¿Cuáles son los métodos comunes para conservar cepas bacterianas?
En general, la especie madre tiene un tiempo de almacenamiento prolongado y la especie original tiene un tiempo de almacenamiento corto. Es necesario garantizar que las características y vitalidad de las cepas excelentes no muten, mueran o se contaminen y se garantice su pureza. Por lo tanto, el método de conservación debe tener las ventajas de materiales fácilmente disponibles, fácil operación, difícil degradación bacteriana y ausencia de contaminación bacteriana después de un almacenamiento prolongado. Los métodos comúnmente utilizados para conservar cepas bacterianas son los siguientes:
(1) Las ventajas de este método son que es fácil de conservar y ocupa poco espacio. El método específico es: después de cubrir el micelio con una pendiente, guárdelo a 0 ~ 5 ℃. Después de eso, la sonda se transferirá cada cierto período de tiempo (2 a 3 meses). El medio de cultivo PDA no se puede almacenar en tubos giratorios durante mucho tiempo; de lo contrario, las especies se degradarán fácilmente y se debilitará la capacidad de Grifola Grifola para degradar la lignocelulosa. Por lo tanto, de vez en cuando (aproximadamente 1 año), las bacterias deben transferirse al medio de aserrín para su rejuvenecimiento, y luego el micelio sano y libre de contaminación debe seleccionarse y transferirse nuevamente al medio PDA para su almacenamiento. Durante el almacenamiento prolongado, es necesario evitar que el tampón se humedezca y genere bacterias. Lo mejor es sellar la boca del tubo de ensayo con cera para evitar que el agua del medio de cultivo se evapore demasiado rápido. Aumentar la cantidad de agar (2,5% ~ 3%) puede ralentizar la evaporación del agua. También es necesario evitar que la etiqueta del tubo de cepa se caiga, provocando que las bacterias se mezclen.
El método de criopreservación inclinada es sencillo y fácil de implementar, pudiendo observarse en cualquier momento la vitalidad y pureza de las cepas conservadas. Una vez contaminado, se puede detectar a tiempo a simple vista.
(2) Preservación de la matriz natural Este método se basa en las características de Grifola Grifola y utiliza una matriz natural para preservar la cepa Grifola Grifola. Grifola frondosa es un hongo que pudre la madera y su medio de cultivo utiliza aserrín como material principal. La matriz natural es rica en nutrientes, y la mayoría de ellos son nutrientes de liberación lenta, que no son propensos a la sobrenutrición o al hambre. En segundo lugar, las propiedades físicas y químicas del medio de cultivo son buenas y pueden absorber o amortiguar sustancias nocivas metabolizadas. por micelio. La humedad y la ventilación están coordinadas y equilibradas, y parte del micelio crece en la matriz y no está expuesta al aire, por lo que la intensidad de la respiración del micelio es baja y la vitalidad es fuerte.
1. La proporción entre materia prima y serrín grueso y fino es la adecuada, siendo la mejor el serrín de castaño. El tamaño de las partículas de las astillas de madera gruesas es de aproximadamente 2 mm, y las astillas de madera finas son generalmente astillas de madera en forma de disco. La proporción entre astillas de madera gruesas y finas es de 1:2. Agregue salvado de trigo y azúcar que representan el 20% y el 1% del aserrín seco, y el contenido de humedad es aproximadamente del 60%. Este tipo de matriz tiene buena permeabilidad al aire, rica nutrición y las hifas tardan mucho en descomponerse y utilizarse. Las hifas que crecen dentro de la matriz son más tolerantes que las hifas envueltas fuera de la matriz y expuestas al aire. Las proporciones adecuadas de matrices de diferentes tamaños de partículas también pueden coordinar el conflicto aire-agua. Hay demasiados granos gruesos y micelio superior; demasiados granos finos, poca permeabilidad al aire y crecimiento micelial lento. La fórmula de aplicación es la siguiente:
Poner 78% serrín de castaño, 20% salvado de trigo, 1% yeso, 1% sacarosa y 65% agua en un tubo de ensayo relativamente grande, con una capacidad de carga de 1/ Tubos de ensayo de 3 ~ 1/2, 1,5 kg/cm2 para esterilización. Después de enfriar, inocular la cepa bacteriana a conservar y cultivarla a 28°C. Cuando el micelio esté cubierto con el medio de cultivo de aserrín, sacarlo y ponerle un tapón de goma esterilizado y guardarlo en nevera entre 0 y 5. °C durante 1 a 2 años.
