Descripción general de Mycoplasma genitalium
Los estudiosos nacionales han mejorado el medio de cultivo SP-4. Zhao Jiwen et al. [4] aislaron con éxito Mg de enfermedades de transmisión sexual y de personas sexualmente promiscuas utilizando un medio de cultivo SP-4 mejorado. El tiempo de crecimiento inicial es superior a los 30 días, con una media de 37,83 días y un máximo de 55 días.
1.2 El método de cultivo de células tisulares puede proporcionar un buen entorno de crecimiento similar al in vivo para micoplasmas. Ya en la década de 1960, Chanock et al [5] informaron del crecimiento de Mycoplasma pneumoniae (Mp) en tejidos y células. En la década de 1990, Jensen et al. [3, 6] comenzaron a intentar utilizar métodos de cultivo celular para hacer proliferar el Mg y observaron el proceso de invasión del Mg en las células y su localización en las células bajo un microscopio electrónico. Bajo el seguimiento de la PCR, Jensec descubrió que 9 de las 11 muestras uretrales que fueron positivas para MgDNA por PCR se adaptaron para proliferar en cabezas de células Vero, después de múltiples pases, se transfirieron a un medio de caldo Friis fF modificado. se pasan, y finalmente se clonan cuatro cepas en medio agar. Jensen cree que el proceso de cultivo y propagación celular desempeña tres funciones a la hora de aislar y obtener nuevas cepas de Mg. El primero es adaptar gradualmente el Mg en muestras clínicas para crecer en medios de cultivo artificiales, el segundo es aumentar el número de micoplasmas inoculados en el medio de cultivo caldo de micoplasmas y el tercero es proporcionar una fuente continua de inoculación. Sobre la base de las propiedades inmunológicas del Mg, se han establecido métodos serológicos para detectar anticuerpos contra Mg y detectar e identificar antígenos de Mg.
Furr et al. [7] informaron en detalle la tecnología MIF para detectar anticuerpos contra Mg en 1984. Moller et al. utilizaron MIF para detectar anticuerpos contra Mg en 31 pacientes con enfermedad inflamatoria pélvica aguda y descubrieron que alrededor de 40 de ellos tenían cuatro o más cambios en los títulos de anticuerpos dentro de un mes después del inicio. Taylor-Robinson et al [9] informaron que la prueba MIF indirecta es un método sensible, específico y simple para detectar anticuerpos contra Mg en pacientes con UNG. Jensen et al. utilizaron EIA para detectar anticuerpos contra Mg en muestras de sangre aguda de pacientes masculinos con ETS con y sin síntomas de uretritis y descubrieron que la reactividad era débil y tenía una amplia reactividad cruzada con Mp.
De acuerdo con las características de los anticuerpos específicos que pueden prevenir el crecimiento y el metabolismo del micoplasma, podemos utilizar sangre conocida de alto precio para realizar una prueba de inhibición del crecimiento y el metabolismo ancestral para identificar el micoplasma [11]. Zhao Jiwen y otros utilizaron el MIT para identificar la cepa de Mg aislada.
Las proteínas de membrana asociadas a lípidos (LAMP) expuestas en la superficie del micoplasma son antígenos específicos de especie con alta antigenicidad. Los anticuerpos LAMP de diferentes cepas de micoplasma son altamente específicos de especie y no se cruzan con otras especies. . reacción [12, 13]. ) Por lo tanto, LAMp que extrae Mg estableció un método ELISA para detectar anticuerpos contra Mg, que puede eliminar la reacción cruzada entre Mg y Mp. El método de sonda de ADN y el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para detectar Mg superan las deficiencias de los dos primeros métodos de detección y proporcionan un medio poderoso para estudiar la relación entre el Mg y la etiología de la enfermedad.
3.1 Tecnología de sondas de ADN 1987 Hyman [14] utilizó el vector PUCB para construir una biblioteca de genes de Mg y seleccionar sondas de ADN específicas a partir de ella. Mediante hibridación por transferencia puntual, se puede detectar ADN de micoplasma específico que contiene solo 0,1 ng, es decir, 105 UFC.
3.2 Tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una nueva tecnología de diagnóstico genético con alta sensibilidad, fuerte especificidad, rápida y sencilla. Desde 65438 hasta 0990, la tecnología PCR comenzó a aplicarse en ramas médicas.
