¿Es grave el citomegalovirus?
La infección por citomegalovirus está muy extendida en la población y puede provocar lesiones en órganos y tejidos de todo el cuerpo, provocando graves daños a fetos y lactantes, e incluso la muerte, pudiendo estar relacionada con la aparición de tumores malignos como el cáncer de cuello uterino. Por lo tanto, es importante comprender el CMV y prevenir activamente la infección por CMV.
[Patología]
[Patógeno]
El CMV, también conocido como virus de las glándulas salivales, pertenece a la subfamilia Herpesvirinae y es el virus más grande del herpes humano. grupo de virus. Está compuesto por ADN lineal bicatenario y tiene un peso molecular de aproximadamente 150X106. Su forma consta de 162 capsómeros y un icosaedro regular. Tiene una estructura típica del virus del herpes. La morfología es muy similar a la del virus del herpes simple y al virus de la varicela-zoster, lo que dificulta su distinción.
El CMV sólo puede proliferar en cultivos de tejidos de fibroblastos humanos, pero no en otras células animales. Prolifera muy lentamente, con un ciclo de replicación de 36 a 48 horas, mucho más largo que las 8 horas del virus del herpes simple (VHS). Se necesita más de un mes para que la primera separación produzca células especiales; las células se vuelven redondas e hinchadas, las células y los núcleos se agrandan y aparece un círculo en forma de "halo" de grandes inclusiones eosinófilas alrededor del núcleo. Las células diana del cuerpo son principalmente células epiteliales. Existe una amplia reactividad cruzada entre las cepas de citomegalovirus humanos.
El CMV puede sobrevivir en 20 éter hasta 2 horas. Cuando el pH es lt5 se puede inactivar completamente colocándolo a 56°C durante 30 minutos o irradiándolo con luz ultravioleta durante 5 minutos. La infectividad del CMV es inestable al congelarse y descongelarse o almacenarse a -20°C o -50°C en polvo blanqueador doméstico al 10% puede reducir significativamente su infectividad.
La infección por CMV se caracteriza por la aparición de células gigantes con contenido citoplasmático y nuclear típico, por lo que también se denomina citomegalovirus. Los mastocitos pueden formarse en los tejidos humanos, provocando la enfermedad de inclusión de células gigantes.
Patogenia
Después de la infección inicial, el CMV existirá en las células huésped en estado latente de forma indefinida. Puede involucrar una variedad de tejidos y órganos. Las autopsias sugieren que los pulmones, el hígado, el páncreas, las glándulas salivales, el sistema nervioso central y los intestinos también pueden ser sitios potenciales donde el virus permanece latente. La gravedad de la infección congénita está relacionada con la falta de capacidad para producir anticuerpos precipitantes y respuestas de células T al CMV. Después de la infección por CMV en niños y adultos, aparecen linfocitos T activados con un fenotipo citotóxico en la sangre periférica. Si la función de las células T del huésped se ve afectada, los virus latentes pueden resucitar y causar diversos síndromes. La estimulación crónica después del trasplante de tejido proporciona las condiciones para la activación del CMV y la inducción de la enfermedad. Algunos agentes inmunosupresores potentes que se dirigen a las células T, como la globulina antitimocítica, se asocian con una mayor incidencia de síndrome clínico por CMV. Además, el CMV puede actuar como cofactor para activar la infección latente por VIH.
Fuente de infección
El origen de la infección es el paciente y su portador agudo. El CMV se ha encontrado en sangre, saliva, lágrimas, orina, semen, heces, secreciones cervicales y vaginales, leche materna, etc. El virus puede transmitirse a través de la leche materna, la saliva y la orina durante semanas o años.
Grupos susceptibles
El CMV se propaga por todo el mundo y las personas son muy susceptibles. Los humanos son los únicos huéspedes del CMV.
Las encuestas serológicas muestran que entre 40 y 100 adultos tienen anticuerpos contra el CMV y no hay una tendencia estacional en su prevalencia.
Diferentes países y diferentes condiciones económicas tienen diferentes tasas de infección. En Asia y África, el 90% de las personas están infectadas y la mayoría tiene anticuerpos durante la adolescencia, lo que indica una edad más temprana de infección, mientras que en los países occidentales la infección ocurre más tarde. La encuesta también mostró que las personas de bajos ingresos tienen tasas de infección más altas que las personas de altos ingresos. La tasa de positividad de anticuerpos de personas de alrededor de 70 años es mayor que la de personas de alrededor de 20 años. La edad susceptible para las mujeres es de 20 a 30 años, y para los hombres después de los 35 años, llega a los 50-60 años. La tasa de positividad de anticuerpos es básicamente la misma entre hombres y mujeres.
Aunque se han producido anticuerpos circulantes en el cuerpo, el virus aún puede eliminarse de forma continua o intermitente, por lo que se trata de una infección crónica o latente.