2. El recipiente y volumen debe ser un frasco de vidrio de glucosa con una capacidad de 250 ml. Se debe limpiar y el volumen generalmente no debe exceder los 3/5 de la capacidad del frasco de vidrio. El relleno no debe estar demasiado lleno y las partículas restantes en la pared de la botella deben limpiarse con un paño; de lo contrario, las bacterias almacenadas causarán contaminación fácilmente.
3. Si se utilizan tapones de algodón para la esterilización o esterilización por refrigeración, la capa superficial del sustrato perderá agua fácilmente y la tasa de supervivencia de la inoculación será baja. Incluso si se revive el micelio, el crecimiento es muy lento. Por lo tanto, es mejor sellar con película de polipropileno, usar tapones de algodón esterilizados para el cultivo después de la inoculación y usar tapones de goma estériles perforados para almacenar en el refrigerador una vez que el micelio esté lleno.
Después de tres años de almacenamiento de las cepas conservadas mediante el método anterior, la tasa de supervivencia es superior al 90% y no hay cambios evidentes en el rendimiento verificado de los hongos ni en las características morfológicas de la fructificación. cuerpos. Por lo tanto, la presente invención tiene las características de un largo período de almacenamiento y propiedades genéticas relativamente estables de la cepa.
(3) Grifola frondosa conservada en ladera de partículas de madera PDA tiende a aparecer en las raíces de los castaños en su estado natural, lo que indica que sus necesidades nutricionales son más especiales. Según los hábitos de Grifola Grifola, agregue una cantidad adecuada de partículas de castaña al PDA para preparar un medio de cultivo de semillas madre.
Después de años de uso, se ha descubierto que las semillas madre cultivadas en este medio tienen un buen potencial de crecimiento, una gran adaptabilidad y una rápida germinación y colonización cuando se transfieren las semillas originales. Cuando se utiliza como matriz para la conservación de cepas bacterianas, el tiempo de conservación es prolongado y se pueden mantener bien las excelentes características de la cepa bacteriana.
1. El PDA de madera está hecho de albura de castaño, se procesa en partículas de 0,3 ~ 0,5 cm y se seca o se seca al sol a tiempo para su uso posterior. Pesar 10 g de glucosa, 1 g y 1 g de KH2PO4 y disolverlos en 1 litro de agua para obtener una solución nutritiva. Vierta la solución nutritiva en una pequeña olla de aluminio llena de aserrín. La solución nutritiva debe sumergir completamente el aserrín. Hervir durante 10 minutos para acelerar la absorción de la solución nutritiva por parte de los pellets de madera y dejar que los pellets de madera absorban la solución nutritiva durante 30 minutos. Saque las partículas de madera, drene la humedad de la superficie y colóquelas en un tubo de ensayo. La capacidad de carga es 1/6 de la longitud del tubo de ensayo y no excederá 1/5 de la longitud del tubo de ensayo. De lo contrario, no será fácil dispersar las partículas de madera uniformemente sobre la superficie del bisel al realizar el bisel.
Seleccionar patatas frescas, pelarlas y cortarlas en rodajas finas, pesar 200 gramos en una cacerola pequeña de aluminio, añadir 1 litro de agua, cocinar a fuego lento durante 30 minutos, filtrar en caliente y completar hasta 1 litro de volumen. . Pesar 20 g de agar, 20 g de glucosa, kh2po 4 2 g, mgso 47 H2O 2 2 g. Primero corta el agar en trozos, agrégalo al filtrado de patata y continúa calentando a fuego lento para disolver el agar. Después de que el agar esté completamente disuelto, agregue los otros tres nutrientes pesados, revuelva para disolver estas sustancias de manera uniforme, póngalo en un tubo de ensayo con un bloque de madera mientras esté caliente, colóquelo a 1/3 de la longitud del tubo de ensayo, y conéctelo firmemente con un tapón de algodón.
Presión de vapor 0,8 ~ 1 kg/cm ~ 2 esterilizaciones durante 40 minutos. Cuando la presión del vapor baje a 0, abre la tapa y sácala. Agite suavemente el tubo de ensayo mientras esté caliente para dispersar las partículas de madera y colóquelo sobre una superficie inclinada. Después del curado, se puede fabricar un medio PDA para pellets de madera.
