Tiempo de dosificación para la prueba de teratogenicidad en conejos

Sección 7 Prueba de teratogénesis

Domina el contenido de la prueba de teratogénesis. Prueba teratogénica: es un método de prueba estándar para identificar teratógenos en animales. El siguiente protocolo de prueba teratogénica se utiliza para detectar la teratogenicidad de los fármacos y también obtener información sobre la muerte embrionaria y el retraso del crecimiento causados ​​por los fármacos. 1. Animales de experimentación. Los animales de experimentación teratogénicos ideales deben tener un proceso de metabolismo de fármacos similar al de los humanos, tener una estructura placentaria similar, dar a luz a muchas camadas, tener un período de gestación corto, ser baratos, fáciles de conseguir y fáciles de operar. . En términos de función metabólica y estructura anatómica, los animales que cumplen con los requisitos son los perros y los monos; los animales que cumplen con los requisitos económicos y prácticos son los conejos, las ratas, los ratones y los cuyes. Sin embargo, los animales pequeños tienen deficiencias, por ejemplo, los conejos tienen una mayor tasa de malformaciones espontáneas y, en ocasiones, la duración de la gestación es variable (32-36 días). Las ratas tienen mayor tolerancia a los efectos teratogénicos, entre los conejos y los ratones. en las ratas, el número de malformaciones espontáneas es ligeramente mayor que en las ratas; la estructura de la placenta de las cobayas es similar a la de los humanos, pero el período de gestación es largo (unos 60 días) y el número de camadas es pequeño (4). ). Los más utilizados son ratas, ratones y conejos. Especialmente en ratas, porque la tasa de malformaciones espontáneas en ratas es baja y el tamaño de los fetos de rata también es adecuado para el examen. Las hembras deben ser aquellas que hayan quedado preñadas al final de la edad adulta. La selección de animales requiere una alta sensibilidad a los fármacos y una baja tasa de deformación espontánea. Se deben utilizar al menos dos animales, uno que sea roedor y el otro que no sea roedor. 2. Métodos de concepción y examen de los animales: tomando ratas como ejemplo, seleccione ratas hembra con una edad de más de tres meses y un peso de 200 a 250 g. Después de criarlas durante unos días, realice un examen de secreción vaginal para determinar. si están en celo. Si hay más secreción blanca en el frotis y se encuentran más células epiteliales multinucleadas en el microscopio, indica que la ratona está en proestro. El ciclo sexual de las ratas generalmente dura de 4 a 5 días y la transición del proestro al estro suele ocurrir por la noche. Las ratas en proestro se mantuvieron en la misma jaula con ratas macho de la misma edad en una proporción de 2:1 o 3:2 durante la noche, y al día siguiente se controló su preñez. Hay dos formas de comprobar si hay embarazo. La primera es comprobar el tapón vaginal. El tapón vaginal es un bulto blanco formado por la secreción de la vesícula seminal de la rata macho y la glándula de coagulación en la vagina de la rata hembra. Parece un grano de arroz. Se puede caer fácilmente y se puede quitar debajo de la jaula al día siguiente. Se descubrió en el plato de porcelana de azúcar que el tapón vaginal de los ratones no se cae fácilmente. Cuando la posición es profunda, use pinzas para abrir la