La mayoría de las personas se infectan con CMV durante su vida, pero se trata principalmente de una infección subclínica asintomática. La infección por CMV en adultos está estrechamente relacionada con la función inmune. El virus suele persistir durante toda la vida como una infección latente. Sólo cuando el estado inmunológico del huésped está desequilibrado, como en el trasplante de órganos y de médula ósea, el cáncer, las matemáticas, el embarazo y la aplicación de inmunosupresores, se pueden resucitar los virus latentes. La resurrección de virus latentes y de portadores asintomáticos puede provocar la propagación del virus. Por ejemplo, las personas que reciben tratamiento inmunosupresor para el trasplante de órganos a menudo desarrollan síntomas debido a la presencia de virus latentes en sus órganos y sangre, o porque la inmunosupresión activa virus latentes. Los pacientes con SIDA tienen una mayor incidencia de infección por CMV.
Vía de transmisión
Las vías de transmisión del citomegalovirus son:
(1) Infección congénita (infección intrauterina): durante el embarazo, el citomegalovirus se puede transmitir al feto a través de la placenta.
(2) Infección adquirida (infección perinatal): Durante el parto, si hay algún virus en las secreciones cervicales, se puede transmitir al recién nacido a través del canal del parto.
(3) Después del parto, el virus puede secretarse en la leche materna, por lo que puede transmitirse directamente al bebé durante la lactancia.
(4) El contacto prolongado con drogadictos puede transmitir el virus a través de la saliva, la orina, las lágrimas, etc.
(5) Infección por CMV homóloga: se puede transmitir mediante transfusión de sangre y trasplante de órganos. La infección homóloga por CMV perjudica gravemente la transfusión de sangre y el trasplante de órganos. Las transfusiones de sangre múltiples o masivas aumentan el riesgo de infecciones primarias y recurrentes, las transfusiones de sangre que contienen leucocitos tienen un riesgo mayor y las tasas de infección por CMV también son altas después de un trasplante de órganos o de médula ósea.
(6) Transmisión sexual: Dado que el virus suele existir en las secreciones del tracto urogenital, el semen o las secreciones cervicales, puede transmitirse directamente a través de las relaciones sexuales.
La mayoría de ellas son causadas por infección del semen, secreciones cervicales, lágrimas y heces (libido sexual oral, beso anal). Vía de infección por CMV (circulación) Tabla 1
Madre, feto, recién nacido, lactante, niño, adulto
Transmisión por contacto
(saliva, orina, etc.)
Transfusión de sangre
Inflamación del hígado
Infección del tracto respiratorio Infección latente
Hepatitis
Infección del tracto respiratorio
p >
→Neumonía causada por lento aumento de peso (inmunosupresores, etc.) en lactantes inmaduros.
Mucosa gastrointestinal
Viremia de hepatitis
┌→No invasiva
│
└→Infección→ Infecciosa mononucleosis en neonatos sanos positivos para viruria.
Mononucleosis infecciosa
Aumento de la enfermedad sintomática→viruria y anomalías de la función hepática
Trombocitopenia transitoria
Transfusión de infección latente
Fiebre desconocida
Asintomático
→Enfermedad sistémica de inclusión de células gigantes
↓
Aunque sobrevivan, hay signos de retraso mental .
[Inmunología]
La infección por CMV puede reducir la función inmune del cuerpo, especialmente la función inmune celular. La infección por CMV tiene efectos significativos sobre el desarrollo del timo y las funciones de los esplenocitos, fagocitos mononucleares, células NK y células CTL.
1. Efectos sobre el timo y el bazo
Se inhibió el desarrollo del timo de cobayas recién nacidas infectadas con CMV agudo en el laboratorio y se redujo el número de células T. Después de que ratas adultas fueron infectadas con CMV, se pudo detectar CMV en el 88% del timo.
La infección por CMV afecta la función del bazo, la proliferación de linfocitos esplénicos estimulados por conA disminuye y la producción de IL-2 por los esplenocitos se reduce significativamente.
En segundo lugar, el impacto sobre las células inmunes
La inmunosupresión causada por la infección por CMV está relacionada con la replicación viral intracelular. El CMV puede replicarse en fagocitos mononucleares, células T, células B y algunos monocitos no identificados. Los fagocitos mononucleares son los más susceptibles a la infección por CMV. Los linfocitos tienen importantes funciones reguladoras y efectoras en las respuestas inmunes. Después de la infección por CMV, muchas funciones inmunes de los linfocitos se ven afectadas.
La infección por CMV se manifiesta principalmente como mononucleosis aguda. La respuesta proliferativa de los linfocitos de sangre periférica a los mitógenos, los antígenos del CMV y los antígenos del HSV se debilita, lo que da como resultado una disminución de los niveles de interferón, una disminución de la proporción CD4/CD8 de 1,7 a 0,2 a 0,2 y una disminución de la actividad de las células T. Algunos de estos cambios duran mucho tiempo y la proporción de subconjuntos de células T en la mayoría de los pacientes no se ha recuperado por completo después de 10 meses.
