Normalmente los experimentos no funcionan | Hice el experimento con éxito.
1. Al extraer el plásmido, el alcohol en el último paso. La volatilización es importante y es básicamente el factor determinante en su posterior reacción digestiva. Por lo tanto, este paso debe tardar el mayor tiempo posible en evaporarse. Lo mejor es utilizar aire caliente de un aire acondicionado o colocarlo en una incubadora a 37 grados durante un tiempo prolongado. Intenté dejarlo a temperatura ambiente durante la noche y la enzima se digirió bien.
2. Configuración de la solución tampón y el medio de cultivo
1) Convierta cada componente de la fórmula de la solución tampón en una solución madre en una proporción de 10 a 100 para su almacenamiento. Simplemente mezcle y diluya las aguas madres correspondientes con agua.
2) A la hora de preparar medios de cultivo, muchas veces se olvida la dosificación de cada componente. Por ejemplo, al preparar LB, no puede recordar cuál de los tres ingredientes tiene 5 gy cuál 10, por lo que la cantidad requerida puede indicarse en la etiqueta de una botella de reactivo de uso común. Por ejemplo, al preparar LB, el exterior de la botella de NaCl debe estar marcado con 10 g/L, LEVADURA 5 G/L, TRYTON 10 g/L, etc.
3. En cuanto a la configuración de la solución de reacción principal de PCR:
Al realizar la identificación de clones, a menudo es necesario realizar primero la identificación por PCR y luego realizar la identificación de digestión enzimática. Preparar la solución de reacción de PCR cada vez es complicado. Puede configurarlo en un formato similar a un kit de acuerdo con la lista del sistema de reacción que necesita y luego configurar la solución de reacción principal (100 veces). La solución de reacción principal contiene tampón, Mg2++ y dNTP, pero no contiene cebadores ni Taq. Luego se puede envasar a 10× o almacenar en un tubo de ensayo a -20°C, si es necesario, sacar y descongelar, luego absorber el múltiplo correspondiente según el número requerido de reacciones de PCR, luego agregar Taq y cebadores con el correspondiente. reacción múltiple, mezclar y envasar. Las ventajas de hacer esto son las siguientes:
1) Puede ahorrar mucho tiempo valioso y puedes dar por terminado el día y ver el juego.
2) Evite la posibilidad de una carga desigual de la muestra para cada reacción.
Los falsos positivos de la PCR se reducen mucho.
4. Configuración de la solución de reacción para digestión enzimática:
Al realizar digestión enzimática, la solución de reacción principal también se puede configurar como PCR. Antes de cada reacción, enumere el sistema de reacción y calcule el número de reacciones requeridas. Luego, de acuerdo con el sistema de reacción requerido, amplificar el número requerido de reacciones y agregar tampón, enzima y agua. La columna de plásmido está vacía y luego se mezcla y se divide en alícuotas de acuerdo con el volumen excepto el ADN del plásmido, y luego se agrega el volumen correspondiente de ADN del plásmido a cada tubo de ensayo para la digestión enzimática. Las ventajas de este método son las siguientes, especialmente cuando hay 10 clones positivos a identificar al mismo tiempo:
1) Los componentes de la reacción son uniformes.
2) Se puede reducir considerablemente el uso de enzimas de restricción.
3) Ahorra tiempo
5. Para determinar si la proteína se expresa en el intestino grueso, generalmente es necesario cocinar la muestra antes y después de la inducción, pero en muchos casos el La muestra después de la cocción es pegajosa. Afecta el efecto de funcionamiento del gel. Descubrí que si resuspendo las bacterias en 8 urea antes de cocinar, los resultados mejoran enormemente.
Nota: En su lugar no se puede utilizar clorhidrato de galio.
6. La ultrafiltración es más adecuada para la concentración de proteínas, la sustitución del tampón y la desalinización, pero el efecto de la separación preliminar por peso molecular no es muy bueno y existe una gran diferencia entre la teoría y la realidad.
7. A veces cuando queremos precipitar algo, debido a que la cantidad de precipitación es muy pequeña, no sabemos si algo ha precipitado después de la centrifugación, por lo que se recomienda poner el tubo de centrífuga en un recipiente específico. dirección durante la centrifugación (por ejemplo, coloque las tapas de los tubos EP en la misma dirección) para que pueda determinar la ubicación aproximada del sedimento antes de la centrifugación. Además, al observar las precipitaciones, se puede mirar la luz, de modo que se pueden ver incluso precipitaciones granulares finas.