abertura vaginal. ver claramente. La segunda es utilizar un frotis vaginal para comprobar si hay espermatozoides. Puede insertar un hisopo de algodón en la vagina y girarlo varias veces, luego sacarlo y aplicarlo en un portaobjetos de vidrio con solución salina normal para buscar espermatozoides en un nivel bajo. -microscopio de potencia. La detección de tapón vaginal o esperma indica embarazo. La fecha de detección es el "día 0" del embarazo, y la segunda es el día 1, a partir del cual se calcula la edad gestacional. La tasa de preñez es alta en primavera y otoño (hasta más del 70%) y baja en verano e invierno (50%). Por lo tanto, se puede utilizar un control artificial de la temperatura (alrededor de 23°C) y la luz para permitir que machos y hembras. animales enjaulados juntos durante 6 horas al día. Frotis vaginales para aumentar las tasas de preñez y facilitar el trabajo en Bai Yao. 3. Agrupación de dosis, método de administración y tiempo Los animales de prueba se dividieron en 4-5 grupos, incluidos 3 grupos de dosis (alta, media y baja), y los dos grupos restantes fueron grupos de control positivo y control negativo. El grupo de dosis alta debe tener toxicidad materna o ser la dosis máxima. La reducción de la ingesta de alimentos, el aumento de peso lento o disminuido, el sangrado vaginal, el sangrado, etc. son manifestaciones de reacciones tóxicas; el grupo de dosis bajas debe ser la dosis para las reacciones tóxicas maternas y embrionarias; Generalmente, es un múltiplo de la dosis clínica prevista. La dosis intermedia debe estar entre los grupos de dosis alta y baja, y la distancia entre los grupos de dosis debe ser una serie geométrica y mostrar pequeñas diferencias en la toxicidad. También se puede usar 1/3-1/5 de LD50 como grupo de dosis alta, y 1/30-1/100 LD50 como grupo de dosis baja. Se pueden insertar dosis intermedias entre las dosis alta y baja. grupos de dosis según proporciones iguales para obtener la dosis mínima de teratogenicidad o la dosis máxima sin efecto. Si la cantidad real de exposición humana se conoce o puede estimarse, la cantidad real de exposición humana (o la cantidad estimada) también puede considerarse como el grupo de dosis baja, y varias veces (por ejemplo, 10 veces) de ella pueden considerarse como el grupo de dosis baja. grupo de dosis alta. El grupo de control negativo es el control de disolvente (excipiente). Los controles positivos incluyen ácido acetilsalicílico (ratas 250 mg/kg, ratones 150 mg/kg) y vitamina A (aceite de hígado de bacalao concentrado 5 ml/kg). Los conejos pueden utilizar amida del ácido 6-aminonicotínico (2,5 mg/kg). Los laboratorios que hayan realizado pruebas teratogénicas y estén seguros de que los animales de prueba utilizados tengan resultados positivos para teratógenos pueden omitir el control positivo. El número de animales preñados en cada grupo es de 15 a 20 ratas y ratones, y de 8 a 10 conejas. 4 perros y monos. La vía de exposición debe determinarse según la naturaleza de la sustancia de prueba y los posibles métodos de contacto en humanos. Generalmente se utiliza la administración intragástrica y la inyección intraperitoneal. El momento de exposición debe elegirse cuando el embrión sea susceptible a los teratógenos (período de formación de órganos). Consulte el calendario de estudios de teratogenicidad en ratas, ratones y conejos.

