Evidencia de un papel importante de la inflamación en los xenotrasplantes
El trasplante de órganos es una de las historias de éxito médico de los últimos 70 años, pero los órganos de donantes humanos fallecidos todavía no son suficientes para tratar a todos los pacientes que podrían beneficiarse. Por ejemplo, en Estados Unidos hay actualmente aproximadamente 654,38 millones + 200.000 pacientes esperando por un órgano u otro. Sólo hay alrededor de 654,38+0 millones de donantes humanos que han muerto este año, y cada donante proporciona un promedio de 3 a 4 órganos [654,38+0].
La escasez de órganos humanos se puede evitar si se dispone de fuentes adecuadas de órganos animales. Por varias razones lógicas y de otro tipo, los cerdos han sido identificados como una fuente potencial de trasplante de órganos clínicos [2]. Por lo tanto, el campo de los xenotrasplantes (trasplantes entre especies) ha sido ampliamente estudiado durante los últimos 35 años [3]. Aunque los órganos de cerdos salvajes trasplantados a humanos o primates no humanos (NHP) son rechazados en cuestión de minutos [4], los cerdos están genéticamente modificados para proteger sus órganos de los primates. La capacidad de la respuesta inmune del animal ha permitido que los riñones o trasplantes de corazón para sobrevivir durante meses o incluso más de un año en NHP [5 - 9]. Uno de los obstáculos que hubo que superar, pero que sigue siendo un problema, es la respuesta inflamatoria de los órganos de los cerdos.
La inflamación es parte de la compleja respuesta biológica de los tejidos corporales a estímulos dañinos y se puede observar en una variedad de enfermedades, como enfermedades inflamatorias [10], infecciones [11] y aterosclerosis [12]. Se requiere una liberación adecuada de citocinas y quimiocinas proinflamatorias para la inmunidad protectora, pero la sobreproducción de estos factores puede conducir a diversos estados patológicos [13]. La respuesta inflamatoria ocurre en la lesión por isquemia-reperfusión después del trasplante de órganos [14]. Esto puede desempeñar un papel importante en el inicio de respuestas aloinmunes [15] y el desarrollo de la enfermedad vascular del aloinjerto [16].
Cada vez hay más evidencia de la existencia de inflamación sistémica en xenoinjertos porcinos ("Systemic Inflammation in Xenograft Recipients" [SIXR]) [17-19]. La inflamación promueve la coagulación [17-21] y la activación de las respuestas inmunes [17, 18] después del xenotrasplante [22, 23]. En los receptores de xenoinjertos de órganos, la proteína C reactiva (C-RP) aumenta antes del desarrollo de coagulopatía de consumo o respuestas de células T [17,18]. Las células inmunes innatas infiltrantes expresan el factor tisular, que desempeña un papel en el inicio de la coagulación [24]. La inflamación inhibe el desarrollo de la tolerancia de las células T [22, 25].
Aquí revisamos la evidencia de respuestas inflamatorias sistémicas a largo plazo en xenotrasplantes y consideramos qué medidas se pueden tomar para prevenirlas o reducirlas. Utilizamos principalmente nuestras propias observaciones, pero las complementamos con una revisión de la literatura.
La proteína C reactiva (C-RP) es una proteína de fase aguda sintetizada principalmente por los hepatocitos en respuesta a citocinas proinflamatorias, especialmente la interleucina-6 (IL-6) [31]. C-RP proporciona la primera línea de defensa contra patógenos invasores y promueve la activación del complemento, la inflamación de la envoltura bacteriana y la fagocitosis [32]. Este es un signo temprano de infección y proporciona un parámetro objetivo simple [33]. Además, cuando se produce un rechazo agudo del trasplante renal, aumenta la expresión del ARNm de C-RP [34]. La C-RP no sólo previene la infección del huésped sino que también mejora el daño inflamatorio del tejido.
Después del trasplante de órganos de cerdo a babuino, la C-RP aumentó al cabo de varios meses, lo que indica un estado inflamatorio persistente13,19,26 depositado en el riñón de cerdo trasplantado18.
No se sabe si este es un factor secundario en la unión inicial del anticuerpo.
