¿Qué pruebas biológicas se necesitan para establecer una línea celular?
Generalmente se considera que la biotecnología moderna incluye tecnología de ingeniería genética, tecnología de ingeniería celular, tecnología de ingeniería de enzimas y tecnología de ingeniería de fermentación, y el desarrollo de estas tecnologías está casi todo relacionado con Cultivo celular. Estrechamente relacionado, especialmente en el campo médico, el cultivo celular tiene un papel y un valor especiales. Por ejemplo, muchos medicamentos o vacunas genéticamente modificados se obtienen mediante cultivos celulares durante los procesos de desarrollo y producción. Muchas vacunas contra la hepatitis B genéticamente modificadas utilizan células CHO como portadoras. La ingeniería celular no se puede separar del cultivo celular. Los anticuerpos monoclonales de hibridoma se obtienen completamente mediante el cultivo celular. Incluso los anticuerpos modificados genéticamente que se desarrollan rápidamente no se pueden separar del cultivo celular. La terapia génica y la terapia con células somáticas, que actualmente atraen mucha atención, sólo pueden lograrse mediante cultivos celulares. La ingeniería de fermentación y la ingeniería enzimática también están estrechamente relacionadas con el cultivo celular. En conclusión, el cultivo celular juega un papel clave en el desarrollo de toda la industria biotecnológica.
Sección 1 El concepto de cultivo in vitro
1. Concepto básico de cultivo in vitro El cultivo in vitro consiste en eliminar componentes estructurales vivos o individuos vivos del cuerpo humano o sus parásitos y colóquelos con un método que les permita crecer y desarrollarse en un entorno in vitro que sea similar al entorno de vida in vivo.
●Cultivo de tejidos: se refiere al método de extraer tejidos vivos (múltiples bloques de tejido) de organismos vivos y cultivarlos in vitro.
Cultivo celular: se refiere al método de cultivar células vivas (especialmente células dispersas) in vitro.
Cultivo de órganos: se refiere al método de extracción de órganos (generalmente órganos embrionarios), partes de órganos o primordios de órganos de organismos para cultivo in vitro.
2. La diferencia y diferenciación de las células in vivo e in vitro
1. Diferencia: Una vez aisladas las células, pierden la regulación de los fluidos neurohumorales y la interacción entre las células, y vivir en una falta de dinámica en un ambiente equilibrado y relativamente estable, es probable que ocurran los siguientes cambios con el tiempo: el fenómeno de diferenciación se debilita; la forma y la función tienden a ser únicas o declinar y morir después de un cierto período de vida; se transforman y adquieren la inmortalidad, convirtiéndose en líneas celulares continuas o células malignas que pueden crecer indefinidamente. Por lo tanto, las células en cultivo pueden considerarse como un tipo de población celular en condiciones específicas, que no solo mantienen la misma estructura y funciones básicas que las células del cuerpo, sino que también tienen algunas características que son diferentes de las células del cuerpo. De hecho, esta diferencia empezó a aparecer una vez que las células se cultivaron in vitro.
2. Diferenciación: La capacidad de diferenciación de las células cultivadas in vitro no se ha perdido por completo, pero el entorno ha cambiado y el rendimiento de la diferenciación celular es diferente al del cuerpo. Que las células se diferencien o no depende de si existen condiciones para la diferenciación celular. Por ejemplo, las células Friend (células de eritroleucemia de ratón) pueden sintetizar hemoglobina bajo ciertos factores, las células endoteliales vasculares pueden crecer hasta formar estructuras vasculares cuando se cultivan en una matriz similar a una membrana basal y las células de hibridoma pueden producir anticuerpos monoclonales específicos. comportamiento.
Sección 2: El proceso general del cultivo celular
1. La preparación para el cultivo celular es extremadamente importante y la carga de trabajo también es grande, por lo que se debe prestar suficiente atención. Cualquier descuido en cualquier aspecto de la preparación puede conducir al fracaso o fracaso del experimento. Los trabajos de preparación incluyen la limpieza, secado y desinfección de instrumentos, la preparación, envasado y esterilización de medios de cultivo y otros reactivos, la limpieza y desinfección de salas estériles o mesas ultralimpias, y la inspección y depuración de incubadoras y otros instrumentos.