Cada animal de prueba debe tener un registro preciso de la fecha de fertilización, la fecha y la dosis de la sustancia de prueba administrada durante la prueba, y el peso del animal después de la administración debe pesarse cada 3-4 días (0, 3, 7, 10, 13, 16, 20), y ajustar la dosis según el peso corporal. Por otro lado, también puede hacer una estimación preliminar de si el animal de prueba quedará preñado después de la fertilización y si el objeto de prueba afectará al embrión. desarrollo Si el embrión preñado se desarrolla normalmente, el animal afectado se verá afectado. El peso de los animales de prueba puede seguir aumentando significativamente; si el embrión muere debido a envenenamiento o abortos espontáneos, el peso materno dejará de crecer o incluso disminuirá. 4. Observación ⑴ Observación de la madre: Verifique todos los días para detectar síntomas de intoxicación. Las personas con signos de aborto espontáneo o parto prematuro (como sangrado vaginal) deben ser ejecutadas a tiempo para el examen. ⑵ Observación de fetos: mate a las hembras preñadas 1-2 días antes del parto para evitar que la rata madre ingiera las crías deformes después del parto natural. Retire el útero y los ovarios mediante laparotomía, pese e identifique el número de fetos vivos, fetos nacidos muertos y fetos absorbidos en el útero, y regístrelos en secuencia desde la parte superior del cuerno uterino izquierdo hasta la parte superior del útero derecho: luego verifique y registre el número de cuerpo lúteo. Feto vivo: completamente formado, carnoso de color rojo, con movimiento natural y respuesta de movimiento a la estimulación mecánica, la placenta es roja y de mayor tamaño; Muerte fetal tardía: completamente formada, de color rojo grisáceo, sin movimiento natural y que no responde a la estimulación mecánica. La placenta es de color rojo grisáceo y pequeña; Muerte prematura: marrón púrpura, formada de manera incompleta, sin movimiento natural, placenta de color púrpura oscuro. Feto absorbido: manchas de color violeta oscuro o claro, no se pueden identificar el embrión y la placenta. Cuerpo lúteo: una protuberancia amarilla parecida a un caviar en la superficie del ovario, que indica el número de ovulación en ratones preñados. La aparición de anomalías fetales vivas y registrar el tipo, localización y grado. Se despegó la piel y los órganos internos de 2/3 de los fetos vivos de cada ratón hembra, y se examinaron las deformidades esqueléticas después de teñirlas con rojo de alizarina y se sumergieron el 1/3 restante de los fetos vivos en fijador de Bouin; para examen. La apariencia común, los huesos y los órganos internos se muestran en las tablas 18-6, 18-7 y 18-8. Dado que actualmente no hay pruebas suficientes de que los huesos sean más sensibles a los teratógenos que las vísceras, se ha abogado por asignar aleatoriamente fetos de ratas de ambos cuernos uterinos para examinar las malformaciones esqueléticas. Los métodos específicos para el examen externo del feto y el examen de malformaciones esqueléticas y viscerales se describen ahora de la siguiente manera: ⑴ Examen externo del feto: Los animales de prueba que han sido sacrificados (o profundamente anestesiados) se someten a una cesárea para exponer el útero, y se llevan a cabo las siguientes inspecciones y registros. ① Determine el estado del embarazo, identifique y verifique el número de fetos vivos, mortinatos prematuros, mortinatos tardíos y fetos absorbidos en secuencia. ② Corte el útero, revise los fetos uno por uno en orden numérico y registre el sexo, el peso, la longitud del cuerpo, la longitud de la cola y el volumen placentario total de toda la camada. ③ Realice una inspección visual de la cabeza, el tronco, las extremidades y la cola del feto vivo. Las malformaciones comunes de cada parte se muestran en la Tabla 18-6. (2) Examen esquelético fetal: el examen esquelético fetal es una observación importante en la prueba de teratogénesis. Generalmente, 1/2 o 2/3 de los fetos de cada camada se reservan para este examen. El método específico es el siguiente: ① Coloque el feto reservado para el examen esquelético en una solución de etanol al 75% -90% durante 2 a 5 días. ② Coloque el feto fijado en una solución de hidróxido de potasio al 1% durante 3 a 10 días hasta que los músculos sean transparentes y los huesos visibles. Durante este período, la solución de hidróxido de potasio al 1% se puede reemplazar varias veces según la situación, y la piel del feto que se ha caído debe lavarse cada vez que se reemplaza la solución. ③ Después de que el feto haya sido tratado con una solución de hidróxido de potasio al 1%, tiñe con rojo de alizarina hasta que los huesos se tiñen de rosa o morado. Por lo general, toma de 2 a 5 días. Si es necesario, la nueva solución de tinción debe reemplazarse varias veces. Preparación de la solución de tinción de rojo de alizarina: Agregue rojo de alizarina a la siguiente mezcla hasta que se sature. Ácido acético glacial 5 m1 glicerol puro 10 ml 1% hidrato de cloral 60 ml Cuando lo use, tome 1 ml de la solución saturada de rojo de alizarina anterior, agregue una solución de hidróxido de potasio al 1 % a 1000 ml y mezcle para preparar la solución de aplicación. ④Los fetos teñidos se colocan en la siguiente solución transparente durante 1-2 días. Si la transparencia no es suficientemente satisfactoria, el tiempo en el líquido transparente se puede prolongar apropiadamente. Líquido claro I: 20 puntos de glicerol, 3 puntos de solución de hidróxido de potasio al 2%, 77 puntos de agua destilada. Líquido claro II: 50 puntos de glicerol, 3 puntos de solución de hidróxido de potasio al 2% y 47 puntos de agua destilada. Líquido claro III: 75 puntos de glicerina y 25 puntos de agua destilada. Las muestras de hueso fetal procesadas anteriormente se pueden observar y examinar a simple vista o con una lupa o un microscopio de disección. Presta atención a comprobar el estado, tamaño, cantidad y grado de osificación de cada hueso. (3) Examen visceral fetal: después de la inspección visual, coloque aleatoriamente 1/2 o 1/3 de los fetos en la solución de Bouin durante 1 a 2 semanas y luego utilice el corte a mano alzada para la observación. Los métodos específicos de inspección son los siguientes: Inspección. de los órganos de la cabeza: observe e inspeccione las siguientes secciones.