8. Todo el mundo sabe que el PMSF es altamente tóxico. En el pasado, calculábamos cuántos miligramos de PMSF debíamos pesar basándonos en conocer la concentración y el volumen a preparar. De hecho, también podemos pesar primero el PMSF y luego ajustar el volumen de alcohol isopropílico para lograr la concentración deseada. Esto evitará que usted esté expuesto a él durante largos periodos de tiempo. (En otras palabras, puede cambiar el volumen del disolvente para que coincida con la masa, de modo que la concentración final permanezca sin cambios).
9 Cuando se añaden muestras a una placa de enzimas, las muestras de proteínas suelen producir una gran cantidad. de burbujas.
Al realizar experimentos de fluorescencia, debido a que la sensibilidad es muy alta, las burbujas pequeñas tendrán un gran impacto. Agregar un agente antiespumante a menudo no es suficiente, así que uso papel higiénico y lo arranco.
Toma un trozo pequeño y enróllalo hasta formar una aguja pequeña. Las burbujas estallarán cuando lo toquen. (El ama de llaves recomienda que también prepare una aguja pequeña. Caliéntela ligeramente con un encendedor y las burbujas explotarán al tocarla. Generalmente, puede frotar varias agujas a la vez. Si el sistema se puede centrifugar, la centrifugación instantánea es la mejor. .) 10. Mezcle el sistema de digestión enzimática o PCR. Finalmente, todos golpearán el fondo del tubo EP con los dedos para mezclar la solución de manera uniforme y, a menudo, aparecerán muchas burbujas. En este momento, es fácil eliminar las burbujas moviendo la pared del tubo por encima del nivel del líquido. Nunca rebote debajo de la superficie del líquido, ya que las burbujas aumentarán.
11. Al recuperar perlas magnéticas, no seas codicioso y recoge sólo la capa superior. Esto tendrá un gran impacto en la pureza y calidad del ADN, así como en el enlace y la transformación.
12. Varios tampones deben derretirse completamente antes de su uso, y no importa qué tipo de medicamento, si solo queda el último trozo, será mejor que lo abandones, porque puede afectar tu experimento.
13. Antes de empezar, debes pensar con claridad e intentar enumerar lo que quieres hacer.
14. Asegúrate de escribir 1, 2, 3... Toma notas antes de hacerlo y luego sigue las notas paso a paso, de lo contrario cometerás errores fácilmente. El hermano Guan quiere decir, hermanos y hermanas menores, por favor hagan lo mejor que puedan, jaja.
15. Enzimas, dNTPs, agua, etc. Lo mejor es volver a empaquetar si es posible. Si se contamina, se acabó todo. (El hermano Butler me recordó que esto es muy importante).
16. Se ha preparado un lote de células competentes y es mejor transformarlas inmediatamente en un plásmido conocido. Al mismo tiempo, se inoculó una pequeña cantidad de células competentes en un medio sólido/líquido que contenía resistencia y se cultivaron como control. De esta forma, al día siguiente se podrá saber si hay plásmido exógeno en este lote de células competentes, y también se podrá conocer la eficiencia de transformación de este lote de células competentes. Si está calificado, ¡puede usarlo con confianza en el futuro!
17. Al realizar el manchado de clonación, primero podemos poner un palillo teñido con bacterias en un plato con la resistencia correspondiente, luego tirarlo al tubo de ensayo, marcarlo y luego incubarlo un rato. hasta que se convierta en una colonia más grande antes de recolectarla. Qué bacterias necesitarás en el futuro, simplemente recógelas del plato. Esto es conveniente y rápido, y también asegura la consistencia de las bacterias.
18. Al extraer el plásmido, se deben agregar SloutionII y III y mezclar suavemente. Personalmente no creo que sea necesario, mientras no sea muy intenso puedes mezclarlo rápidamente. En particular, se pueden extraer varios plásmidos a la vez, lo cual es rápido y el efecto no es nada malo.
19. Al extraer el plásmido, el operador experimental puede determinar el tiempo de precipitación con etanol absoluto. Si el tiempo es suficiente, puede ser de 30 minutos, o de 8 a 10 minutos. En cuanto a la temperatura, personalmente creo que -20 grados es mejor que la temperatura normal. Si se añade acetato de sodio, será más fácil que se formen impurezas de sal, por lo que cuanto más corto sea el tiempo, ¡mejor!
20. No sé cómo hace todo el mundo la digestión enzimática. Mi experiencia es que al digerir plásmidos, el efecto de la digestión monoenzimática con dos enzimas es mucho mejor que el efecto de la digestión directa con dos enzimas (el ama de llaves recuerda que esto depende del sistema). Una vez utilicé digestión con doble enzima y la conexión falló dos veces. Más tarde, utilicé un corte de una sola enzima paso a paso y la eficiencia de la ligadura fue casi del 100%.