El amiloide A sérico (SAA) es una proteína de fase aguda importante y un marcador relacionado con la inflamación en la tuberculosis, la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn y varios tipos de cáncer [35, 36]. SAA también es un marcador sensible de rechazo agudo de aloinjertos [37]. Los hepatocitos son la principal fuente de SAA [38]. El aumento de SAA se debe a aumentos en la interleucina-6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) séricos circulantes [39]. Las citocinas relacionadas con la inflamación producidas por las células endoteliales (CE), los linfocitos, los monocitos específicamente activados y los macrófagos estimulan la síntesis de amiloide A [35, 40]. Por el contrario, el SAA puede inducir la liberación de algunas citocinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral α, la IL-1β y la quimiocina IL-8 [41, 42]. Sin embargo, el SAA también puede inducir la secreción de quimiocinas, que pueden suprimir localmente la inflamación [43] y movilizar fosfolípidos y colesterol para la reparación celular [44].
Después del xenotrasplante de cerdo a babuino, se han observado aumentos significativos en SAA durante el rechazo mediado por anticuerpos (Fig. 2) o cuando se produce coagulopatía de consumo o infección [26, 27]. El amiloide A se deposita en riñones de cerdo trasplantados [28]. Aunque los métodos actuales para medir la SAA no son completamente cuantitativos, es un indicador simple y rápido del estado inflamatorio, que permite la detección temprana de condiciones como rechazo, infección u otras complicaciones.
Las histonas extracelulares desempeñan un papel clave en la inflamación in vivo [45], contribuyen a la disfunción de la CE (p. ej., marginación de neutrófilos, hemorragias, trombosis), mientras que in vitro, contribuyen a que la CE sea citotóxica [45]. . Se han identificado cinco tipos de histonas [46, 47]. La liberación de histonas puede desencadenarse por sepsis, traumatismo, toxicidad química, lesión del injerto e isquemia/reperfusión [48]. Se unen a receptores tipo Toll (TLR) en varias células, como plaquetas y eritrocitos [49], y luego inducen necrosis (muerte celular con liberación del contenido de los gránulos fuera de la célula), lo que a su vez aumenta la liberación de histonas y amplifica la inflamación. [50-57].
La actividad protrombótica directa de los complejos histona-ADN aumenta la formación de citocinas inflamatorias y promueve la respuesta trombótica mediante la activación de los TLR 2, 4 y 9 [48]. La trombomodulina, induce el factor tisular y regula positivamente el inhibidor del activador del plasminógeno [48], y las histonas también pueden causar activación plaquetaria directa [53, 58]. Hay evidencia de que los niveles de neutrófilos en los receptores de xenoinjertos aumentarán [26]. bloqueo (con tocilizumab), los niveles medios de histonas séricas aumentaron significativamente después del trasplante de órganos porcinos. La reducción en el número de células puede reducir la liberación de histonas extracelulares [59, 60]. la partenolida (Figura 3B) redujo significativamente la liberación de histonas inducida por histonas en cerdos. La apoptosis/muerte de las CE se observa en muchas enfermedades inflamatorias e inmunes. producto de la degradación de la fibrina reticulada dentro de los vasos sanguíneos se ha observado un aumento de las concentraciones de dímero D en la sangre en enfermedades de la coagulación y trombóticas [62], posiblemente activando neutrófilos y monocitos e induciendo la secreción de citocinas inflamatorias como la IL-6. promover la cascada inflamatoria [62-65]
El dímero D también puede ser un marcador de inflamación [19, 64, 66, 67] y puede elevarse cuando los xenoinjertos fallan (Figura 4) [19].
Las citocinas/quimiocinas proinflamatorias ayudan a combatir la infección, pero pueden inducir inflamación sistémica [68,69, IL-6 porcina, IL-1β y células endoteliales de la vena umbilical humana activadas por α (HUVEC). ) [70] Las células endoteliales aórticas porcinas (PAEC) pueden activarse significativamente mediante IL-6, IL-17, IL-1β y α humanas. [70] Por ejemplo, (I) humanas. El TNF-α aumenta la expresión de genes de moléculas de adhesión como E-selectina, VCAM-1 e ICAM-1, (ii) IL-6 humana e IL-65438) y el factor tisular aumenta, y (. iii) la expresión del antígeno leucocitario porcino de clase I es inducida por la IL-1β humana y el factor de necrosis tumoral-α [70].
Todas las citocinas/quimiocinas mencionadas anteriormente pueden promover la inflamación y la coagulación en xenoinjertos.
Los niveles de ciertas citoquinas pueden aumentar después de un xenotrasplante en ausencia de terapia inmunosupresora, pero no con terapia inmunosupresora18.
