Definición\principios\funciones\áreas de aplicación de los biochips
El concepto básico de 1
Los chips de genes, también conocidos como chips de ADN, microarrays de ADN y conjuntos de oligonucleótidos, son decenas de miles de sondas de ADN sintetizadas in situ o microimpresas. El método se solidifica en la superficie del soporte para generar una matriz de sondas de ADN bidimensional. Luego se hibrida con la muestra marcada para lograr una detección o diagnóstico médico rápido, paralelo y eficiente de muestras biológicas mediante la detección de la señal de hibridación. Dado que las obleas de silicio se utilizan comúnmente como soportes sólidos y se utiliza tecnología de preparación de chips de computadora en el proceso de preparación, se denomina tecnología de chips genéticos.
2 Proceso tecnológico básico
2.1 Construcción de una matriz cuadrada de ADN
Seleccione oblea de silicio, oblea de vidrio, oblea de cerámica, película de polipropileno, película de nailon y otros soportes materiales y realizar el procesamiento correspondiente, y luego utilizar tecnología de fotolitografía y síntesis química fotoconductora para sintetizar sondas de oligonucleótidos en superficies como obleas de silicio (2) Sintetizar sondas de cadenas de oligonucleótidos mediante química en fase líquida, o sintetizar sondas de cadenas de oligonucleótidos mediante tecnología de PCR amplifica la secuencia genética, y luego la purifica y cuantifica a través del dispositivo de matriz y replicación, o el dispositivo de matriz y robot controlado por computadora, diferentes muestras de sonda se detectan de manera precisa y rápida en una membrana de nailon cargada positivamente o en una oblea de silicio en la posición correspondiente. luego se fija mediante reticulación UV para obtener un microarray o chip de ADN (3).
2.2 Preparación de muestra de ADN o ARNm.
Las muestras de ADN/ARNm obtenidas de sangre o tejido vivo deben amplificarse antes de etiquetarse como sondas para aumentar la sensibilidad de lectura. Mosaic Technologies ha desarrollado un sistema de PCR en fase sólida que es superior a la tecnología de PCR tradicional. Diseñaron un par de cebadores bidireccionales en el ADN objetivo y los dispusieron sobre una película de acrilamida. Este método no tiene contaminación cruzada y elimina la complejidad del procesamiento en fase líquida. Lynx Therapeutics ha propuesto otro método innovador, la clonación masiva paralela en fase sólida, que puede clonar simultáneamente decenas de miles de fragmentos de ADN en una muestra sin la necesidad de aislar y procesar por separado cada clon, lo que permite aumentar la muestra de manera más eficiente y rápida ( 4).
Durante el proceso de amplificación por PCR, las muestras deben marcarse al mismo tiempo. Los métodos de etiquetado incluyen el marcado fluorescente, el marcado con biotina y el marcado con isótopos.
2.3 Hibridación molecular
La hibridación complementaria entre el ADN de la muestra y el ADN de la sonda depende del tipo y longitud de la sonda y de la aplicación del chip para seleccionar y optimizar las condiciones de hibridación. Si se usa para monitorear la expresión genética, la rigurosidad de la hibridación es baja, la temperatura es baja, el tiempo es largo y la concentración de sal es alta; si se usa para la detección de mutaciones, las condiciones de hibridación se invierten (5). Las características de la hibridación molecular del chip son la solidificación de la sonda y el etiquetado fluorescente de la muestra, que pueden detectar y analizar una gran cantidad de muestras biológicas a la vez, y el proceso de hibridación solo toma 30 minutos. La empresa estadounidense Nangon utiliza un método de control de campos eléctricos para reducir la velocidad de hibridación molecular a 65.438±0 min, o incluso a unos pocos segundos (6). Jorg Hoheisel, del Instituto Alemán del Cáncer, y otros creen que el ácido peptídico nucleico (PNA) es una mejor sonda.
2.4 Detección y análisis de patrones de hibridación
La muestra en el chip se excita mediante láser para emitir fluorescencia. Las moléculas híbridas estrictamente emparejadas tienen una alta estabilidad termodinámica y una fuerte fluorescencia. Las moléculas de doble enlace hibridadas incompletas tienen una baja estabilidad termodinámica y una señal de fluorescencia débil (menos de 1/35 ~ 1/5 de la primera) (2), mientras que las moléculas de doble enlace no hibridadas no tienen fluorescencia. Utilice microscopía confocal láser o microscopía de epifluorescencia para detectar señales en diferentes sitios y utilice software de computadora para procesarlas y analizarlas para obtener mapas genéticos relevantes. En la actualidad, los métodos de espectrometría de masas, quimioluminiscencia y fibra óptica son más sensibles y rápidos, y tienden a sustituir a los métodos de fluorescencia.
