La historia de la investigación de Yamanaka Shinya
La ApoB es el componente principal de las lipoproteínas de baja densidad. El ARNm de ApoB puede ser desaminado mediante la enzima de edición ApoBEC1, lo que finaliza la traducción prematuramente para formar dos proteínas de diferentes tamaños: ApoB100 de longitud completa y ApoB48 de aproximadamente la mitad de longitud. ApoB48 editado se elimina rápidamente en plasma. Thomas predice que si ApoBEC1 se sobreexpresa en el hígado, los lípidos en sangre pueden disminuir. Si este modelo es factible, tal vez la terapia génica podría ayudar a reducir los lípidos en sangre en algunos pacientes obesos en el futuro.
Shinya trabajó duro los siete días de la semana y pasó seis meses creando ratones genéticamente modificados. Una mañana, el técnico que lo ayudaba a mantener los ratones le dijo: Nobuya, muchas de tus ratas están preñadas, pero todos los ratones son machos. Shinya dice que no me mentiste. Cuando fue a la sala de las ratas, vio muchas ratas macho que parecían realmente preñadas. Mató a algunos y descubrió que los ratones tenían cáncer de hígado y sus hígados estaban inflamados.
La sobreexpresión de ApoBEC1 reduce las lipoproteínas de baja densidad pero aumenta las lipoproteínas de alta densidad y, al mismo tiempo, se produce cáncer de hígado. Este negocio no es un buen negocio. Shinya resumió la experiencia y las lecciones en una conferencia: primero, la ciencia es impredecible; segundo, no intente utilizar nuevos genes para tratar a los pacientes; tercero, y probablemente lo más importante, no crea en las suposiciones del instructor.
Thomas se sintió decepcionado porque los resultados no cumplieron con las expectativas, pero este resultado inesperado despertó la curiosidad de Shenya: ¿Qué mecanismo provocó que los ratones desarrollaran tumores? Afortunadamente, Thomas tuvo la mente lo suficientemente abierta como para permitir que Shinya se desviara de la dirección principal del laboratorio y continuara explorando el mecanismo causante de cáncer de ApoBEC1. Es posible que después de sobreexpresar ApoBEC1, se puedan editar otros ARNm excepto ApoB. Encontrar estos ARNm puede explicar por qué ApoBEC1 causa cáncer.
Dado que se sabe que ApoBEC1 se edita únicamente reconociendo la secuencia específica del ARNm del sustrato, Shinya diseñó cebadores para la amplificación y descubrió un nuevo sustrato para ApoBEC1-Nat1, que inhibe la traducción de proteínas. Después de la sobreexpresión de ApoBEC1, la proteína Nat1 desaparece. Lógicamente, si la edición de Nat1 es una molécula importante en ApoBEC1 que causa cáncer, entonces los ratones con Nat1 desactivado también desarrollarían cáncer.
La desactivación genética es más complicada que el transgén y requiere la integración del plásmido construido en células madre embrionarias cultivadas in vitro. ¿No es la eliminación genética la tecnología que el Dr. Shinya sueña aprender? Entonces Shinya encontró en el instituto a un experto en eliminación de genes, Robert Farese, que en ese momento era profesor asistente. Aprendió todos los detalles de esta tecnología de su asistente Heather Myers y obtuvo con éxito heterocigotos desactivados por ratones Nat1. Heather Myers es amiga de toda la vida de Shinya; después de descubrir iPS, Shinya también expresó públicamente su gratitud a Heather Myers porque le dijo a Shinya que las células madre embrionarias no son solo una forma de inutilizar ratones, sino también un objeto de investigación muy interesante.
Mientras Shinya seguía preguntando con entusiasmo sobre las funciones de Nat1, su esposa lo dejó con su hija y regresó a Japón. Medio año después, decidió detener la investigación y regresó a China con tres preciosos ratones híbridos Nat1.
Caterpillar Stage-Nat1 de Osaka
En 1996, basándose en los cuatro artículos de alta calidad publicados durante su período postdoctoral, Xin también encontró un puesto de profesor asistente en su alma mater, la ciudad de Osaka. Universidad e investigación continua sobre Nat1.
Una vez más, hay una desviación de la predicción: después de la desactivación de Nat1, los ratones homocigotos mueren en el desarrollo embrionario temprano y es imposible observar si los ratones adultos tienen tumores.
La investigación adicional de Shinya encontró que las células madre embrionarias desactivadas en Nat1 no pueden diferenciarse como las células madre normales in vitro. En ese momento recordó las palabras de Heather Myers: Las células madre embrionarias no son solo una herramienta de investigación, sino también un objeto de investigación muy interesante. Su enfoque de investigación comenzó a desplazarse hacia las células madre embrionarias.