El efecto inmunosupresor de la infección por CMV está causado principalmente por la función anormal de los monocitos y las células CD8 infectadas por el virus. Los fagocitos mononucleares desempeñan un papel fundamental en la inmunidad anti-CMV. No solo pueden fagocitar y matar virus directamente, sino también procesar y presentar antígenos, secretar citoquinas y regular y expandir las respuestas inmunes. Después de la infección por CMV, la función de los fagocitos mononucleares se ve afectada. La infección por CMV conduce a una disminución de la función fagocítica de los macrófagos, una disminución en la producción de radicales libres de oxígeno intracelular, cambios en la expresión de los receptores FC y del complemento, una disminución en su función de presentación de antígenos, producción de IL-1 y respuestas a IL-1 e IL-2 se reducen. Moses et al. detectaron mediante un ensayo de proliferación de timocitos que la actividad de IL-1 disminuyó y que la disminución en la producción de IL-1 puede causar un desequilibrio de las células TH/TS.
Las células NK pueden antagonizar la propagación del CMV. Las células NK participan activamente en todo el proceso de infección anti-CMV, pero la presencia de una alta actividad NK no es necesariamente una respuesta protectora, sino una evidencia de infección activa. Aunque las células NK no pueden prevenir la aparición de una infección primaria por CMV, una vez que se produce la infección, las células NK pueden aparecer en las primeras etapas de la infección por CMV, lo que puede limitar la propagación y la infección. Las células NK y las células CTL son células efectoras importantes contra el CMV. En las primeras etapas de replicación del CMV, antes de que se produzcan viriones infecciosos, pueden lisar las células infectadas, lo que permite que el virus se propague de una célula a otra y aborte. En modelos de ratón, 3 a 5 días después de la acción viral, el efecto antiviral está mediado por células NK y el IFN puede mejorar la actividad de las células NK. Desde el día 6 al día 21, la actividad citotóxica de las células CTL estuvo presente en el bazo y la sangre periférica. La actividad de las células NK y las células CTL determina la sensibilidad del cuerpo a la infección por CMV y la facilidad de recuperación de la infección. Sin embargo, cuando se infecta con CMV, las actividades de las células NK y de las células CTL también se ven gravemente afectadas. Además, la inmunidad celular específica puede prevenir la recurrencia de la infección por CMV. Se detectaron las respuestas de las células T de 20 receptores de trasplante de riñón infectados por CMV y se encontró que 14 receptores tenían respuestas citotóxicas al CMV y 6 receptores sin respuestas citotóxicas al CMV tuvieron consecuencias clínicas graves. Por tanto, la presencia de células T específicas puede prevenir la recurrencia de la infección por CMV.
En tercer lugar, los anticuerpos pueden reducir la virulencia de la infección por CMV.
Después de que los seres humanos se infectan con CMV, pueden aparecer una variedad de anticuerpos. Aunque existen anticuerpos específicos, incluidos los anticuerpos neutralizantes, en la leche materna, las secreciones cervicales y la saliva. Sin embargo, aún se puede detectar el CMV, lo que indica que los anticuerpos no previenen la propagación del virus. Los anticuerpos que el feto adquiere pasivamente de la madre no pueden bloquear las infecciones transmitidas a través del útero, el canal del parto o la leche materna. Los estudios han demostrado que la inyección intraperitoneal o intravenosa de 0,2 ml de globulina anti-CMV de alta potencia en ratones antes de la exposición letal al CMV puede proteger completamente a los animales de la muerte. Un mes después, todos los animales sobrevivieron al segundo desafío con CMV, lo que indica que el anticuerpo podría reducir la toxicidad del CMV.
¿Cuáles son las consecuencias de que las mujeres embarazadas se infecten por citomegalovirus?
Después de que una mujer embarazada se infecta con citomegalovirus, el virus puede infectar al feto a través de la placenta, provocando infección congénita, aborto espontáneo y muerte fetal.
Los bebés con infección congénita pueden ser asintomáticos al nacer, pero algunos casos graves pueden afectar múltiples órganos e incluso provocar la muerte. Los síntomas incluyen hepatoesplenomegalia, ictericia, equimosis o púrpura, coriorretinitis, microcefalia, etc. Todos los niños vivos tendrán diversos grados de pérdida de audición, pérdida de visión, conciencia, deterioro motor y retraso mental. Si el bebé se infecta a través del canal del parto o durante la lactancia, se trata de una infección adquirida con síntomas leves y mejor pronóstico. Algunos pacientes presentan una función hepática anormal.
[Manifestaciones clínicas]
¿Cuáles son los síntomas de la infección por citomegalovirus?
La mayoría de los adultos sanos infectados por CMV no presentan síntomas clínicos evidentes.