La inflamación juega un papel clave en la activación y agregación plaquetaria [71], que a su vez juega un papel importante en la disfunción de la coagulación después del xenotrasplante [72]. Las histonas extracelulares se unen a los TLR de las plaquetas, especialmente a TLR2 y TLR4, lo que lleva a la agregación plaquetaria [51, 53]. En humanos, la citoquina IL-17 puede promover la activación y agregación plaquetaria a través de las vías de señalización ERK2 y p53 [73, 74], aunque el mecanismo exacto no está claro [75]. Las plaquetas receptoras también pueden activarse uniéndose directamente a células endoteliales porcinas [76]. En ausencia de suero o anticuerpos humanos, las plaquetas humanas pueden aumentar la expresión del factor tisular al entrar en contacto con las pAEC, lo que puede conducir a la coagulación mediante la generación de trombina [77].
Existe una relación entre niveles bajos de triyodotironina libre (Ft3) en plasma y la inflamación [78-82]. El ft3 plasmático disminuye después de la muerte cerebral [83, 84] y de procedimientos quirúrgicos mayores, especialmente cirugía cardíaca con bypass extracorpóreo [85-89].
En babuinos receptores que recibieron xenoinjertos de corazón, riñón, hígado y parche arterial porcino, el ft3 disminuyó rápidamente y tardó varios días en volver a los niveles previos al trasplante. 26 Se ha informado que la IL-6 y el TNF en suero. -α están inversamente relacionados con las concentraciones de hormona tiroidea [80]. Es casi seguro que los niveles bajos sostenidos están relacionados con la respuesta inflamatoria en el xenoinjerto [26].
Hasta hace poco, el principal obstáculo para el éxito del trasplante de órganos porcinos en los PNH era la coagulopatía causada por la generación excesiva de trombina [90-93]. La activación del receptor de trombina amplifica las células dendríticas maduras para producir la quimiocina CCL18 y la quimiocina regulada por activación pulmonar [94]. La trombina puede regular positivamente el ARNm de ICAM-1 in vitro e inducir la expresión de ICAM-1 en monocitos [95] y activar NF-κB [96].
Es bien conocido que la inflamación contribuye a la activación de la coagulopatía [17, 18, 70, 97, 98]. El factor tisular no sólo es un promotor de la trombina sino también un marcador de inflamación [99, 100]. El factor de necrosis tumoral α [101], IL-6 [102] y C-RP [103] aumentan la expresión del factor tisular en las células inmunes innatas, promoviendo así la coagulación sanguínea [100, 103]. Existe un circuito de amplificación entre la coagulación y la inflamación, que conduce a la activación de mediadores inflamatorios y factores procoagulantes [20]. Por lo tanto, el tratamiento y la prevención de la inflamación pueden ser factores importantes para minimizar la coagulopatía después del xenotrasplante porcino.
Una importante observación realizada recientemente demostró que cuando las células endoteliales porcinas que expresaban sólo la trombomodulina porcina nativa (que también tiene efectos antiinflamatorios) eran activadas por el factor de necrosis tumoral alfa, la expresión de la trombomodulina se regulaba significativamente a la baja ( Figura 7A) [98]. Esto sugiere que la microangiopatía trombótica puede ocurrir cuando los órganos porcinos están expuestos a inflamación, lo cual es común después del trasplante de órganos porcinos a NHP. La falta de efectos antiinflamatorios de la trombomodulina humana puede conducir al desarrollo temprano de coagulopatía de consumo [6]. Por el contrario, la expresión transgénica de la trombomodulina humana no se reguló negativamente, manteniendo así sus efectos anticoagulantes y antiinflamatorios (Fig. 7b) [98].
El aumento significativo de ciertas citocinas/quimiocinas después del xenotrasplante puede ser el resultado de la actividad de las células inmunes innatas y es probable que sea el factor causante de la lesión del xenoinjerto [17, 18]. Las respuestas inmunes inflamatorias e innatas mejoran las respuestas inmunes adaptativas70,98.
La regulación positiva de los marcadores inflamatorios sistémicos se asocia con un bloqueo ineficaz de las respuestas inmunes adaptativas dependientes de las células T [105].