3 Aplicaciones
3.1 Secuenciación
Los chips genéticos utilizan el patrón de hibridación generado por la hibridación molecular entre sondas fijadas y muestras para organizar la secuencia de la muestra a analizar. . Este método es rápido y tiene buenas perspectivas de aplicación. Mark chee et al. utilizaron una matriz que contenía 135.000 sondas de oligonucleótidos para determinar la secuencia completa del genoma mitocondrial humano con una precisión del 99% (7). Hacia et al. utilizaron una micromatriz de alta densidad que contenía 48.000 oligonucleótidos para analizar las diferencias en las secuencias del gen BRCA1 de chimpancé y humano. Los resultados mostraron que la homología de la secuencia de ácido nucleico del exón 11 osciló entre el 98,2% y el 83,5%, lo que sugiere que los dos son muy similares en evolución (8).
3.2 Detección de niveles de expresión génica.
La detección del nivel de expresión del chip genético puede detectar automática y rápidamente la expresión de miles de genes. Schena et al. utilizaron una micromatriz de ADNc de 45 genes en el genoma de Arabidopsis (incluidas 14 secuencias completas y 31 EST) para detectar los niveles de expresión de estos genes en los tejidos de las raíces y las hojas de las plantas. Después de marcar los productos de transcripción inversa con fluoresceínas de diferentes colores, se hibridaron con el microarray respectivamente. Después de la microscopía con enfoque láser, se encontraron 26 genes en los tejidos de la raíz y las hojas de la planta. (9) Schena et al. construyeron una micromatriz de ADNc que representa 1046 genes de una biblioteca de ADNc de linfocitos de sangre periférica humana y detectaron las diferencias en la expresión génica en células T cultivadas in vitro después de una reacción de choque térmico. 11 Los genes se expresaron moderadamente y 6 genes se inhibieron significativamente después del tratamiento. Los resultados también fueron confirmados mediante marcado de intercambio con fluoresceína, grupos de control y tratamiento, y transferencia Northern (10). Una vez finalizado el PGH, no estarán muy lejos los chips genómicos que puedan detectar los cambios de expresión de todos los genes humanos en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas (11).
3.3 Diagnóstico genético
Aislar ADN del genoma humano normal e hibridarlo con un chip de ADN para obtener un mapa estándar. El ADN aislado del genoma del paciente se puede hibridar con un chip de ADN para obtener un mapa de la lesión. Comparando y analizando estos dos mapas, se puede obtener la información del ADN de la lesión. Esta tecnología de diagnóstico por chip genético se convertirá en una nueva tecnología de diagnóstico moderna con sus características de rápida, eficiente, sensible, económica, paralela y automatizada. Por ejemplo, Affymetrix ha integrado la secuencia completa del gen P53 con sondas de mutaciones conocidas en el chip para crear un chip del gen P53, que desempeñará un papel en el diagnóstico temprano del cáncer. Para otro ejemplo, Heller et al. construyeron una micromatriz de ADNc de 96 genes para detectar y analizar genes relacionados con la artritis reumatoide (AR), explorando así la aplicación de chips de ADN en el diagnóstico de enfermedades infecciosas (12). En la actualidad, han ido entrando gradualmente en el mercado una serie de chips de diagnóstico, como los chips de diagnóstico para la detección del virus de la hepatitis, los chips de detección de resistencia a los medicamentos de Mycobacterium tuberculosis y los chips genéticos para varios virus relacionados con tumores malignos. El diagnóstico genético es la aplicación más comercial de los chips genéticos.
3.4 Detección de fármacos
Cómo aislar e identificar los ingredientes activos de los fármacos es un obstáculo importante para el desarrollo de la industria de la medicina tradicional china y de la medicina occidental. La tecnología de chips genéticos es un medio eficaz para resolver este obstáculo. Puede proyectarse a gran escala y tiene una gran versatilidad. El mecanismo de acción del fármaco se puede explicar desde el nivel genético, es decir, se pueden analizar las diferencias en la expresión genética en diferentes tejidos y órganos del cuerpo antes y después de tomar el fármaco. Si usa ARNm para construir una biblioteca de expresión de ADNc y luego usa la biblioteca de péptidos obtenida para hacer un chip de péptidos, puede descartar algunas sustancias efectivas de muchos ingredientes farmacéuticos. En otras palabras, el ARN y el ADN monocatenario tienen una gran flexibilidad y pueden formar estructuras espaciales complejas, que son más propicias para unirse a las moléculas diana. El ARN o el ADN monocatenario de la biblioteca de ácidos nucleicos se puede fijar en el chip y luego incubar con la proteína diana para formar un complejo proteína-ARN o proteína-ADN, que puede detectar proteínas farmacológicas o ácidos nucleicos específicos. Por lo tanto, la combinación de tecnología de chips y bibliotecas de ARN se utilizará ampliamente en la detección de fármacos. En el proceso de búsqueda de medicamentos contra el VIH, Jellis et al. examinaron 654.536 octanucleótidos de fosforotioato mediante una combinación de síntesis química y tecnología de chips de ADN, e identificaron inhibidores con estructuras similares a XXG4XX. Los experimentos han demostrado que este cribado tiene un efecto de bloqueo significativo sobre las células infectadas por el VIH. (13) La tecnología de biochips ha mejorado enormemente la velocidad de detección de fármacos, la identificación de genes diana y las pruebas de nuevos fármacos, y ha reducido considerablemente los costos.