2. El material se extrae del cuerpo en un ambiente estéril (dependiendo del propósito del experimento) y después de ciertos procesamientos (como digestión, dispersión, separación de células, etc.), está conectado a la sangre en la incubadora. Este proceso se llama recolección de material. En el caso de líneas celulares cultivadas en expansión, no existe ningún proceso para la toma del material. El primer cultivo de células tisulares extraídas del cuerpo se denomina cultivo primario.
En teoría, todos los tejidos de diversos animales y humanos pueden utilizarse para cultivo. De hecho, el tejido larvario (especialmente el tejido embrionario) es más fácil de cultivar que el tejido adulto, el tejido poco diferenciado es más fácil de cultivar que el tejido altamente diferenciado y el tejido tumoral es más fácil de cultivar que el tejido normal. Estos materiales deben eliminarse inmediatamente y cultivarse lo antes posible. Si por alguna razón no se puede cultivar inmediatamente, el bloque de tejido se puede cortar en trozos pequeños del tamaño de semillas de soja y almacenar en un medio de cultivo a 4°C. La extracción del tejido debe ser estrictamente estéril y evitar el contacto con otras sustancias nocivas.
Al extraer tejidos patológicos y células epiteliales de la piel y el tracto digestivo, es probable que se transporten bacterias. Se pueden utilizar antibióticos para reducir la contaminación.
En tercer lugar, el proceso de inocular las células de tejido obtenidas en frascos o placas de cultivo se denomina cultivo. En el caso del cultivo en bloque de tejido, conecte el bloque de tejido directamente al fondo del recipiente de cultivo. Después de unas horas, el bloque de tejido puede adherirse al fondo y luego se agrega el medio de cultivo. En el caso del cultivo celular, las células deben contarse antes de insertarlas en el recipiente de cultivo, se añade una determinada cantidad (expresada en células por mililitro) según sea necesario y se añade directamente el medio de cultivo. Después de que las células ingresan al recipiente de cultivo, se colocan inmediatamente en la incubadora para permitir que las células entren en estado de crecimiento lo antes posible.
Es necesario observar periódicamente las células en cultivo, incluso si las células están creciendo bien, si la forma es normal, si hay contaminación, si el valor del pH del medio de cultivo es demasiado ácido o demasiado alcalino (indicado por el indicador rojo fenol), cultivo La temperatura y la concentración de CO2 también deben controlarse periódicamente.
El cultivo primario generalmente tiene un período de incubación (que varía desde unas pocas horas hasta decenas de días), durante el cual las células generalmente no se dividen, pero pueden adherirse a la pared y nadar. Después del período de incubación, las células entran en la vigorosa fase de división y crecimiento. Una vez que las células crecen hasta el fondo de la botella, es necesario subcultivarlas. Una vez que las células se digieren y se suspenden en una botella, se deben dividir en dos o tres botellas para su posterior cultivo. Cada generación se llama "generación". Generalmente, las células diploides sólo pueden transmitirse durante decenas de generaciones, mientras que las líneas celulares transformadas o las líneas celulares pueden transmitirse indefinidamente. Las células transformadas pueden tener propiedades malignas o simplemente pueden estar inactivas y no ser malignas.
4. Criopreservación y recuperación (consulte los capítulos pertinentes a continuación) Para preservar las células, especialmente las células mutantes o líneas celulares que no son fáciles de obtener, las células deben congelarse. La temperatura de criopreservación es generalmente de -196°C en nitrógeno líquido. Las células se recogen en crioviales, se añade un medio que contiene un agente protector (normalmente dimetilsulfóxido o glicerol), se congelan a una cierta velocidad de enfriamiento y finalmente se almacenan en nitrógeno líquido. A temperaturas extremadamente bajas, las células pueden almacenarse durante un tiempo casi ilimitado. La recuperación generalmente utiliza el método de fusión rápida, es decir, después de sacar el criotubo del nitrógeno líquido, se coloca inmediatamente en agua a 37 °C para permitir que se derrita rápidamente en un minuto. Luego, las células se transfieren a recipientes de cultivo para su cultivo.
La elección del protector, la densidad celular, la velocidad de enfriamiento, la temperatura durante la recuperación y la velocidad de fusión tienen un impacto en la viabilidad celular.
