresión, regulación y expresión de genes. Diferenciación celular, localización y transporte de proteínas en organismos, etc.
La longitud de onda de excitación es de 488 nanómetros y la longitud de onda de emisión es de 507 nanómetros. La construcción de la secuencia de Korsak en el vector permite la expresión de la proteína de fusión EGFP en sistemas eucariotas con mayor eficiencia. Las proteínas fluorescentes pueden emitir fluorescencia verde cuando se les proporciona una longitud de onda de excitación en células u organismos, lo que muestra la expresión de genes diana, y sus propiedades de fluorescencia son estables. Conocida como sonda de células vivas, no interfiere con la detección de proteínas, es rápida y sensible y es ideal para la detección de fármacos de alto rendimiento.
En la imagen superior, ambos plásmidos están marcados con la proteína fluorescente EGFP. En la primera imagen, la M en mEGFP representa la abreviatura de monómero monómero. La proteína fluorescente existe en forma de monómero, lo cual es muy importante en muchos diseños experimentales, como la formación de una proteína de fusión con un gen marcador objetivo. La principal diferencia entre las dos imágenes es que la posición de inserción de EGFP es diferente, una está en el terminal N y la otra en el terminal C. En pmEGF-C1, EGFP se inserta en el extremo N de la cadena principal y el sitio de clonación múltiple MCS está en el extremo C. Este plásmido se denominó C1. En pEGF-N1, EGFP se inserta en el extremo C de la cadena principal, MCS está en el extremo N y el plásmido se denomina N1.
Proteína Roja Fluorescente
MCereza es un tinte rojo fluorescente ampliamente utilizado como trazador en biotecnología, incluido el etiquetado molecular y la localización de componentes celulares. A diferencia de otras proteínas GFP y otras variantes de proteínas fluorescentes verdes aisladas de Aequorea victoria, mCherry y la mayoría de las otras proteínas fluorescentes rojas son proteínas aisladas de corales (discófitos). En comparación con otras proteínas fluorescentes, la ventaja de mCherry es que su color y la proteína fluorescente verde (GFP) más utilizada se pueden coetiquetar, y mCherry tiene una fotoestabilidad excelente en comparación con otras proteínas fluorescentes monoméricas. m representa monómero.
Los picos máximos de absorción/emisión de mCherry se sitúan en 587 nm y 610 nm respectivamente. Es resistente al fotoblanqueo, relativamente estable y fácil de observar. MCCherry madura muy rápidamente, con un t0,5 de 15 minutos, lo cual es muy importante en experimentos que requieren una respuesta rápida, como los sistemas de informe de actividad del promotor.
MCerry también se divide en n-terminal y c-terminal.
La siguiente figura muestra información de la mayoría de las proteínas fluorescentes disponibles.
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Luciferasa
Principio del gen informador de luciferasa simple/doble
Basado en las propiedades quimioluminiscentes de luciferasa combinada con el sustrato puede insertar los elementos reguladores para la transcripción del gen de interés aguas arriba y aguas abajo de la luciferasa para formar un plásmido del gen indicador de luciferasa. Luego se transfectan las células y, después de una estimulación adecuada, se lisan y se mide la intensidad de la actividad de la enzima. Los efectos de diferentes estimulaciones sobre los elementos reguladores de la transcripción antes y después de la estimulación se juzgan por la actividad de la luciferasa.
El gen informador de luciferasa dual se refiere a la luciferasa de luciérnaga y la luciferasa marina. La luciferasa de luciérnaga se aísla de los gusanos cachondos y tiene un peso molecular de 61 kDa. Se aisló fluoresceína con un peso molecular de 36 kDa de Renilla. La diferencia entre los dos radica en los diferentes sustratos, cofactores y colores luminiscentes.
1. Los sustratos y cofactores son diferentes: la luciferasa de luciérnaga (F-Luc) requiere luciferina, y pueden aparecer iones de oxígeno, ATP y magnesio al mismo tiempo, mientras que la luciferasa de Renilla (para abreviar R-Luc) ) requiere sólo coelenterazina y oxígeno.
2. Los colores de la luz son diferentes: la luz producida por la luciferasa de luciérnaga es de color amarillo verdoso con una longitud de onda de 550-570 nm; la luciferasa de Renilla produce luz azul con una longitud de onda de 480 nm.
Debido a la influencia de las condiciones experimentales, un solo experimento con indicador de fluoresceína no puede reflejar con precisión los resultados experimentales. Utilice el gen informador de luciferasa dual como control para la * * * transfección para evitar errores experimentales como diferencias en la viabilidad celular y el grado de lisis. Generalmente, el gen de la luciferasa se utiliza como referencia interna y, a menudo, se transfecta con luciferasa de luciérnaga* o ambas luciferasas se construyen en el mismo plásmido con diferentes promotores. Al calcular los resultados, calcule el valor de detección de luciferasa de luciérnaga/valor de detección de luciferasa de Renilla.
Proceso experimental del gen reportero de luciferasa dual
Aplicación del gen reportero de luciferasa dual
1 Verificar la interacción de direccionamiento entre el efecto de microARN y ARNm. Inserte la secuencia 3'UTR del ARNm que se va a detectar en el vector del gen informador y luego * * * transfiéralo a microARN. Si se reduce la actividad de la luciferasa, se indicará como su secuencia objetivo.
2. Verificar la interacción objetivo entre microARN y lncARN. La secuencia candidata de lncRNA se insertó en la región 3'UTR de F-Luc en el vector del gen informador y se detectó la actividad de lncRNA.
3.Análisis de la estructura del promotor. La secuencia de la región promotora (normalmente de aproximadamente 2 k) se segmenta y trunca, o se mutan sitios específicos, y luego se construyen vectores indicadores de luciferasa respectivamente para detectar su actividad promotora.
4. Análisis SNP del promotor. Existen polimorfismos de un solo nucleótido en las regiones promotoras de ciertos genes y sus actividades relativas pueden analizarse mediante sistemas indicadores de luciferasa.
5. Verificar la interacción entre factores de transcripción específicos y sus secuencias reguladoras. Inserte la secuencia (generalmente la región promotora) en el vector del gen informador y, al mismo tiempo * * * sobreexprese el factor de transcripción en las células experimentales, y podrá analizar si la sobreexpresión del factor de transcripción aumenta la actividad de la luciferasa.
6. Puedes analizar si la ruta de la señal está activada. Construya la secuencia original de la reacción posterior de la vía de señalización en el vector del gen informador. En diferentes condiciones de señalización ascendentes, la actividad de la luciferasa representa la reacción descendente de esta vía.
Plásmido informador de luciferasa para detectar niveles de actividad transcripcional de NF-κB
Plásmido básico PGL3-Basci
Gen informador de luciferasa de Renilla
Básicamente introduce los elementos comúnmente utilizados en mapas de plásmidos.
Más adelante se presentarán algunos plásmidos de uso común y sus componentes. Espero que sea útil para todos.