2. Efecto de crecimiento y conservación: el micelio de Grifola frondosa cultivado en la pendiente PDA de partículas de madera crece rápidamente y bien. El tubo de ensayo puede estar lleno en 12 días, pero el micelio crecerá más robusto y denso en. el último período., suficiente resistencia. Cuando se transfiere a la especie original, esta cepa tiene una gran adaptabilidad y una rápida colonización. Esto muestra que la tasa de crecimiento y el potencial de crecimiento del micelio de Grifola Grifola no solo dependen de su propia genética, sino que también dependen en gran medida de la nutrición del medio de cultivo. Los nutrientes del PDA convencional son principalmente nutrientes solubles de acción rápida. Son ricos en nutrientes en la etapa inicial y pueden usarse directamente. Por lo tanto, las hifas crecen rápida y bien en la etapa inicial, pero son insuficientes en la etapa posterior. en un pobre crecimiento de hifas y un crecimiento pobre. Dado que los nutrientes de acción lenta de las partículas de madera se agregan al PDA de partículas de madera, en lo que respecta a la flor del fresno podrido de la madera, la compatibilidad nutricional es razonable y complementa los nutrientes necesarios para la etapa posterior del crecimiento del micelio, por lo que tiene suficiente resistencia.
La matriz es descompuesta y utilizada por el micelio a través de las enzimas extracelulares secretadas por las células del micelio, para luego ser absorbida y utilizada. La mayoría de estas enzimas extracelulares son enzimas inducibles, y su síntesis y secreción están reguladas por mecanismos de inducción de matriz y represión de productos de descomposición. En lo que respecta a la celulasa, muchas fuentes de carbono metabolizables (como la glucosa, etc.) pueden inhibir la síntesis de enzimas. Al mismo tiempo, con el crecimiento vigoroso del micelio, se produce una gran cantidad de síntesis de enzimas después de que la fuente de carbono metabolizable se agota básicamente y es inducida por la matriz de celulosa. Desde la matriz PDA convencional hasta la etapa posterior, cuando las fuentes de carbono metabolizables, como la glucosa, se agotan básicamente debido a la deficiencia de nutrientes, la función fisiológica del micelio disminuye y la cantidad de síntesis de enzimas disminuye. El PDA de pellets de madera no solo contiene glucosa, una fuente de carbono fácilmente metabolizable, sino que también contiene nutrientes de acción lenta provenientes de los pellets de madera. La glucosa en la etapa inicial promueve el crecimiento vigoroso de las hifas y obtiene una gran cantidad de hifas, que se manifiesta como hifas espesas y espesas. En las etapas posteriores, cuando se agotan las fuentes de carbono fácilmente metabolizables, las partículas de madera, por un lado, complementan los nutrientes necesarios en el período posterior para mantener el crecimiento del micelio y las funciones de entierro en un cierto nivel, por otro lado, la celulosa de las partículas de madera activa el micelio; El mecanismo de inducción de la celulasa de tamaño mediano sintetiza una gran cantidad de enzimas y mantiene la fuerte capacidad de descomposición de la madera de la Grifola frondosa saprofita. Por lo tanto, las especies madre cultivadas en este medio tienen una gran adaptabilidad y pueden germinar y colonizar rápidamente cuando se transfiere la especie original. Debido a que parte del micelio crece dentro de las partículas de madera, se mejora la capacidad de sobrevivir en ambientes adversos y el germoplasma no se degrada fácilmente. Después de que las especies de aserrín Grifola se almacenaron a una temperatura de 0 a 5 °C durante 2 a 3 años, se transfirieron a tubos de ensayo para su activación y la tasa de supervivencia aún era de alrededor del 90%. Además, la aplicación de PDA de partículas de madera en la purificación y rejuvenecimiento de las semillas de flores de fresno podridas de madera también es ideal.
(4) El método específico de conservación de parafina con aislamiento de oxígeno es poner parafina líquida en un matraz Erlenmeyer, cuya cantidad es 1/3 del espacio de la botella, taparlo con un tapón de algodón, y esterilizarlo a 121°C durante 2 horas luego ponerlo en una incubadora a 40°C para evaporar el agua, o ponerlo en un desecador para que se seque durante varios días para eliminar el agua.
En condiciones estériles, coloque una pajita estéril en un tubo de ensayo inclinado con micelio de modo que el nivel del líquido sea aproximadamente 65.438 ± 0 cm más alto que la parte superior de la superficie inclinada. Coloque un tapón de goma esterilizado encima y guárdelo verticalmente. Este método puede mantener viva la cepa durante más de 3 años, pero es mejor trasplantarla cada 1 o 2 años. No es necesario verter parafina al trasplantar, basta con utilizar un gancho de inoculación para tomar un trozo de micelio. Debido a la parafina en la transferencia, el crecimiento micelial es débil y es necesario rotarlo 1 o 2 veces para rejuvenecer.