① Use guantes de goma para sacar la muestra fetal fijada, lave el fijador con agua del grifo y use un cuchillo de un solo lado para hacer una sección horizontal a lo largo de la boca y la oreja con las manos desnudas. Esta sección separa la mandíbula superior e inferior. la boca. Principalmente revise si hay grietas en la lengua y lengua faltante o bifurcada. ② Tome la parte superior del cráneo cortada de la sección anterior y haga una sección frontal verticalmente a lo largo de la parte frontal del globo ocular. Esta sección se enfoca en verificar si hay alguna deformidad en los conductos nasales, como conductos nasales agrandados o conductos nasales únicos. , etc. ③Haga una segunda sección frontal verticalmente a lo largo del centro del globo ocular para comprobar si hay alguna deformidad en el globo ocular, como oligoftalmia, microftalmia o noftalmia. Compruebe si hay hidrocefalia y agrandamiento ventricular. ④Realice una tercera sección frontal verticalmente a lo largo del borde posterior del globo ocular para comprobar si hay edema cerebral, hidrocefalia y agrandamiento ventricular. Examen torácico, abdominal y pélvico: realice una incisión en forma de cruz en el tórax y el abdomen a lo largo de la línea media del tórax y la pared abdominal y la línea horizontal del margen subcostal para exponer los órganos en el tórax, la cavidad abdominal y pélvica, y luego Verifique la posición, el número y el tamaño de cada órgano principal uno por uno. Verifique si hay alguna anomalía en el sexo y la forma. 5. La evaluación de resultados calcula principalmente el número total de malformaciones y el número total de malformaciones. Al calcular el número total de malformaciones, se considera como una malformación cada feto vivo con una o más malformaciones. Al calcular el número total de malformaciones, si ocurre una malformación en el mismo feto vivo, se cuenta como una malformación, si ocurren dos o más malformaciones, se cuenta como dos malformaciones, y así sucesivamente. Al calcular el número total de malformaciones y malformaciones, es necesario considerar si existe una relación dosis-efecto y, lo más importante, compararlo con el grupo de control según los siguientes indicadores: 1. Para cada grupo de hembras, es necesario contar los siguientes indicadores: (1) Animales apareados exitosos y tasa de apareamiento. ⑵ Número de animales muertos y tasa de mortalidad. ⑶ El peso promedio de las hembras de necropsia y el aumento de peso durante la gestación o el aumento de peso materno. Aumento de peso materno (g) = peso materno en el momento de la ejecución - peso al sexto día de embarazo - peso uterino en el momento de la ejecución ⑷ La tasa de aparición de anomalías maternas se basa principalmente en el porcentaje de anomalías maternas en el número total de hembras preñadas. Al calcular el número de madres con malformaciones, no importa cuántos fetos malformados o múltiples malformaciones ocurran en una misma madre, se contabilizará una madre con fetos malformados. 2． Para cada grupo de fetos, es necesario contar los siguientes indicadores: ⑴ número promedio de fetos vivos y tasa de fetos vivos ⑵ número de fetos absorbidos y tasa de fetos absorbidos ⑶ número de fetos nacidos muertos y tasa de mortinatos. ⑷ Tasa de deformidad de la apariencia, tasa de deformidad esquelética y tasa de deformidad visceral 3. Los datos del grupo experimental y del grupo de control se analizaron estadísticamente y se procesaron diferentes indicadores utilizando diferentes métodos de prueba de significancia. El peso promedio, el número promedio de cuerpo lúteo, el número promedio de implantaciones, el número promedio de fetos vivos y el peso promedio de los fetos vivos se miden mediante la prueba t: tasa de embarazo, tasa de apareamiento, tasa de concepción, tasa de fetos vivos, prueba de absorción fetal χ2; tasa, tasa de mortinatos, malformación La tasa fetal utiliza estadísticas no paramétricas. Calcular las relaciones dosis-respuesta cuando sea posible. Después del cálculo basado en los indicadores anteriores, los resultados de la evaluación final se utilizan para determinar si la sustancia de prueba tiene efectos teratogénicos. Se debe prestar atención a las siguientes cuestiones: (1) El efecto teratogénico tiene una relación entre dosis y efecto. tiene alguna influencia en la aparición de cualquier malformación. La relación dosis-efecto debe considerarse plenamente y, lo que es más importante, debe procesarse estadísticamente para confirmar que el número de madres con fetos teratogénicos en el grupo de prueba es significativamente mayor que en el grupo de prueba. grupo de control, y la tasa de malformaciones de fetos vivos en el grupo de prueba debe ser significativamente mayor que la del grupo de control. Sólo entonces se pueden considerar sus efectos teratogénicos. (2) Cada laboratorio debe comprender la aparición a largo plazo de malformaciones naturales en los animales de experimentación utilizados, incluido el tipo y la frecuencia de las malformaciones naturales. Si las deformidades que aparecen en los animales del grupo de prueba no han aparecido en los animales del grupo de control durante mucho tiempo, el efecto teratogénico de la sustancia de prueba debe tomarse más en serio; de lo contrario, las conclusiones deben sacarse con cautela; (3) Los organismos suelen tener variación, que es la diferencia entre los individuos de una población. Especialmente las diferencias entre un individuo y otros individuos dentro de la misma especie. La variación está controlada por los genes y tiene el significado de adaptación y evolución. Es completamente diferente de las malformaciones causadas por compuestos extraños que interfieren con el crecimiento y desarrollo normal de los embriones. Algunas personas creen que fenómenos como el número de costillas y vértebras. uno más o menos de lo normal son todas mutaciones y no pueden considerarse causas anormales. Sin embargo, la tasa de aparición de mutaciones es generalmente baja y no existe relación entre dosis y efecto, por lo que ambos pueden distinguirse. (4) Existen diferencias entre especies en cuanto a los efectos teratogénicos, y también existen diferencias entre cepas del mismo animal. Por lo tanto, después de que se produzca un efecto teratogénico en un animal, es mejor repetir la prueba en otro animal o al menos repetir la prueba en la misma especie. Si los resultados son consistentes, se puede considerar que tiene un efecto teratogénico en los animales. ⑸ Debido a las diferencias entre especies en cuanto a teratogenicidad, cualquier compuesto extraño que sea teratogénico para los animales no necesariamente lo será para los humanos. Por un lado, es necesario realizar más estudios epidemiológicos poblacionales para determinar sus efectos teratogénicos en el cuerpo humano; por otro, los efectos teratogénicos deben reconocerse como una manifestación de la toxicidad de compuestos extraños.