En los primeros años después de regresar a Osaka, debido a que recién estaba comenzando, Nobu recibió muy poca financiación para la investigación y también tuvo que criar cientos de ratones él solo, y su vida fue muy dura. Al mismo tiempo, la investigación básica en la Facultad de Medicina de la Universidad de la ciudad de Osaka es muy débil. Las personas que lo rodeaban no entendían la importancia de la investigación de Shinya sobre el papel de Nat1 en las células madre embrionarias, y siempre aconsejaban a Shinya que hiciera investigaciones más cercanas a los aspectos médicos clínicos. Sin embargo, el trabajo de investigación de Nat1 ha sido rechazado desde que fue enviado a la revista. Debido a diversas presiones y contratiempos, Shinya contrajo una enfermedad llamada PAD (Post-American Depression), depresión que se presentó luego de abandonar Estados Unidos casi abandonó la investigación científica y regresó a China para convertirse en cirujana ortopédica;
En su punto más bajo, dos cosas lo salvaron del PAD. Una es (el mentor de Yu, que anunció en 2007 que había fabricado iPS humanos casi al mismo tiempo que Shinya) anunció en 1998 que había recolectado y establecido líneas de células madre embrionarias a partir de blastocistos humanos: estas células madre se cultivaron in vitro durante varios meses después, también puede diferenciarse en células de diferentes capas germinales, como células epiteliales intestinales, condrocitos, células neuroepiteliales, etc. Esto animó mucho a Shinya y comenzó a creer que la investigación con células madre embrionarias era significativa y algún día se utilizaría clínicamente. La segunda cosa fue que la Escuela de Graduados en Ciencia y Tecnología de Nara, que tenía mejores condiciones, se enamoró de su experiencia, lo reclutó para establecer una instalación para ratones knockout y le proporcionó el puesto de profesor asociado.
Etapa de pupación de Nara-Fbx15
Después de varias capas de despegue, Shinya finalmente tiene su propio laboratorio independiente. Fue genial recibir ayuda por primera vez. Pero el problema vuelve a surgir: el número de estudiantes de posgrado es limitado y los estudiantes tienden a elegir laboratorios con calificaciones más antiguas y mejores condiciones en lugar de simplemente abrir laboratorios, si quieren charlar, no vienen; Para atraer estudiantes a su laboratorio, Shinya pensó mucho y propuso un plan ambicioso, afirmando que el objetivo a largo plazo del laboratorio es estudiar cómo transformar células adultas terminalmente diferenciadas en células madre pluripotentes.
La corriente principal de la investigación científica en ese momento era estudiar cómo diferenciar las células madre pluripotentes embrionarias en células de diferentes tejidos, con el fin de reemplazar las células del tejido dañadas o enfermas con estas células funcionales diferenciadas. Shinya cree que su laboratorio no tiene la fuerza para competir con estos grandes nombres, por lo que es mejor ir en la dirección opuesta y estudiar cómo revertir las células diferenciadas en células madre pluripotentes.
La opinión predominante en la comunidad científica de la época era que la diferenciación celular durante el desarrollo embrionario de los mamíferos era unidireccional, del mismo modo que el tiempo era irreversible. Esta visión no está exenta de defectos. Por ejemplo, los tejidos vegetales son pluripotentes. Los tallos de algunas plantas crecerán hasta convertirse en una nueva planta cuando se inserten en el suelo, es decir, las células madre diferenciadas pueden cambiar su destino y diferenciarse en nuevas células de raíces, tallos y hojas. Ya en 1962, el año en que nació Shinya, el británico Sir John Gurdon (que había trabajado con Shinya) informó de su sorprendente descubrimiento: al trasplantar el núcleo intestinal de renacuajos a huevos de rana enucleados, nuevas células pueden convertirse en renacuajos. Si las células heterocigotas se desarrollan hasta la etapa de blastocisto y los núcleos de la etapa de blastocisto se utilizan nuevamente para el trasplante nuclear, pueden convertirse en ranas adultas. Además, para convencer a la gente de que los núcleos celulares terminalmente diferenciados también son pluripotentes, cultivó células de diferentes tejidos de ranas adultas in vitro y descubrió que células híbridas de diferentes fuentes podían desarrollarse hasta la fase de renacuajo después de un trasplante nuclear. Desde 65438 hasta 0997, Ian Wilmut y Keith Campbell trasplantaron núcleos de células mamarias de oveja en óvulos de oveja enucleados basándose en el mismo principio y crearon con éxito Dolly, la oveja clonada. En 2001, los científicos descubrieron que el núcleo del timo se reprograma en gran parte fusionándose con células madre.