Algunos pacientes pueden desarrollar síntomas similares a los de la mononucleosis infecciosa, como febrícula, fatiga, dolor de garganta, inflamación de los ganglios linfáticos, dolor articular y muscular, polineuritis, linfocitos atípicos en sangre periférica y esplenomegalia.
La infección intrauterina durante el embarazo puede causar daños al feto y fácilmente provocar un aborto espontáneo, una muerte fetal o un parto prematuro. Los síntomas neonatales pueden incluir hepatoesplenomegalia, ictericia, hepatitis, púrpura trombocitopénica, anemia hemolítica, neurodegeneración, microcefalia, retraso mental y deficiencias visuales y auditivas.
Las infecciones neonatales pueden no presentar síntomas sistémicos, algunas pueden mostrar solo síntomas de insuficiencia respiratoria y otras pueden mostrar una función hepática anormal. No habrá daño a los nervios.
La historia natural de la infección por CMV es muy compleja. Después de una infección primaria, la excreción suele durar semanas, meses o incluso años y luego la infección se vuelve latente. La redesintoxicación a menudo resulta en infecciones recurrentes. Incluso muchos años después de la infección inicial, el virus latente se reactiva y es posible la reinfección con diferentes cepas virales antigénicas. Las manifestaciones clínicas de la infección por CMV están relacionadas con la función inmune individual y la edad. Como se muestra en la Tabla 2, existen varios síntomas y signos de infección vertical, transmisión paralela o infección adquirida en el hospital.
Tabla 2 Curso clínico y tipos de enfermedad de la infección por 2CMV (Baerlocher et al.)
1. Infección neonatal (congénita)
Tipo grave: Ictericia. , anemia, hepatoesplenomegalia, púrpura trombocitopénica, invasión del sistema nervioso central, neumonía, miocarditis)
B. Tipo leve: animación suspendida, hipertrofia miocárdica, hiperbilirrubinemia.
2.Reinfección por CMV en el periodo asintomático posterior al nacimiento y en la infancia (¿congénita/adquirida?)
A. Tipo sistémico
B. -like) hepatoesplenomegalia
D. Tipo gastrointestinal
E.
3. Tipo adquirido
Tipo influenza
Tipo mononucleosis
Tipo sistema respiratorio
D. Tipo gastrointestinal
E. Hepatitis
F. Baja capacidad de defensa debido a tratamiento médico especial.
G. ¿Tipo asintomático?
Las consecuencias de 4.1, 2 y 3 son retraso mental y motor.
La infección por CMV adquirida es clínicamente frecuente en mononucleosis tras transfusión de sangre, y en enfermedades vasculares, enteritis, neumonía, infecciones del tracto digestivo, etc. debidas a inmunodeficiencia. Y la mayoría de los pacientes se complican con el síndrome de Guillain-Barré.
[Diagnóstico]
La infección por CMV no se puede diagnosticar únicamente mediante manifestaciones clínicas, pero el virus o sus anticuerpos específicos se pueden aislar de muestras clínicas mediante medios de laboratorio (los títulos de anticuerpos aumentan más de 4 veces mayor o sigue aumentando).
Primero, aislamiento del virus
Lo mejor es inocular saliva, orina, secreciones del tracto reproductivo, leche materna y leucocitos en fibroblastos humanos para su propagación y aislamiento. Los efectos citopáticos (CPE) aparecen después de 1 día o varias semanas. Las células gigantes se pueden observar mediante tinción con HE después de la fijación, con inclusiones en el núcleo, un halo alrededor del núcleo e inclusiones eosinófilas en el citoplasma, que se asemejan a los "ojos de búho". También se pueden utilizar monoclonales o multicelulares.
2. Detección de anticuerpos séricos
Los métodos más utilizados son la prueba de fijación del complemento (FC), la prueba de inmunofluorescencia indirecta (IFI), la prueba de inmunoenzima (EIA) y la prueba de hemaglutinación indirecta. (IHA) y radioinmunoensayo (RIA) para detectar anticuerpos CMV-IgG e IgM. Cuando se ha confirmado que una sola muestra de suero tiene infección por CMV en el pasado, debe almacenarse inmediatamente y separarse por 2 semanas, 4 semanas u 8 semanas, y el diagnóstico de infección primaria puede realizarse junto con el aislamiento del virus.
Tres. Las sondas de ADN
actualmente se utilizan ampliamente para detectar CMV, entre las cuales las sondas marcadas con 32P son las más sensibles. Para algunas muestras, la hibridación puede ser más sensible que el aislamiento del virus.
IV.Reacción en cadena de la polimerasa
(1) Recolección y procesamiento de muestras
Las muestras recolectadas incluyen sangre, orina y tejido glandular del paciente. La capa leucocitaria preparada a partir de sangre entera se puede almacenar a -80°C. Las muestras de orina se pueden almacenar en nitrógeno líquido. Las muestras congeladas deben evitar la congelación y descongelación repetidas.