5. Instrumentos y equipos de uso común: sala estéril, mesa de trabajo limpia, destilador triple de agua pura, bomba de aire, esterilizador de vapor a presión, incubadora eléctrica de temperatura constante, incubadora, incubadora de CO2, baño de agua a temperatura constante, microscopio invertido. , centrífuga, filtro estéril, dispositivo de lavado, tablero de conteo de células, instrumento electrónico de tecnología celular, etc.
Sección 3: Ambiente estéril para cultivo celular
Primero, la sala estéril
La estructura de la sala estéril: generalmente consta de un vestidor, un sala, un quirófano La sala consta de tres partes.
Desinfección y anticontaminación de salas estériles: Para mantener la esterilidad es necesaria una desinfección frecuente. Por lo general, se utiliza irradiación ultravioleta diaria (antes de su uso) (1-2 horas), fumigación semanal con formaldehído, ácido láctico y ácido peracético (2 horas) y limpieza y desinfección mensual con cloruro de benzalconio. En el trabajo real, se deben seleccionar métodos de desinfección adecuados en función de los diferentes materiales de construcción de la sala estéril.
Además, se debe prestar atención a evitar la contaminación de la sala estéril. Las posibles causas de la contaminación de la sala esterilizada incluyen: el aire enviado a la sala esterilizada no ha sido filtrado ni esterilizado; al entrar y salir de la sala esterilizada, el aire exterior puede fluir directamente hacia la sala de operaciones de la sala esterilizada, etc.
En segundo lugar, limpie el banco de trabajo
Principio de funcionamiento: el soplador impulsa el aire a purificar a través del filtro de alta eficiencia. El aire purificado sopla lentamente a través del espacio de la encimera, llevándose el aire. El polvo y el polvo. Las bacterias e incluso las partículas de virus crean un ambiente estéril en el área de trabajo. Según las diferentes direcciones del flujo de aire en el banco de trabajo limpio, el banco de trabajo limpio se puede dividir en tres tipos: tipo de flujo lateral, tipo de flujo directo y tipo de flujo de salida.
Uso y mantenimiento de la plataforma ultralimpia: la velocidad promedio del viento de la plataforma ultralimpia debe mantenerse entre 0,32 y 0,48 metros/segundo. Demasiado grande o demasiado pequeña no favorece el mantenimiento de la limpieza; Lo mejor es encender la plataforma ultralimpia antes de usarla. La lámpara ultravioleta de la mesa se irradia durante 10 a 30 minutos y luego se deja que la mesa ultralimpia funcione previamente durante 10 a 15 minutos para eliminar el ozono y usar. el espacio de la encimera en un estado limpio; después de su uso, limpie la encimera y sus alrededores con alcohol al 70% para garantizar la esterilidad de la encimera ultralimpia.
Y el banco limpio se fumiga periódicamente con formalina.
Sección 4: Recipientes de cultivo de uso común y limpieza y desinfección
El cultivo celular requiere una gran cantidad de consumibles, como cristalería, metal, plásticos, productos de caucho, tela, papel, etc. . , por lo que debemos dominar los conocimientos de limpieza y desinfección y aprender los métodos de limpieza y desinfección.
En primer lugar, en condiciones de limpieza fuera del cuerpo, las sustancias nocivas están en contacto directo con las células. Las células son muy sensibles a cualquier sustancia nociva y una cantidad muy pequeña de residuos puede producir efectos secundarios tóxicos en las células. Por lo tanto, los utensilios nuevos o reutilizados deben limpiarse cuidadosamente para cumplir con los requisitos de ausencia de residuos.
(1) La limpieza de la cristalería generalmente implica cuatro pasos: remojo, fregado, decapado y limpieza.
1. Remojo: La cristalería nueva o usada se debe remojar en agua limpia para ablandar y disolver los accesorios. La cristalería nueva se debe cepillar brevemente con agua del grifo antes de usarla y luego remojarla en ácido clorhídrico al 5% durante la noche. La cristalería usada suele ir acompañada de una gran cantidad de proteínas y grasas, que no son fáciles de lavar después del secado. en agua limpia y lavada inmediatamente después de su uso.