Los primeros cebadores se diseñaron con referencia a la secuencia de ADN de las proteínas de adhesión bacterianas específicas del extremo. Palmer et al. amplificaron parte de la secuencia de nucleótidos de la proteína de adhesión de Mg in vitro. Apareció un fragmento de ADN de 37 pb en las tres cepas de Mg, lo que demuestra que la tecnología de PCR puede detectar entre 10 y 15 g de ADN-mg. >
mg 1:5 'TGT CTA TGACCA GTA TGT AC3'
Mg2:5 "CTG CTT TGG TCA AGA CAT CA3"
En 1991 Jensen et al. ] Se diseñaron y sintetizaron los siguientes conjuntos de cebadores basándose en el gen de la proteína de adhesión Mg:
mgPa-1 5' AGA TGA TGA AAC CCT AAC CCC TTG G3 '
mgPa-1 5'GAC Caterpillar CAA GGT ATT TCT CAA CAG C3 '
mgPa-1 5 ' CCG AGG GGT TTT CCA TTT TTG C3 '
MgPa-1 y MgPa-3 se amplificaron con éxito El fragmento de ADN de 281 pb de Mg, el mismo fragmento de ADN, fue amplificado por 5 aislados clínicos, y todos los demás micoplasmas y bacterias fueron negativos. Utilizando MgPa-2 como sonda, los productos de amplificación de hibridación de transferencia Southern eP fueron todos positivos, lo que demuestra que los cebadores eran específicos y redujeron la detección de *** en aproximadamente 50 Mg de células. 1993 Jensen et al. [17] diseñaron otro par de cebadores basados en el gen de la proteína mucosa Mg, a saber:
Se diseñó otro par de cebadores para el gen de la proteína de adhesión mg, a saber:
mgPa-476: 5' ATG GCG AGC CTA TCT TTG ATC CTT TAA 3'
mgPa-903: 5' TTC ACC TCC CCA CTA CTG TCC TAA tgc 3'
Para los resultados de amplificación de los cebadores MgPa-1 y MgPa-3 se confirmaron y complementaron, y el fragmento amplificado tenía 453 pb. Se encontró que la sensibilidad de estos dos pares de cebadores de proteínas de adhesión de Mg era exactamente la misma. Con este método se analizaron hisopos de orina de 99 pacientes con uretritis, y los resultados fueron positivos para Mg en 17 casos, mientras que ninguno fue positivo mediante el método de cultivo.
1994 Jensen[18] amplificó la secuencia genética de la proteína de adhesión Mg y la secuenció. Los resultados muestran que las secuencias en condiciones de Mg tienen una heterogeneidad obvia. Por lo tanto, basándose en la secuencia genética de 16SrRNA, Jensen y otros académicos diseñaron cebadores de PCR específicos para detectar todas las infecciones por Mg en muestras clínicas.
mg-1.5' GAA TGA CTC TAG CAG GCA ATG GCT G3 '
Mg-2,5' ATT TGC TGC TCA CTT TTA CAA GTT ggct 3'
Los resultados experimentales de cuatro muestras clínicas mostraron que las secuencias del gen de la proteína de adhesión de Mg eran diferentes, pero sus secuencias del gen 165rRN eran 100% homólogas. Utilizando una combinación de dos cebadores para PCR, se pueden detectar menos de 10 a 50 copias del gen Mg en muestras sospechosas de ser positivas, lo que garantiza un sistema de PCR dirigido al gen 16SrRNA.
Zhao Jiwen et al. [19] utilizaron cebadores diseñados por Palmer para amplificar el fragmento de ADN mg37pb y detectaron mg en tres poblaciones. Los resultados mostraron que la tasa positiva de personas promiscuas fue de 25,26, la tasa positiva de enfermedades de transmisión sexual fue de 65438 ± 02,33 y la tasa positiva de personas sanas fue de 3,85.
Kong et al. [20] utilizaron MgPa-1 y MgPa-3 diseñados por Jensen para amplificar el fragmento de ADN Mg281bp. Los resultados de la prueba mostraron que la tasa de detección de Mg entre mujeres sexualmente promiscuas fue de 65438 ± 00,2 y la tasa de detección de Mg entre pacientes con ETS fue de 4,0.
En 1998, Mi Huangzu et al [2] informaron sobre dos tecnologías de detección de PCR anidadas basadas en la proteína de adhesión Mg y el gen 16rRNA, respectivamente. El primero amplificó un fragmento de ADN de 374 pb del Mg original y el segundo amplificó un fragmento de ADN de 241 pb. La PCR anidada no sólo mejora la sensibilidad, sino que también mejora aún más las propiedades gracias al uso de dos pares diferentes de cebadores. Utilizando estos métodos para detectar 40 pacientes femeninas con ETS, se encontró que 12 casos eran Mg positivos, con una tasa positiva de 30, que es más alta que la PCR ordinaria. El "estándar de oro" para diagnosticar infecciones microbianas es el cultivo, pero la tasa de éxito del cultivo de Mg es extremadamente baja y se necesitan más investigaciones y mejoras para promover el crecimiento de Mg. Además, la introducción de líneas celulares en el cultivo de Mg puede ser un buen método, por lo que es necesario fortalecer la exploración e investigación en esta área. Los métodos de detección inmunológica están limitados en aplicaciones prácticas debido a la reactividad cruzada entre especies de micoplasmas y la alta pureza de antígenos y anticuerpos. Es de gran valor práctico estudiar y establecer un método rápido, sensible y específico para detectar el antígeno Mg en muestras clínicas. La PCR es un método simple y directo para detectar Mg y se está utilizando ampliamente. Se utiliza principalmente para el diagnóstico precoz de infección por Mg o infección aguda y el estudio epidemiológico del Mg en diversas poblaciones. Sin embargo, cabe señalar que: ① el bajo contenido de Mg en las muestras clínicas, la pureza insuficiente del ADN, demasiados inhibidores y la baja actividad de la TaqDNA polimerasa provocarán falsos negativos, y la tecnología de extracción del ADN molde debe mejorarse aún más; alta sensibilidad de la PCR, en La contaminación de los productos de PCR debe evitarse estrictamente durante toda la operación para reducir los falsos positivos.