Análisis de la base de datos del genoma de tumores caninos
Fecha de publicación: 27 de marzo de 2020
Factor de impacto: 12+438+0
DOI: 10.1158/1078- 0432. CCR-19-3283
El carcinoma de células renales por translocación es un subtipo raro y agresivo de carcinoma de células renales. El carcinoma de células renales por translocación familiar (CCRt) de MiTF representa aproximadamente el 4% de los casos de carcinoma de células renales (CCR) en adultos y el 41,5% en niños, respectivamente, y los casos pediátricos generalmente muestran resultados más favorables. La enfermedad se caracteriza por la fusión de los factores de transcripción TFE3 o TFEB (ubicados en los loci cromosómicos Xp11.2 y 6p21, respectivamente) con sitios con fuerte actividad transcripcional. Los factores de transcripción MiTF están involucrados en la regulación de genes relacionados con el crecimiento celular, el metabolismo y la biogénesis de los lisosomas, pero las formas específicas y los mecanismos moleculares que desencadenan la tumorigénesis e impulsan la invasión del tRCC no están claros. Actualmente, no existen biomarcadores de pronóstico ni tratamientos estándar para la enfermedad avanzada en este subtipo raro y agresivo de CCR.
1. Fuente de datos
(1) Cohorte de impacto de MSK (descubrimiento): se identificaron 37 pacientes con tRCC, se excluyeron 15 muestras en función de diversos factores y finalmente se excluyeron 22 muestras de pacientes con tRCC. obtenido . (Figura S1A)
(2) Cohorte del exoma de MSK: un subconjunto (n = 10) de la cohorte afectada por MSK se sometió a una secuenciación adicional del exoma completo (WES).
(3) Cohorte de exoma TCGA (validación): se identificaron pacientes con tRCC no MSK a partir de la cohorte de riñón completo (TCGA-Kipan) de The Cancer Genome Atlas y finalmente se identificaron 12 muestras de TCGA (Figura S1B). ).
2. Métodos experimentales
(1) Secuenciación dirigida por impacto MSK
(2) Secuenciación, procesamiento y análisis de mutaciones de exones completos:
(3) Análisis del número de copias específico de alelo (ASCN): realizado por FACETS, un algoritmo bioinformático.
(4) Cálculo de la carga de mutaciones tumorales (TMB)
(5) Análisis de la fracción de células cancerosas: las mutaciones con fracción de células cancerosas (CCF) ≥ 0,9 se definen como mutaciones clonales, y todas las demás mutaciones se consideran subclones. Utilizando estas definiciones, se calculó el índice de heterogeneidad intratumoral (ITH) (rango 0, +∞) comparando el número de mutaciones subclonales y clonales (#subclones/#clon).
(6) Predicción de neoantígenos y deconvolución de células inmunes: Evaluar diferencias en la expresión característica relacionada con la angiogénesis, PD1, PD-L1 y CTLA4 entre casos de tRCC y otras histologías de RCC. El análisis de enriquecimiento del conjunto de genes (ssGSEA) se realizó utilizando firmas genéticas descritas previamente a partir de datos de secuencia de ARN de una sola muestra. ssGSEA calculó la sobreexpresión relativa del conjunto de genes de interés en cada muestra.
(7) Análisis estadístico: Analizar casos con información completa del genoma (n=22). Las asociaciones entre FCNAg y las variables clínico-patológicas al inicio del estudio (es decir, estadio clínico y edad) se evaluaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. De la misma manera, TMB en TCGA comparó tRCC con otros subtipos de RCC (KIRC, KIRP, KICH) y se evaluó la diferencia en FCNAg entre los dos grupos. Se detectaron diferencias en la expresión del gen PD-L1 entre tRCC y otros tumores en los subgrupos TCGA correspondientes (KIRC, KIRP).