2. Cepillar: Introducir la cristalería empapada en el agua con detergente y cepillarla repetidamente con un cepillo suave. No quedan rincones muertos para evitar daños al acabado superficial del recipiente. Lave la cristalería limpia y séquela para encurtirla.
3. Remojo ácido: El remojo ácido consiste en remojar los utensilios antes mencionados en una solución limpiadora, también llamada líquido ácido. Mediante la fuerte oxidación del líquido ácido, se eliminan sustancias que pueden quedar en la superficie del mismo. Se retiran los utensilios. El remojo en ácido no debe durar menos de 6 horas, generalmente durante la noche o más. Tenga cuidado al manipular los platos.
4. Enjuague: Los envases después del cepillado y decapado deben enjuagarse completamente con agua. El hecho de que los utensilios se enjuaguen bien después del decapado afecta directamente el éxito o el fracaso del cultivo celular. Lave a mano los utensilios empapados en ácido. Cada recipiente debe "llenarse y vaciarse" repetidamente al menos 15 veces. Finalmente, enjuáguelo 2-3 veces con agua destilada espesa, séquelo o séquelo y luego empaquetelo para su uso posterior.
(2) Limpieza de productos de caucho
Nuevo método para lavar productos de caucho: hervir con 0,5 mol/L de NaOH durante 65438±05 minutos, lavar con agua corriente y hervir con 0,5 mol/L HCl durante 65438 ±05 minutos, lavar con agua corriente, hervir agua del grifo dos veces, hervir agua destilada durante 20 minutos, secar a 50°C para su uso posterior.
(3) Limpieza de productos plásticos
Características de los productos plásticos: suave y fácil de rayar; fuerte resistencia a la corrosión, pero no resistente al calor.
Procedimiento de limpieza: Lave los utensilios con agua limpia inmediatamente después de su uso, sumérjalos en agua del grifo durante la noche, frote con una gasa o hisopos de algodón y una solución limpiadora a 50 °C, enjuague con agua del grifo, seque y remoje en una solución limpiadora. durante 15 minutos, y utilizar Enjuague con agua del grifo (15-20 veces), remoje tres veces en agua destilada, doble vapor durante 24 horas, seque y reserve.
(4) Embalaje: Antes de la esterilización, los productos de cultivo celular deben empaquetarse herméticamente para facilitar la esterilización y el almacenamiento. Materiales de embalaje de uso común: papel kraft, papel de ácido sulfúrico, tela de algodón, loncheras de aluminio, placas de Petri grandes, etc. En los últimos años, los envases de papel de aluminio se han vuelto muy convenientes y aplicables. Placas de Petri, jeringas, instrumentos metálicos, etc. Envuélvalo en papel de estraza y colóquelo en la lonchera. Los aparatos más grandes se pueden vendar parcialmente.
Desinfección y esterilización La contaminación microbiana es la principal razón del fracaso del cultivo celular.
(1) Método de desinfección física
1. Desinfección ultravioleta: los rayos ultravioleta son un tipo de radiación electromagnética de baja energía que puede matar una variedad de microorganismos. Las bacterias gramnegativas son las más sensibles, seguidas de las bacterias positivas, seguidas de las esporas y las esporas de hongos son las más resistentes. El efecto directo de los rayos ultravioleta es inactivar los ácidos nucleicos y proteínas de los microorganismos, y el efecto indirecto es matar los microorganismos a través del ozono generado por la irradiación ultravioleta. La desinfección por irradiación directa de la sala de cultivo es sencilla y eficaz.
El efecto de desinfección de la lámpara ultravioleta está relacionado positivamente con la intensidad de la radiación y la dosis de irradiación de la lámpara ultravioleta. La intensidad de la radiación disminuye con el aumento de la distancia de la lámpara y la dosis de irradiación es proporcional al tiempo de irradiación. Por tanto, la distancia y el tiempo de exposición entre la lámpara UV y el objeto iluminado deben ser los adecuados. Una lámpara de 30W a 2 metros del suelo puede iluminar una habitación de 9 metros cuadrados durante 2-3 horas al día con un intervalo de 30 minutos. Cuando la lámpara está a 2 metros del suelo, el tiempo de iluminación debe ampliarse, y cuando está a 2,5 metros de distancia, el efecto de iluminación es deficiente. La distancia entre la lámpara UV y el banco de trabajo no debe exceder los 1,5 m y el tiempo de irradiación debe ser de 30 minutos.