Centrifugar la muestra de orina a 2500 rpm durante 65438±00 minutos para eliminar los restos celulares y recoger el sobrenadante. Dado que la orina contiene inhibidores de la PCR, ¿es necesario tratarla previamente con PEG6000:50? lSobrenadante de orina y 50? ¿L 20PEG6000 y 25? Mezclar con 1,2 mol/L de NaCl y colocar en un baño de hielo durante 6 horas; centrifugar a 15.000 rpm durante 30 minutos para recoger el precipitado. Luego centrifugar a 6400 rpm/3 min durante 3 min; absorber la mayor cantidad de sobrenadante posible y suspender el sedimento en agua destilada. La suspensión se puede utilizar directamente para la amplificación por PCR; el producto de amplificación debe calentarse a 65438 ± 000 °C durante 65438 ± 000 minutos y luego enfriarse rápidamente en un baño de hielo.
(2) Preparación del ADN molde
1. Preparación del ADN molde a partir de muestras de sangre
Método A: Añadir NaCl al suero para alcanzar la concentración final 150. mmol/L; tomar 10? Después de tratar el suero a 70°C durante 45 segundos, se puede amplificar directamente mediante PCR.
Método B: Preparación a partir de capa leucocitaria (BCP): ① Lavar el BCP dos veces con PBS y recoger el precipitado. ②¿Agregar 500? L 6mol/L clorhidrato de guanidina, homogeneizar ③ agregar 30? l EDTA 10 mmol/L, NaCl 10 mmol/L, 30? L20 sarcosina y 5? l Proteinasa K (10 mg/ml), mezclar uniformemente y reaccionar a 60°C durante 1 hora. ④¿Agregar 1130? lEtanol, precipitar a -20°C durante 1 ~ 2h. ⑤Centrifugar para recoger el precipitado de ADN. ⑥ Lavar dos veces con etanol 70 y finalmente suspender el precipitado en una pequeña cantidad de Tris-HCl 10 mmol/L y EDTA 1 mmol/L. Establecer a 4°C para su uso posterior.
2. Preparación de la plantilla de ADN: ① Muestra de tejido congelado: ① Utilice un microtomo de congelación para cortar un trozo de 5 a 10 trozos. m bloques de tejido congelados en tubos de plástico de 1,5 ml. ②Agregue formalina al 10% preparada con solución tampón. ③Después de 10 minutos, centrifugar durante 1 a 2 minutos, verter suavemente el sobrenadante y lavar el precipitado dos veces con etanol. ④ Secar a temperatura ambiente durante 10 ~ 60 minutos. ⑤Agregue tampón de extracción (Tris-HCl 100 mmol/L, EDTA 4 mmol/L, pH 8,0, Proteinasa K 400 g/ml) hasta que el precipitado esté apenas sumergido (aproximadamente 50 ~ 100 l). De esta manera también se pueden procesar tejidos fijados con formalina o incluidos en parafina después de la desparafinación y el secado. ⑥ Colocar el líquido a 37°C. ⑦Inactivar la proteinasa K en agua hirviendo durante 7 min. (8) Recoger el sobrenadante por centrifugación y tomar de 1 a 10? Se puede realizar la amplificación por L-PCR.
3. Preparación de la plantilla de muestra de orina de ADN: ① 100? lSobrenadante de orina y 100? L 6mol/L isotiocianato de guanidina, 7? L 2mol/L NaCl y 20? lSuspensión de polvo de vidrio (preparación de ADN, Asahi Glass Co., Ltd., Tokio). ② Después de dejarlo a temperatura ambiente durante 65.438±00 minutos, centrifugar a 6.400 rpm durante 2 minutos para recoger el precipitado. ③ Lavar el precipitado una vez con etanol al 50 %, 65438 ± 00 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 50 mol/L NaCl y centrifugar a 6400 r/min durante 65438 ± 0 min. (4) Lavar el precipitado dos veces de la misma manera y recoger el precipitado. ⑤¿Agregar 50? l Agua destilada, 65438±05 minutos a 55°C. ⑥Centrifugar a 15000 r/min durante 2 minutos, recoger el sobrenadante (que contiene ADN de HCMV), realizar la amplificación por PCR, calentar la suspensión a 100 °C durante 10 minutos y luego enfriarla rápidamente en un baño de hielo.
(3) Cebadores y sondas
Basado en la región promotora publicada y las primeras cuatro secuencias del gen de la proteína temprana directa del CMV, el gen del antígeno tardío gp64 y el gen de la proteína fosforilada pp71 Diseño de cebadores y sondas para secuencias de exones. Los cebadores y sondas de uso común se enumeran en la Tabla 3.
(4) pasos de amplificación por PCR
1,10× tampón de reacción: Tris-HCl 100 mmol/l, pH 8,4, KCl 500 mmol/l, MgCl2 25 mmol/l, gelatina 2 mg/ ml .
Taq ADN polimerasa: 5U/? l .