Después de digerir la primera enzima, el sistema se puede inactivar directamente con calor (de acuerdo con las instrucciones de la enzima, generalmente a 65 grados durante 20 minutos) y luego se puede agregar la segunda enzima directamente.
O cortar el primero y extraerlo con cloroformo para extraer la proteína.
O hacer una recuperación en el medio. Esto tendrá en cuenta la eficiencia de la recuperación y la pérdida, pero esta es la forma más completa de eliminar proteínas.
21. La congelación y descongelación repetida de cualquier reactivo tiene un gran impacto en su eficacia. Por lo tanto, al utilizar por primera vez los reactivos adquiridos, preste atención al embalaje y almacenamiento de acuerdo con la dosis para cada experimento. Las plantillas extraídas o las muestras purificadas también deben almacenarse por separado para evitar accidentes.
Entre los comentarios de todos, el más complicado es sobre la electroforesis de proteínas (La profunda responsabilidad del amor), que el ama de llaves enumeró por separado:
1 Cuando utilice el gel, use bajo voltaje. para ejecutarlo, lo que puede evitar que el calor generado por el alto voltaje cause la deformación de la capa adhesiva. Las vías de natación de baja presión corren más rectas que las de alta presión y tienen mayores efectos de separación, lo que es beneficioso para la separación de proteínas con pesos moleculares similares.
2. Al realizar WESTERNBLOT, las personas suelen explorar la concentración, el tiempo de bloqueo, el tiempo de exposición, etc. de los anticuerpos primarios y secundarios.
, y cada vez que se cambia una condición, es necesario volver a ejecutar el gel, transferir la membrana o incluso extraer nuevamente la proteína, lo que desperdiciará mucho.
Tiempo. De hecho, esto es completamente innecesario. Después de la primera transferencia de la membrana, la membrana de PVDF se seca, se corta en trozos pequeños, se almacena y se retira cuando se utiliza sin ningún impacto. Esto ahorra mucho tiempo a los camaradas que están explorando las condiciones.
3. El gel de laminación y el gel de separación de SDS-PAGE se pueden preparar en grandes volúmenes, como 100 ml, y almacenarse en un refrigerador a 4 grados (nota: 10% AP, no se agrega TEMED, ¡¡¡Recuerde!!!), cada vez que realice la configuración, solo necesita agregar el volumen correspondiente de gel prefabricado a AP y TEMED, lo cual es particularmente conveniente para la clonación molecular cada vez que prepare el gel. Y este tipo de pegamento preformado se puede almacenar durante más de medio año, lo cual es una excelente manera de ser perezoso. Más importante aún, la exposición a la acrilamida se puede reducir considerablemente, reduciendo así en gran medida la posibilidad de intoxicación.
4. Aunque el efecto de separación de la electroforesis pequeña es mejor durante la electroforesis, el tiempo de espera de más de 2 horas es realmente doloroso, por lo que la electroforesis se puede aumentar a 150 V, pero es necesario limpiar todo el tanque de electroforesis. lleno de El calor se disipa en un recipiente con agua helada, de modo que el efecto de separación del pegamento que se escapa no es peor que el de bajo voltaje. La clave es ahorrar mucho tiempo y podrás ver los resultados en menos de 1 hora.
5. Al hacer SDS-PAGE, además de la misma cantidad de proteína, lo mejor es tener el mismo volumen, para que las bandas entre las calles de gel puedan tener el mismo ancho, lo que facilita después. comparación, especialmente WB. La forma de hacerlo es utilizar un buffer de muestra 1X para completar el mismo volumen de muestra que se va a agregar; de lo contrario, será más ancho y más estrecho, especialmente si el volumen de muestra es muy diferente.
6. Cuando el pegamento proteico se convierte en pegamento seco, a menudo se agrieta debido a las burbujas de aire. Mi experiencia es que antes de poner el film hay que añadir más agua al pegamento para evitar que se formen burbujas con facilidad. También se puede hornear a alta temperatura (el ama de llaves le recuerda que debe usarlo con precaución). A mí me gusta meterlo en el horno a 60 grados, para que el agua se evapore rápido y aunque queden algunas pequeñas burbujas no le afectará. Jaja, esta es mi experiencia, nunca me la he perdido.