Los autores se centraron en analizar mutaciones somáticas en la cohorte afectada por MSK. Después de excluir las fusiones de TFE y los cambios en el número de copias, 15/22 (68,2%) pacientes tuvieron variaciones o inserciones somáticas de un solo nucleótido. Estuvieron presentes posibles mutaciones conductoras oncogénicas en las vías SWI/SNF y de reparación de daños en el ADN (DDR) en 5/22 (22,7%) muestras. En tres pacientes, los autores identificaron mutaciones activadoras del promotor TERT (C228T) que ocurrieron en etapas altas de AJCC, lo que sugiere que la activación de TERT puede ser una característica novedosa del tRCC agresivo. Utilizando el análisis del número de copias específico de alelo (ASCN), los autores confirmaron que se clonaron 1/2 mutaciones ATM y 1/1 mutaciones smar C4, y que sólo la mutación ATM clonada estuvo acompañada por la pérdida de heterocigosidad del alelo complementario, lo que indica que la lesión puede ser el principal factor determinante en la patogénesis de los tumores.
El TMB se puede utilizar como biomarcador de buena respuesta al BCI en muchos cánceres sólidos. Dado que es difícil cuantificar con precisión la TMB en tumores con baja carga de mutaciones utilizando NGS dirigida, los autores evaluaron la TMB a partir de la secuenciación del exoma de 10 pacientes del exoma de MSK y 12 pacientes del exoma de TCGA y calcularon los tRCC. La mediana de la TMB fue de 0,80 mut/Mb. (Figura 1C). A diferencia de todas las demás cohortes de TCGA-RCC, TMB fue consistente en todas las cohortes de exoma de TCGA y MSK. Además, el TMB del tRCC era diferente de otros subtipos de RCC: menor que el del carcinoma de células renales de células claras (KIRC) y el carcinoma de células papilar renal (KIRP), pero mayor que el del carcinoma de células renales cromófobos (KICH) (Figura 1B) . No se encontraron supuestas mutaciones explicativas en casos de tRCC anormales con TMB particularmente alto.
La clonalidad de las mutaciones somáticas se resumió utilizando el índice de heterogeneidad global intratumoral (índice ITH). Teniendo en cuenta todas las mutaciones, la mediana del índice ITH para todas las muestras de exones de tRCC fue de 0,82, lo que indica una mayor incidencia de eventos clonales que de eventos subclonales. Esto es consistente con el patrón evolutivo del tRCC, con mutaciones somáticas tempranas seguidas de una pequeña cantidad de mutaciones subclonales. Estos resultados indican que los tumores tRCC muestran una carga mutacional relativamente baja y, con la excepción de las translocaciones de MiTF, relativamente pocos eventos mutacionales oncogénicos típicos. Y en el caso de mutaciones con pérdida de función en genes supresores de tumores, la pérdida de heterocigosidad (LOH) del alelo de tipo salvaje rara vez ocurre simultáneamente.
Los autores evaluaron la inmunogenicidad de muestras TCGA-tRCC y la composición del microambiente tumoral. En 8/14 (57,1%) casos, se identificó una afinidad de unión significativa al epítopo HLA, con una afinidad media de 98,5 nM. También se utilizó la tecnología de deconvolución inmune para detectar diferencias en la angiogénesis en ccRCC y la firma genética de tres objetivos de inmunoterapia: PD1, PD-L1 y CTLA4. El perfil de expresión de genes angiogénicos en TRCC fue mayor en comparación con el carcinoma papilar de células renales, pero menor que en el tumor de células claras, pero casi equivalente. Los tRCC también mostraron un perfil de expresión más alto de PD-L1 en comparación con las cohortes KIRC y KIRP. No se encontraron diferencias significativas entre CTLA4 y PD1.
En análisis anteriores de tRCC, la eliminación del cromosoma 9p y la elevación del brazo 17q fueron comunes, y la elevación del brazo 17q puede ser un biomarcador de pronóstico. En comparación con estudios anteriores, este estudio utilizó el análisis del número de copias específico de alelo (ASCN), que puede detectar con mayor sensibilidad pequeñas ganancias y pérdidas neutras en el número de copias de eventos de heterocigosidad. Por lo tanto, los autores evaluaron la relación entre los eventos del número total de copias y las características clínicas y la SG en tRCC. Primero, se calculó la fracción del genoma con alteraciones en el número de copias (FCNAg). La cohorte de impacto de MSK tuvo una mediana de FCNAg de 0,16 y la cohorte de TCGA tuvo una mediana de FCNAg de 0,09. En la cohorte TCGA, se encontró que el estadio AJCC alto (III/IV) estaba asociado con FCNAg alto, pero en la cohorte afectada por MSK, este resultado no fue estadísticamente significativo (Figura 2).