Cualquier compuesto que tenga efectos teratogénicos en los animales también debe considerarse potencialmente teratogénico en los humanos. Por lo tanto, se deben tomar varias medidas para minimizar el contacto humano con ellos. Esta cuestión implica la inferencia de los resultados de las pruebas teratogénicas en animales en los humanos. La cuestión de trasladar los resultados de las pruebas con animales a los seres humanos es actualmente un tema de gran importancia en toxicología y también es muy activo en la investigación. Aunque se han propuesto muchos métodos o enfoques, hasta el momento no se ha establecido ningún método sencillo para extrapolar los resultados de las pruebas con animales a los seres humanos. Lo mismo se aplica a los efectos teratogénicos. Los resultados experimentales en ratones, ratas u otros animales no deben aplicarse directamente a los humanos. Ahora se hace referencia y se sintetizan los estándares de clasificación de teratógenos recomendados por la Comunidad Económica Europea y la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico. Tenga en cuenta que solo puede usarse como referencia en el trabajo real y debe analizarse, pensarse y usarse de manera flexible en función de la situación real. (6) Al realizar una evaluación final del efecto teratogénico de un compuesto extraño en los seres humanos y decidir si se debe tomar una decisión, se debe prestar especial atención a la dosis de exposición real de los seres humanos. Hay muchos fármacos que pueden presentar efectos teratogénicos al alcanzar una determinada dosis. Por ejemplo, las preparaciones de ácido salicílico como fármacos pueden provocar teratogénesis y la talidomida puede provocar teratogénesis en muchos animales. Incluso algunos nutrientes que necesita el cuerpo humano, como la vitamina A, pueden tener efectos teratogénicos en determinadas dosis y, a menudo, se utilizan como controles positivos en pruebas teratogénicas. Por tanto, cualquier compuesto extraño que entre en contacto con una determinada especie animal en una determinada dosis, en una determinada etapa del desarrollo embrionario, puede interferir en el desarrollo del embrión y puede provocar malformaciones. Para realizar una evaluación final sobre si un compuesto extraño tiene efectos teratogénicos y considerar si se permite su uso en base a esto, se debe considerar plenamente la dosis real que puede entrar en contacto con el cuerpo humano y el modo y ruta de exposición. siendo la dosis la más importante.

￥

5.9

La oferta VIP por tiempo limitado de Baidu Wenku ya está abierta, disfruta de más de 600 millones de contenido VIP

Consíguela ahora< /p >

Prueba teratogénica

Sección 7 Prueba teratogénica

Dominar el contenido de la prueba teratogénica. Prueba teratogénica (prueba teratogénica): Es un método de prueba estándar para identificar teratógenos en animales. Se utiliza el siguiente protocolo de prueba teratogénica.