En la actualidad, la tecnología de detección de medicamentos con chips genéticos acaba de comenzar. Muchas compañías farmacéuticas en los Estados Unidos ya han comenzado el trabajo preliminar, es decir, están estableciendo bases de datos de perfiles de expresión para proporcionar varios genes objetivo y métodos de análisis para la detección de medicamentos. Esta tecnología tiene un gran valor de aplicación potencial.
3.5 Dosificación personalizada
Clínicamente, la misma dosis de un fármaco es efectiva para el paciente A, pero puede no ser efectiva para el paciente B, pero puede tener efectos secundarios para el paciente C. En términos de eficacia del fármaco y efectos secundarios, las respuestas de los pacientes varían ampliamente. Esto se debe en gran medida a diferencias genéticas en los pacientes, como los genes de respuesta a los medicamentos, que conducen a diferentes respuestas a los medicamentos. Por ejemplo, las enzimas del citocromo P450 participan en el metabolismo de aproximadamente el 25% de los fármacos más utilizados. Si el gen de la enzima citocromo P450 en un paciente está mutado, tendrá efectos secundarios importantes sobre el fármaco antihipertensivo isoquinidina. Aproximadamente entre el 5% y el 10% de las personas de raza blanca carecen de la actividad de este gen enzimático. Ahora está claro que estos genes tienen una variación amplia y, además de diferentes respuestas a los fármacos, están asociados con una variedad de enfermedades como tumores, enfermedades autoinmunes y la enfermedad de Parkinson. Si se utiliza la tecnología de chips genéticos para diagnosticar al paciente primero y luego emitir una receta, se puede implementar un tratamiento individualizado y optimizado para el paciente. Por otro lado, en términos de tratamiento, las causas específicas de muchas de las mismas enfermedades varían de persona a persona, y los medicamentos también deberían variar de persona a persona. Por ejemplo, existen muchos subtipos de hepatitis B y múltiples sitios en el gen del VHB, como las regiones de los genes S, P y C, son propensos a mutaciones. Si el chip de detección del polimorfismo del gen VHB se utiliza para detectar el polimorfismo del gen VHB a intervalos regulares, es de gran importancia para guiar la medicación y prevenir la resistencia a los medicamentos del VHB. Por poner otro ejemplo, los fármacos que se utilizan actualmente para tratar el SIDA son principalmente inhibidores de la transcriptasa inversa rt y la proteasa pro virales, pero la resistencia a los fármacos suele aparecer después de 3 a 1,2 meses porque se producen uno o más puntos en los genes RT y PRO. Los cuatro sitios de mutación comunes del gen Rt son Asp67 → Asn, Lys70 → Arg, Thr215 → Phe, Tyr y Lys219 → Glu. La resistencia a los medicamentos de los cuatro sitios es 100 veces mayor que la de una mutación puntual (14). . Si todas las secuencias de estos sitios de mutación genética se construyen en chips de ADN, se puede detectar rápidamente si un paciente tiene una o más mutaciones genéticas, de modo que se puede prescribir el medicamento adecuado, lo cual es de gran importancia para guiar el tratamiento y el pronóstico.
Además, los chips genéticos también tienen un gran valor de aplicación en el descubrimiento de nuevos genes, el mapeo del farmacogenoma, la identificación de variedades de la medicina tradicional china y la investigación informática del ADN.
La situación actual y las perspectivas de los chips genéticos en el país y en el extranjero
Desde 1996, la empresa estadounidense Affymetrix ha producido con éxito el primer lote de biochips del mundo para la detección de fármacos y experimentos de laboratorio. Se fabricó el sistema de chip (15). Desde entonces, países de todo el mundo han logrado rápidos avances en la investigación de chips y han logrado nuevos avances. Hyseq, Syntexi, Nanogen e Incyte en los Estados Unidos, así como en Japón y países europeos, están llevando a cabo activamente investigaciones sobre chips de ADN. Motorola, HP, IBM y otras empresas multinacionales también han invertido mucho en la investigación de chips. En junio de 5438 + febrero de 1998, Affymefrix y Molecular Dynamics anunciaron el establecimiento de un consorcio de tecnología de análisis genético para desarrollar una plataforma tecnológica unificada y producir equipos más eficaces y más baratos, haciéndose eco de esto. El mismo día, la empresa británica de biotecnología Amershcem Pharmacia también anunció que proporcionaría algunas tecnologías dominadas para promover la aplicación de esta tecnología (16). En Estados Unidos se celebraron dos conferencias sobre tecnología de chips, en las que el presidente Clinton valoró y afirmó mucho esta tecnología y consideró los chips genéticos como una brújula para garantizar una vida sana (17). Se espera que las ventas de biochips alcancen entre 20 y 30 mil millones de dólares estadounidenses en los próximos cinco años. Según la previsión de la revista Fortune (97.3), en el siglo XXI el impacto de los biochips en los seres humanos probablemente superará el de los biochips; chips microelectrónicos.