A continuación, los autores estudiaron más a fondo los cambios en el número de copias en la cohorte afectada por MSK. En la cohorte knockout de MSK, los cambios más comunes en el número de copias del brazo horizontal fueron la pérdida de 9p en 9/22 (465, 438+0%) pacientes, la ganancia de 17q en 8/22 (36%) pacientes y la ganancia de 17q en 8/22 (36%) pacientes 6p. En la cohorte afectada por MSK, ningún evento de número de copias se asoció significativamente con la supervivencia general. Sin embargo, se encontraron 3/3 mutaciones de TERT en tumores con deleción de 9p, y la presencia de deleción de 9p se asoció significativamente con FCNAg más alta tanto en las cohortes de MSK como en las de TCGA (Fig. 3).
Basándose en el TMB relativamente bajo y la frecuencia relativamente alta de cambios en el número de copias en tRCC, los autores intentaron evaluar la correlación entre los resultados clínicos y las medidas resumidas de los cambios en el número de copias. Se definió una cohorte de pacientes con anomalías en el número de copias caracterizadas por pérdida de 9p, ganancia de 17q o FCNAg por encima de la mediana de la cohorte. En la cohorte MSK-IMPACT, 15 pacientes con CNA tuvieron una supervivencia general deficiente. En la cohorte TCGA, este análisis no fue estadísticamente significativo. Sin embargo, los puntos de supervivencia estimados fueron muy similares (SG a 5 años 57,1 % frente a 100 %), lo que sugiere que el análisis no tuvo suficiente potencia debido al tamaño de muestra insuficiente de los datos de TCGA.
Dos tumores en la cohorte afectada por MSK y dos tumores en la cohorte TCGA mostraron pérdida bialélica de CDKN2A/B; el tratamiento de estos tumores como un solo grupo para los fines del análisis de supervivencia no tuvo ningún efecto significativo, lo que sugiere que las deleciones bialélicas no son el único factor de la pérdida bialélica. Mal pronóstico en los tumores de CNA. Por lo tanto, los autores realizaron un metanálisis de los resultados de ambas cohortes y demostraron una asociación estadísticamente significativa entre el estado del tumor con un número de copias anormal y una supervivencia deficiente.
Este estudio identificó a un paciente tratado en una institución cuya muestra de tumor tRCC en etapa temprana fue secuenciada como parte del consorcio TCGA. El paciente fue sometido a una nefrectomía parcial hace unos 20 años y desarrolló una masa renal de 4,5 cm, diagnosticada como carcinoma papilar de células renales de alto grado. Ocho años más tarde, se produjo una recurrencia local en el mismo riñón donde se extirpó el tumor original, lo que resultó en la finalización de una nefrectomía radical y una disección de los ganglios linfáticos retroperitoneales (muestra TCGA BQ-5887). Cabe señalar que todos los ganglios linfáticos obtenidos durante este procedimiento estaban libres de tumores. En comparación con muestras anteriores, se encontró que la recurrencia renal local tenía características morfológicas consistentes y una reordenación del gen TFE3, lo que provocó que el diagnóstico inicial fuera tRCC de la familia MiTF. El paciente permaneció asintomático durante más de 8 años, luego desarrolló dolor abdominal y de espalda intenso debido a la diseminación generalizada de la enfermedad en la parte superior del abdomen y el retroperitoneo. Se realizó una biopsia de un ganglio linfático retroperitoneal y se encontró que tenía una fusión PRCC-TFE3 (muestra MSK-RP-5887). En ese momento, al paciente se le diagnosticó enfermedad metastásica y se inició tratamiento sistémico (Figura 4). Después de una fase inicial de respuesta parcial a everolimus/bevacizumab, las lesiones abdominales se estabilizaron y luego volvieron a crecer (también aparecieron nuevos sitios de enfermedad en el pecho). En este punto, se suspende el tratamiento y el paciente recibe terapia de segunda línea, lo que produce una respuesta mixta, en la que algunas lesiones se reducen pero otras se extienden. Después de la terapia de tercera línea (más toxicidades significativas relacionadas con los TKI), el paciente rechazó otros tratamientos y decidió recibir cuidados paliativos.