10× dNTP: cada uno de los cuatro dNTP es 2,0 mmol/L.
Cebadores: 100 pmol/L
2. Amplificación por PCR convencional
Mezcla de reacción 10X (50 µl) tampón de reacción 5? l
10×dNTP 5? l
¿Plantilla ADN 5? l
¿Taq ADN polimerasa 0.2? Litros (unidades SI)
¿0,5 cebadores cada uno? l
Agua destilada 3.8? l
Añadir de 1 a 2 gotas de aceite mineral.
Calentar la mezcla de reacción a 94°C durante 5 minutos; luego amplificar a 95°C durante 30 segundos, 55°C durante 40 segundos y 72°C durante 60 segundos, y realizar ciclos de 35 a 40 veces. .
Tabla 3 Cebadores y sondas para amplificación por PCR de CMV
Cebadores e
Investigaciones
Secuencia (5′→ 3′)
Posición
Parte
Tamaño
IE1
CCACCCGTGTGCCAGCTCC
Gen temprano
159(pb)
IE2
CCCGCTCCTCCTGAGCACCC
IE3 (sonda)
ctggtgtcaccccgagtcccctgtacccgcgacttcc
LA1
CCGCAACCTGGTGCCCATGG
Gp64 tardía
139
LA2
CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG
LA3 (sonda)
ttcttctgggacgccaaccagacatctaccgcatcttcgccg
IE1a
AGATCGCCTGGAGACGCCAT
Exón 1 temprano
139
IE1b
GGAATCCGCGTTCCAATGCA
IE2a
ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG
Exón 2 temprano
Setenta y dos
IE2b
CCGTGGCACCTTGGAGGAAG
IE3a
GTGACCAAGGCCACGACGTT
Exón 3 externo temprano
167
IE3b
tctgccagaggacatctttctc
IE4a
ACAGATTAAGGTTCGAGTGC
Exón temprano 4
179
IE4b
CAATACACTTCATCTCCTCG
IE4c
TTACCAAGAACTCAGCCTTC
Exón temprano 4
158
IE4d
gtgcgtgagccaccttgtctc
IE4e
TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA
Exón temprano 4
426
IE4f
ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG
Pp1a
TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT
Gen Pp71
316
Pp1b
ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC
Pp71
3. Fórmula Nest) Amplificación por PCR: ① La composición de la mezcla de reacción es la misma que (2) , sólo los cebadores son IE2a e IE4b (incluido el exón 3 completo, ***721b), 100 pmol cada uno. La amplificación se realizó durante 20 ciclos a 94°C durante 60 segundos, 52°C durante 150 segundos y 72°C durante 480 segundos. ②¿Tomar 2? Agregue 100 pmol de los cebadores IE3a e IE3b al producto de amplificación anterior y agregue otros reactivos. Luego, se realizaron 20 ciclos de amplificación a 94°C durante 60 s, 52 °C durante 150 s y 72 °C durante 180 s.
(5) Identificación del producto
Los productos de amplificación se pueden analizar mediante pruebas de hibridación en fase sólida (membrana de filtro) y de hibridación en fase líquida.
1. Hibridación en fase sólida:
① La solución de prehibridación es 3×SSPE, 5×Denhardt, 0,5SDS y 25formamida. El filtro que contenía el producto amplificado se prehibridó a 42°C durante 30 a 60 minutos. ②Agregue la sonda etiquetada (10cpm/?g, 2ng/ml) y reaccione durante 30 ~ 60 minutos. ③ Lave la membrana del filtro 3 veces con 0,2 × SSPE y 0,01 SDS a temperatura ambiente, 5 minutos cada vez; lave una vez a 60 °C, 10 minutos por vez; lave a temperatura ambiente más de una vez, 5 minutos por vez; ④Autodesarrollo.
2. Análisis de electroforesis y hibridación en fase líquida:
① Tome 1/10 del volumen del producto de amplificación y mézclelo con una sonda final de 0,5 ~ 1,0 pmol. ②Agregue NaCl, fosfato de sodio y solución de EDTA con una concentración final de 150 mmol/L para obtener un volumen total de 20? l.③65438±00 minutos a 95 ℃, 56 ℃ 60 minutos a 56 ℃. ④Centrifugar durante 10 segundos, agregar tampón de muestra y realizar electroforesis en gel de poliacrilamida de 8 pasos. ⑤Después de la electroforesis, tiña con bromuro de etidio, luego exponga la película de rayos X y revele usted mismo.
La molécula de ADN del CMVH es muy grande y su secuencia de bases aún no se ha comprendido del todo. Aunque la longitud de sus fragmentos de endonucleasa de restricción de ADN es polimórfica, la naturaleza discreta de su genoma sigue sin estar clara. El 90% de los aislados de HCMV de tipo salvaje pueden identificarse mediante amplificación por PCR con un único par de cebadores. Utilizando más de dos pares de cebadores para diferentes secuencias de HCMV, se pueden detectar casi todas las cepas virales. Por tanto, la detección por PCR se puede realizar utilizando dos o más pares de cebadores ubicados en diferentes regiones del genoma, según la situación.