La luz ultravioleta no solo es dañina para la piel y los ojos, sino que también tiene efectos adversos sobre las células cultivadas y los reactivos, por lo que no encienda la luz ultravioleta ni otras operaciones.
2. Esterilización por calor húmedo y alta temperatura: La esterilización por vapor a presión es el método de esterilización por calor húmedo y alta temperatura más utilizado. Tiene buena penetración en materiales biológicos y puede provocar la desnaturalización y solidificación de proteínas, provocando así la muerte de microorganismos. Con este método se pueden esterilizar paños, alimentos, cristalería, artículos de metal, pegamentos y algunas soluciones de cultivo.
El vapor con diferentes presiones alcanza diferentes temperaturas, y la presión de desinfección efectiva y el tiempo requerido para diferentes proyectos de desinfección también son diferentes. Los artículos esterilizados (excluidos los líquidos) que se sacan del esterilizador de vapor a presión deben secarse inmediatamente en un horno a 60-70 °C y luego almacenarse para su uso posterior; de lo contrario, la superficie de los artículos empaquetados húmedos se contaminará fácilmente con microorganismos. La desinfección por ebullición también es un método de desinfección por calor húmedo de uso común, que tiene las características de condiciones simples y fácil uso.
3. Desinfección por calor seco a alta temperatura: la desinfección por calor seco calienta principalmente los artículos en el horno eléctrico a más de 160 °C y lo mantiene durante 90-120 minutos para matar bacterias y esporas, logrando así la esterilización. Objetivo. Se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio (como vasos de precipitados y frascos de cultivo de gran volumen), recipientes metálicos y artículos que no pueden entrar en contacto con el vapor (como polvos y aceites).
Después de la esterilización por calor seco, apague el interruptor y enciéndalo gradualmente después de que los artículos se hayan enfriado. No lo encienda inmediatamente para evitar un cambio brusco de temperatura que pueda provocar que la cristalería de la caja se rompa. Debe haber espacios entre los artículos en la caja de secado y los artículos no deben estar cerca del dispositivo de calentamiento.
La quema es también uno de los métodos de esterilización. Los bordes de recipientes metálicos y cristalería a menudo se queman y esterilizan con la llama de una lámpara de alcohol sobre la mesa.
4. Filtración y esterilización: el líquido o el gas se filtra a través de una membrana de filtro microporosa para interceptar partículas microbianas, como bacterias, que son más grandes que el tamaño de los poros, logrando así el propósito de la esterilización. En el cultivo in vitro, la esterilización por filtro se utiliza principalmente para reactivos o fluidos de cultivo que se desnaturalizan fácilmente con el calor. Actualmente, la mayoría de los laboratorios utilizan filtros de membrana microporosa para esterilizar bacterias. Los pasos clave son la instalación de la membrana filtrante y el proceso de filtración estéril.
(2) Desinfección química: nueva y limpia, su solución acuosa 0,1 se puede limpiar y remojar para desinfectar instrumentos, piel y superficies operativas.
(3) Desinfección con antibióticos: los antibióticos se utilizan principalmente para la desinfección del líquido de cultivo. Son un medio importante para prevenir la contaminación microbiana durante el proceso de cultivo y también son un método de "primeros auxilios" cuando no hay contaminación microbiana. grave. Diferentes antibióticos matan diferentes microorganismos y deben seleccionarse según las necesidades.
Existen muchos métodos de desinfección y esterilización que se pueden utilizar para el cultivo celular, pero cada método tiene un determinado ámbito de aplicación. Por ejemplo, los sistemas de esterilización por filtración de uso común, la irradiación ultravioleta, las lámparas germicidas electrónicas, el ácido láctico, la fumigación con formaldehído y otros métodos se utilizan para desinfectar el aire del laboratorio. Se utilizan nuevos detergentes para desinfectar los pisos del laboratorio. Los métodos comunes incluyen calor seco, remojo desinfectante con calor húmedo; , Esterilizar los utensilios de cultivo mediante irradiación ultravioleta, etc.; esterilizar el líquido de cultivo mediante esterilización con vapor a alta presión o esterilización por filtro.