Se confirmó patológicamente que el tumor recién descubierto era metástasis en los ganglios linfáticos y tenía evidencia de fusión PRCC-TFE3 (confirmada por secuenciación IHC, FISH y MSK-IMPACT). Para comprender la relación clonal de estos tumores, los autores secuenciaron exomas de metástasis en los ganglios linfáticos y compararon las aberraciones y mutaciones del número de copias entre MSK-RP-5887 y TCGA-BQ-5887. Curiosamente, estas dos muestras mostraron duplicación del genoma completo (WGD) y cambios generalizados en el número de copias en todo el genoma, de modo que FCNAg era anormalmente alto en comparación con otros tumores tRCC. De hecho, la gran mayoría de los eventos a nivel del brazo (78%) fueron causados por la aparición simultánea de dos tumores. En particular, la eliminación del cromosoma 9p fue evidente en ambas muestras y, en ambos casos, precedió al evento WGD. Estos hallazgos son consistentes con que la CNV sea un evento temprano en el desarrollo del tumor. Por el contrario, solo el 23% de las mutaciones somáticas se compartieron entre los dos tumores (índice ITH, MSK-RP-5887: 5.3, TCGA-BQ-5887: 16), lo que sugiere que en el estudio más reciente se produjo una amplia diversificación mutacional después de la divergencia. del ancestro fuente (MRCA). En conjunto, esto sugiere que en este tumor tRCC en particular, los cambios en el número de copias ocurren temprano en la evolución del tumor, mientras que la mayoría de las mutaciones somáticas ocurren más tarde (Figura 4). Este resultado es inconsistente con la mediana del índice i-ésimo informado anteriormente (0,82), que puede reflejar diferentes patrones evolutivos del CCRt metastásico y primario.
Los autores evaluaron las respuestas en 14 pacientes de la cohorte MSK-IMPACT, que en la mayoría de los casos recibieron múltiples líneas de terapia sistémica. Cinco de 14 pacientes (35,7%) experimentaron una prolongación del TOT (>:12 meses). Al comparar a los que respondieron y los que no respondieron, no se encontraron diferencias en la mediana de FCNAg. En particular, un paciente que tuvo una respuesta a largo plazo a la terapia con ICB tenía mutaciones sin sentido en dos genes del complejo de remodelación de la cromatina PBAF, SMARCA4 y PBRM1, cuyas variantes se han relacionado recientemente con la inmunogenicidad.
Finalmente se evaluaron los cambios moleculares en pacientes menores de 18 años (n=3). Sus sitios de aparición y procesos de tratamiento se muestran en la Figura 6. Dos pacientes habían recibido quimioterapia previamente: uno era un paciente con retinoblastoma que también tenía evidencia de mutación RB1 y el otro era un paciente con neuroblastoma.
No hubo pérdidas de 9p ni ganancias de 17q en todos los casos pediátricos, y se encontró consistentemente una disminución significativa en FCNAg en niños en comparación con pacientes mayores.
La NVC parece desempeñar un papel clave en el pronóstico del CCRt. La distorsión del número de copias es común en tRCC y parece conducir a malos resultados. La presencia de mutaciones en el punto de acceso de TERT en casos de enfermedad avanzada sugiere una asociación con la progresión molecular del tRCC. La mayor frecuencia de eventos oncogénicos, incluidas mutaciones somáticas y CNV, en pacientes adultos puede conducir a un fenotipo de enfermedad más agresivo. Las características inmunofenotípicas únicas del tRCC justifican más estudios.