En la preparación del ADN molde del HCMV, a veces se producen algunos pequeños fragmentos de ADN, lo que a menudo da como resultado un cierto nivel de productos de fondo en la reacción de PCR, lo que afecta el juicio de los resultados. En este caso, se puede utilizar el método de PCR anidada. El principio básico es que la amplificación del ADN objetivo se divide en dos pasos: primero, se utiliza un par de cebadores para amplificar el ADN largo, incluido el ADN objetivo, y luego se toma una pequeña cantidad de amplificación; producto y uso Se realiza una segunda amplificación con cebadores dirigidos únicamente al ADN objetivo. Controlando el número de ciclos de amplificación en cada paso se pueden prevenir los falsos positivos provocados por pequeños fragmentos de ADN. Este enfoque también evita resultados falsos negativos.
La detección de muestras de HCMV mediante PCR es altamente sensible. En los sobrenadantes de cultivos de tejidos infectados por HCMV se pueden detectar secuencias de ADN equivalentes a docenas de moléculas de ADN viral o de 1 a 5 ufp de virus. La hibridación Southern con sondas de oligonucleótidos no radiactivas permitió la detección de 1 secuencia de ADN pghcvmv en muestras de orina. Con este sistema, solo se puede detectar un genoma viral en 4 × 104 células, lo que es 2 × 103 veces mayor que la hibridación por transferencia puntual.
La tecnología PCR tiene valor de aplicación clínica para detectar la infección por HCMV, porque el ADN viral en los fluidos corporales precede a la aparición de síntomas clínicos o evidencia serológica de infección viral y puede usarse como un indicador temprano de la infección por HCMV. Dado que el CMVH puede transmitirse a través de infección placentaria e infección del canal del parto, y que la tasa de mortalidad de los recién nacidos infectados es alta, el diagnóstico temprano mediante PCR y las medidas de tratamiento oportunas también son de gran importancia. Utilizando este enfoque, también podemos determinar la relación entre el HCMV del donante y muchas enfermedades graves en el trasplante de órganos o tejidos. Además, la PCR se puede utilizar como medio para evaluar la eficacia de diversos fármacos antivirales debido a sus indicadores de detección estables y su análisis semicuantitativo.
[Tratamiento]
Si se detecta una infección primaria por citomegalovirus al principio del embarazo, se debe interrumpir el embarazo lo antes posible. Las personas infectadas en el segundo y tercer trimestre del embarazo deben comprobar más a fondo si el feto tiene malformaciones y tomar las medidas de tratamiento correspondientes. Los pacientes con síntomas clínicos o enfermedad congénita por CMV pueden tratarse con medicamentos antivirales. Como citarabina, sulfatida, interferón, etc. , pero aún queda por observar la eficacia.
En el tratamiento de la infección por citomegalovirus se pueden utilizar diversos agentes antivirales, como GCV, preparados de inmunoglobulinas anticitomegalovirus, interferones y factores de transferencia. Sin embargo, estos medicamentos no pueden resolver el problema subyacente y el virus a menudo asoma la cabeza después de suspenderlos.
Dado que este virus puede ser una de las causas del SIDA, académicos de todo el mundo están trabajando en formas de controlar su infección. Recientemente, académicos estadounidenses han desarrollado dos vacunas vivas y los resultados son bastante buenos después de los ensayos preliminares. Uno se desarrolló a partir de la cepa AD169; el otro se elabora a partir de la cepa de la ciudad. Después de la administración parenteral, el efecto anticitomegalovirus quedó claramente demostrado y los anticuerpos contra el CMV aumentaron, lo que resultó en una mejora de la función inmune.
[Prevención]
El citomegalovirus es muy dañino para los humanos y debemos prevenir activamente su aparición.
(1) Realizar ejercicio físico de forma consciente. Mejorar la función inmune y la resistencia a las enfermedades del cuerpo, especialmente las mujeres en edad fértil, para reducir el daño grave del citomegalovirus al feto.
(2) Prestar atención a la protección de mujeres embarazadas o pacientes con enfermedades debilitantes crónicas y baja inmunidad para mantenerlos alejados de fuentes de infección.
(3) Prestar atención a la higiene ambiental y a la higiene alimentaria.
(4) Las personas con citomegalovirus mamario positivo no deben amamantar.
(5)Control inmunológico. Todavía está bajo investigación y exploración.
Los síntomas clínicos varían ampliamente y dependen de la edad, el estado del paciente y la vía de infección.
Continuará…
Actualmente no existe un tratamiento específico para la infección por CMV.
Debido a la infección congénita y la carcinogenicidad del citomegalovirus, algunos estudiosos han considerado el uso de vacunas para bloquear la infección por CMV. Debido a limitaciones técnicas, es imposible cultivar un CMV económico y práctico de alto precio que pueda usarse como vacuna muerta. Actualmente se utiliza la vacuna viva atenuada llamada Towne.