El primer paso del proyecto Shinya es encontrar tantos factores como sea posible, similares a Nat1, implicados en el mantenimiento de la función de las células madre (los factores de mantenimiento se refieren a aquellos factores que son necesarios para que las células madre embrionarias mantengan la pluripotencia in vitro).
Especuló que si estos factores de mantenimiento se sobreexpresaran, las células terminalmente diferenciadas podrían volver a convertirse en células madre pluripotentes. Una vez que tengan éxito, las células madre pluripotentes inducidas tendrán ventajas que las células madre embrionarias no tienen: no sólo pueden evitar los problemas éticos causados por las células madre embrionarias, sino que las propias células madre inducidas del paciente no causarán rechazo inmunológico después de ser modificadas y trasplantadas a el paciente nuevamente.
Animado por esta brillante perspectiva, Shinya engañó a tres estudiantes para que se unieran a su laboratorio. Pronto descubrieron una serie de genes expresados específicamente en células madre embrionarias. Uno de estos genes es Fbx15. El estudiante de Shinya, Yoshimi Tokuzawa, descubrió que Fbx15 no sólo se expresa específicamente en células madre embrionarias, sino que también está regulado directamente por otros dos factores de mantenimiento de células madre embrionarias, Oct3/4 y Sox2. Shinya le dijo a Yoshimi que Fbx15 debería participar en el mantenimiento de la pluripotencia de las células madre y el desarrollo embrionario. Supongo que no se pueden conseguir ratones knockout Fbx15 homocigotos. Yoshimi construyó ratones knockout para plásmidos y reemplazó el gen Fbx15 en el cromosoma con el gen neo resistente al fármaco G418 mediante recombinación homóloga.
La vida compleja volvió a engañar a Shinya: los ratones homocigotos eliminados de FBX 15 vivían muy sanos y no tenían ningún fenotipo evidente. Shinya desafió a sus estudiantes y dijo: bueno, es posible que Fbx15 no sea necesario para el desarrollo embrionario del ratón, pero debería serlo para mantener las células madre embrionarias in vitro. Apuesto a que no se puede eliminar completamente este gen en las células madre embrionarias. El diligente Yoshimi utilizó una concentración más alta de G418 para seleccionar plantas knockout homocigotas a partir de células madre. Aún vivían bien y no tenían fenotipo. Más tarde, Shinya bromeó en sus recuerdos: Los ratones estaban felices, las células también estaban felices y el único infeliz era el pobre estudiante Yoshimi.
Pero no puedes olvidar que pusiste mucho esfuerzo en derribar a la rata. Shinya una vez más usa su cerebro para aprovechar los desechos. Descubrió que Fbx15 sólo se expresa en células madre embrionarias, mientras que el gen de resistencia neo controlado por el promotor Fbx15 no se expresa en fibroblastos adultos, por lo que las células son sensibles al fármaco G418; sin embargo, las células madre embrionarias obtenidas de ratones knockout pueden crecer; en altas concentraciones de G418. Si los fibroblastos terminalmente diferenciados pudieran convertirse en células madre embrionarias, se volverían resistentes al G418. Los fibroblastos deberían ser resistentes a bajas concentraciones de G418 incluso si adquieren sólo algunas de las propiedades de las células madre embrionarias (Figura 2). ¡Los ratones knockout para Fbx15 en realidad proporcionan un buen sistema para detectar e inducir células madre! Por su destacado trabajo en la identificación de factores de mantenimiento de células madre embrionarias, Shinya encontró un nuevo puesto en la más prestigiosa Universidad de Kyoto en 2004. Además del sistema de detección de ratones knockout Fbx15, Shinya también acumuló 24 factores de mantenimiento que identificó e informó en la literatura. Shinya está ansioso por intentarlo, ¡está listo para salir del caparazón y agitar sus alas hasta convertirse en una mariposa!
Otro alumno de Shinya, Kazutoshi Takahashi, publicó anteriormente un artículo sobre la carcinogenicidad de las células madre en la revista Nature. Shinya estaba decidido a dejarle asumir la tarea más atrevida: la diferenciación inversa de células adultas, porque sabía que en "Naturaleza" había un artículo garantizado, e incluso si no se lograba nada en los próximos años, sus alumnos podrían soportarlo. .
Incluso con un buen sistema de cribado, esta cuestión es arriesgada o incluso inviable al principio. En aquella época se creía generalmente que las células adultas habían perdido su pluripotencia. Quizás las propias células adultas sean irreversibles y todo lo que puedas hacer sea inútil. Incluso si el destino del núcleo de una célula adulta se invierte mediante la transferencia nuclear, se trata sólo del núcleo, no de toda la célula. Los cromosomas de las células embrionarias y de las células adultas son iguales y el núcleo es totipotente, lo cual es comprensible. Y para revertir el núcleo, es necesario transferirlo al óvulo y dejar que el citoplasma del óvulo lo ayude a reprogramarse. Hay innumerables proteínas en el citoplasma del óvulo. Si queremos revertir el destino de toda la célula, necesitamos reorganizar todas las proteínas del citoplasma.