7 Hoy en día, SDS-PAGE se utiliza generalmente para aplicar el pegamento, pero el pegamento tarda más de 1 hora, por lo que si quieres dormir al día siguiente sin retrasar el funcionamiento del pegamento, puedes concentrarte en. separando el pegamento la noche anterior. Después de la solidificación, no saque el peine, saque la placa de vidrio pegada del tanque de fabricación de pegamento y envuélvala en una envoltura de plástico. Tenga en cuenta que habrá gas en los bordes superior e inferior de la placa de vidrio y deberá agregar un poco de tampón de electroforesis para evitar que el agua del pegamento se evapore. Luego déjalo reposar durante 4 horas. Saque el peine directamente para realizar un seguimiento al día siguiente. Muchas empresas extranjeras.
8. Al preparar gel de separación o gel no desnaturalizante, la contracción durante la gelificación puede provocar orificios de inyección menos profundos. Puede poner pegamento residual a 4 grados Celsius para reducir la velocidad de coagulación, poner gel a 37 grados Celsius para promover la polimerización y usar pegamento residual a 4 grados Celsius para reponer la superficie del pegamento perdido en cualquier momento.
9. Al hacer una película de transferencia Westernblotting, coloque el pegamento en el tampón de la película de transferencia durante un período de tiempo. Después de que el pegamento casi se haya encogido en el tampón que contiene metanol, instale el dispositivo de modificación de la película. Mi experiencia es que es muy conveniente imprimir la película sobre el pegamento y dibujar las tiras maker preteñidas directamente sobre la película. Porque muchas veces, cuando se realiza electroforesis, la marca preteñida en el pegamento es muy clara, pero no queda clara después de la transferencia. Sin embargo, cabe señalar que una vez pintadas las piezas preteñidas, el pegamento y la película no deben moverse en la dirección opuesta para evitar que las piezas pierdan su valor de referencia.
10. La limpieza de los aparatos eléctricos es muy importante. Antes de comenzar, por razones de seguridad, especialmente las placas de vidrio gruesas y delgadas llenas de pegamento, puede enjuagarlas repetidamente con detergente neutro y agua del grifo para asegurarse de que no queden residuos de lavado, luego enjuágalas con agua destilada 2-3 veces y luego enjuáguelos con agua desionizada nuevamente. Finalmente, límpialo nuevamente con alcohol al 95% y déjalo secar para su uso posterior.
11. Lo mejor es preparar el pegamento ahora. Preparar primero el gel inferior (gel separador) y luego el gel superior (gel concentrador o gel laminador). Antes de verter el gel añadir APS y mezclar rápidamente, es decir, pipetear 1-2 veces. (El ama de llaves recuerda que es mejor usarlo ahora si es posible. Si está equipado con un plato, es mejor usarlo lo antes posible dentro de 2 días y prestar atención a sellar la envoltura de plástico).
12. Al ejecutar la página de proteínas, al principio es demasiado problemático usar una aguja de muestra. Me resultó muy conveniente utilizar una pistola de 20ul + una pistola blanca normal para tomar muestras. Además, es posible que no puedas ver dónde están los agujeros cuando pides la muestra. Mirando el pegamento desde lejos, los pequeños agujeros reflejan la luz. Al manchar, coloque el punto de pegamento frente a usted, eliminando así la necesidad de hacer una reverencia total. Las personas de nuestra profesión son propensas a la espondilosis cervical. Cuídate.
13. En la electroforesis vertical, el vial de penicilina se puede colocar en el tanque de electroforesis para aumentar naturalmente el nivel del líquido y ahorrar tampón de electroforesis sin afectar la electroforesis. (Los hermanos Guan no lo han probado, así que úselo con precaución).
14. No mezcle la pistola repetidamente, solo agítela un poco. Mezclar la pistola varias veces provocará una gelificación deficiente y afectará la resolución del patrón de electroforesis.
15. Dividir AP en 500 microlitros y guardarlo en un tubo de ensayo a -20 grados para evitar fallos de AP después de un uso prolongado.
16. Al verter pegamento, use papel de filtro para absorber el agua en la placa de vidrio tanto como sea posible, porque la presencia de trazas de agua afectará la concentración de pegamento.
17. No es necesario hacer palanca en la placa de pegamento después de la electroforesis. Coloque agua en un plato plano y agite el lado del pegamento en el agua unas cuantas veces.
El pegamento secundario es fácil de despegar, no supone ningún problema y es muy práctico.
18. No olvide centrifugar la muestra al tomar la muestra, ya que la precipitación sólida en la muestra afectará la resolución del patrón de electroforesis.
¡Eso es todo por hoy! Si desea saber más sobre el experimento, envíe un mensaje privado al autor. Recientemente se está recopilando una colección de experimentos de biología celular, así que estad atentos.