Materiales de referencia:
¿Sabías que la infección por citomegalovirus es un posible culpable de la teratogénesis?
El citomegalovirus humano es un virus de ADN de doble cadena y uno de los virus animales de mayor tamaño. Los humanos son las únicas víctimas del citomegalovirus humano. En comparación con otros virus, el citomegalovirus humano (HCMV) es menos virulento y generalmente no causa daños graves a órganos y tejidos después de invadir el cuerpo. Sin embargo, una vez que el gen viral se integra en los genes relevantes del óvulo fertilizado, puede impedir o afectar la replicación y expresión de este último, lo que eventualmente conducirá a anomalías morfológicas y estructurales irreversibles. La infección por citomegalovirus causa principalmente malformaciones fetales dentro de los primeros 3 meses de embarazo. El cerebro es el órgano más vulnerable al CMV y tanto las neuronas como las células gliales del tejido cerebral fetal pueden verse invadidas. El depósito de calcio intracraneal, la encefalomalacia y la hidrocefalia son las manifestaciones clínicas más comunes de la infección por citomegalovirus humano y sus secuelas también son las más graves en el sistema nervioso. El más común es el retraso mental, y otros incluyen anomalías motoras gruesas, anomalías psicomotoras, sordera neurosensorial, coriorretinitis, etc. Aunque existen riesgos claramente elevados para las afecciones auditivas y neurológicas, e incluso puede haber secuelas, sólo 5 de cada 5 bebés infectados mostrarán signos de infección neonatal por citomegalovirus. Sin embargo, el 90% de los fetos con infección congénita nacen sin ningún síntoma clínico. Por tanto, fortalecer la vigilancia y el diagnóstico precoz son medidas importantes para prevenir la teratogénesis causada por la infección por citomegalovirus. La tasa de infección de mujeres embarazadas infectadas con citomegalovirus por primera vez durante el embarazo es del 30%, y el 40% de las mujeres embarazadas infectadas pueden infectar a sus fetos durante el parto. No existe un tratamiento específico para la infección por CMV durante el embarazo, la clave es la prevención. En el caso de las mujeres embarazadas en sus primeras etapas, no solo se pueden controlar sus anticuerpos, sino que también se pueden controlar sus antígenos mediante métodos especiales. Si la replicación del citomegalovirus está activa en mujeres embarazadas, se deben tomar medidas decisivas para interrumpir el embarazo para evitar el nacimiento de bebés deformes. Además, es necesario mejorar la calidad cultural de las personas, prestar atención a la higiene, eliminar todas las posibilidades de infección viral y prestar atención a mantener y mejorar la función inmune del cuerpo. Sólo así será posible prevenir o reducir la infección por CMV en las mujeres. de edad fértil.
¿La enfermedad de inclusión de células gigantes tiene un impacto en la inteligencia de los niños?
La infección por citomegalovirus (CMV) puede provocar daños en múltiples órganos y síntomas clínicos. Si hay síntomas clínicos al nacer, se trata de una infección intrauterina (infección congénita), principalmente una infección posparto unos días o semanas después del nacimiento. La infección por citomegalovirus es muy común y es uno de los patógenos importantes de la infección viral congénita. La infección por citomegalovirus puede causar daños extensos al tejido cerebral fetal y es la principal causa de retraso mental en los niños.
La infección por citomegalovirus está muy extendida y la mayoría de las personas se infectarán en algún momento de sus vidas. Las personas que viven en zonas superpobladas, tienen malas condiciones económicas y malas condiciones sanitarias son susceptibles a la infección.
Las tasas de infección son más altas en mujeres que en hombres de la misma edad. Las mujeres embarazadas de 28 años o más excretan citomegalovirus del cuello uterino al final del embarazo, lo que es una causa importante de infección congénita por citomegalovirus. Las personas que se desintoxican de la leche materna tienen entre 13 y 27 años y el tiempo de desintoxicación es prolongado, lo que fácilmente puede provocar infecciones adquiridas.
Existen muchos tipos de manifestaciones clínicas tras la infección por citomegalovirus. Si se trata de una infección congénita, después del nacimiento se producirá bajo peso, respiración irregular, ictericia severa, hepatoesplenomegalia, convulsiones, disminución de la visión, parálisis muscular, retraso mental, etc. Si se trata de una infección adquirida, los síntomas generalmente son leves y en su mayoría síntomas de hepatitis.
Por lo tanto, las mujeres en edad fértil deben someterse a un examen físico antes de quedarse embarazadas. Si se encuentra una infección por citomegalovirus, se debe realizar un tratamiento antiviral para que los anticuerpos contra el citomegalovirus en la sangre se vuelvan negativos y las secreciones cervicales se vuelvan negativas antes del embarazo.