Incluso si las células pudieran reprogramarse, debería involucrar a muchas proteínas. Shinya sólo tiene 24 puntos en su mano. Es posible que falten cientos o miles de otros factores, ninguno de los cuales puede dar lugar a una reprogramación. Con estos 24 factores, es casi imposible lograr de forma lógica la reprogramación celular según los conocimientos actuales.
El idiota de Kazutoshi infectó fibroblastos con virus. Estos virus expresaron estos factores uno por uno. Por supuesto, las células resistentes a G418 no fueron seleccionadas. Shinya sabe cómo mantener motivados a los estudiantes. Fingió estar tranquilo y dijo: "Mire, esto demuestra que nuestro sistema de detección es muy bueno y no hay falsos positivos".
Tras intentarlo en vano, Kazutoshi se atrevió a proponer mezclar 24 virus para infectar células al mismo tiempo. Shinya piensa que esto es una idea estúpida: compañeros de clase, nadie ha hecho esto antes, pero es un caballo muerto tratar a un caballo vivo como médico. Si no estás demasiado cansado, pruébalo.
Después de esperar unos días, ocurrió un milagro. ¡Una docena de clones de células anti-G418 aparecieron escasamente en la placa de cultivo! Se hizo un descubrimiento que hizo época.
Después del avance en experimentos clave, el seguimiento será paso a paso. Kazutoshi eliminó un virus a la vez e infectó células adultas con los 23 virus restantes para ver cuántos clones podía cultivar y determinar qué factores eran necesarios para inducir células madre. Al final, identificó cuatro factores estrella: Oct3/4, Sox2, c-Myc y Klf4. ¡La sobreexpresión de estos cuatro factores en los fibroblastos es suficiente para convertirlos en células madre pluripotentes!
¿Entonces los clones celulares dirigidos a G418 deben ser células madre pluripotentes? A través de una serie de indicadores como los perfiles de expresión genética y el potencial de diferenciación, descubrieron que estas células eran similares a las células madre embrionarias en gran medida.
En 2006, Shinya informó sobre la inducción de células madre en ratones, causando sensación en la comunidad científica [13]; en 2007, también logró revertir el destino celular en células humanas, causando agitación en la comunidad científica [ 14]. Mirando atrás, es imposible. ¿Cómo tuvo éxito Shinya? A través de más investigaciones, sabemos que el mantenimiento de las propiedades de las células madre está orquestado por una red de genes. Al regular positivamente algunos genes clave, esta red puede reconstruirse y revertirse el destino de la célula. Los cuatro factores finalmente determinados por Yamanaka Shinya no son necesarios, y combinaciones de factores distintos de 24 también pueden lograr el mismo propósito. Es como una gran red. Siempre que se puedan admitir algunos puntos de apoyo, se podrá admitir toda la red.
El descubrimiento de las iPS tiene una importancia inusual. En primer lugar, renueva las ideas de la gente. Desde entonces, la gente ya no cree que el destino de las células sea irreversible; en realidad, las células pueden lograr una transdiferenciación entre diferentes tejidos. En segundo lugar, las células iPS evitan el dilema ético de las células madre embrionarias, y muchos laboratorios pueden repetir este sencillo experimento para obtener iPS y realizar investigaciones sobre células madre pluripotentes. En tercer lugar, las células iPS tienen muchas ventajas que las células madre embrionarias no tienen: las células iPS del propio cuerpo del paciente se implantarán en el paciente después de la operación in vitro y la respuesta inmunitaria se reducirá considerablemente si se revierten las células somáticas del paciente; en células ips in vitro, la observación de problemas en este proceso durante la diferenciación puede, hasta cierto punto, simular la aparición de enfermedades en una placa de Petri después de la amplificación y diferenciación in vitro; las iPS específicas de la enfermedad también se pueden utilizar para detectar medicamentos para el tratamiento; enfermedades o detectar la toxicidad de medicamentos.
Pero esto es sólo un nuevo comienzo. Las ciencias de la vida son muy complejas e impredecibles. Todavía existen muchas dificultades para convertir estas visiones en realidad y lograr que la propiedad intelectual beneficie verdaderamente a la humanidad. Shinya Yamanka, el niño mimado de la ciencia, se embarca sin miedo en un nuevo viaje con el ideal original de ayudar a más pacientes.