En un estudio in vitro, la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) humanas aumentó significativamente cuando las pAEC se activaron con interferón-γ porcino, lo que respalda el concepto de que la inflamación mejora las respuestas inmunes de los xenoinjertos. La inducción de la tolerancia de las células T después del trasplante es inhibida por la inflamación [25]. La secreción de citocinas y quimiocinas afecta el resultado de los aloinjertos al afectar la respuesta inmune [107, 108]. Los aumentos inducidos por IL-7, IL-8 e interferón-γ en la proteína 10, el ligando de quimiocina 9 y el ligando de quimiocina 2 y 5 se asocian con una disfunción temprana del aloinjerto [109-111].
La inflamación, la coagulación y la respuesta inmune tienen una relación compleja [23, 50]. Por ejemplo, la trombina activa la respuesta de las células humanas a las células de cerdo in vitro, induciendo una respuesta de proliferación de células T en la misma medida que la activada por el interferón-γ (Figura 8B) [97].
Se han probado varias estrategias destinadas a prevenir o reducir la inflamación excesiva después de un xenotrasplante, y algunas han recibido aprobación clínica.
Corticosteroides
Los corticosteroides activan múltiples genes, incluidos los inhibidores de NF-κB con efectos antiinflamatorios [120]. Los niveles de IL-6, IL-8 y MCP-1 disminuyeron después de la administración a receptores de xenoinjertos de corazón porcino [13]. Sin embargo, el dímero D todavía está elevado, independientemente de los corticosteroides y/o el tratamiento antiinflamatorio, lo que indica que la respuesta inflamatoria es persistente [13].
Agentes anticomplemento
Aunque el factor de veneno de cobra (CVF) se utiliza principalmente para consumir complemento [121], MCP-1, IL-8 e IL-6 se reducen después administración [13]. Después de que a los babuinos trasplantados con parches de arteria porcina se les administraron factores de veneno de cobra, IL-6, IL-8 y MCP-1 seguían siendo más bajos que antes del trasplante, o equivalentes a antes del trasplante [13]. Eculizumab es un anticuerpo monoclonal anti-C5 humanizado que inhibe la vía efectora terminal del complemento al prevenir la escisión de la convertasa C5 [122]. Altera los perfiles de citocinas aumentando el interferón-γ y la IL-17 y disminuyendo la IL-4. [123-125]. Cp40 es un péptido cíclico compuesto por 14 aminoácidos y es un inhibidor del complemento que inhibe la producción de efectores proinflamatorios (como el factor de necrosis tumoral α, IL-1β e IL-17) al inhibir la activación de C3 [126 , 127]. Los inhibidores de C1 son los únicos inhibidores de proteínas plasmáticas conocidos de las serina proteasas C1s y C1r de la vía clásica del complemento. Reducir algunas citocinas proinflamatorias (factor de necrosis tumoral α, IL-18) y aumentar las citocinas protectoras (IL-10) [128, 129].
Bloqueo del receptor de IL-6 e inhibidores de IL-6
El tratamiento de receptores de xenoinjertos porcinos con NHP con el bloqueador del receptor de IL-6 tocilizumab da como resultado C- Los niveles de RP (Fig. 1A) [19] y las histonas séricas (Fig. 3A) [26] se redujeron significativamente. Sin embargo, el dímero D todavía está elevado (Figura 4) [13, 19]. El bloqueo de los receptores de IL-6 también se asoció con una rápida recuperación de los niveles reducidos de ft3 después de los xenoinjertos (Fig. 6) [26].
Tocilizumab tiene varios otros efectos beneficiosos sobre la respuesta inmune al injerto. Reduce el número de células B de memoria [130, 131] y células plasmáticas [132] pero aumenta la proporción de células B reguladoras [133] y células T reguladoras [134]. También reduce los monocitos y las células dendríticas de la médula ósea [135]. Los receptores de trasplantes de riñón tratados con tocilizumab desarrollan menos rechazo mediado por anticuerpos [136] y tienen niveles reducidos de anticuerpos específicos del donante [137].
Sin embargo, evidencia reciente sugiere que tocilizumab se une a los receptores de IL-6 de primates pero no a los receptores de IL-6 en trasplantes porcinos [70], por lo que puede no tener ningún efecto protector. Siltuximab es un inhibidor de la IL-6 que tiene un efecto terapéutico en la enfermedad de Castleman y algunas enfermedades inflamatorias al neutralizar la producción de IL-6 [138]. La neutralización de IL-6 con siltuximab dio como resultado una supresión sostenida de C-RP en la enfermedad de Castleman [112], pero no fue completamente efectiva en xenoinjertos [Zhang G et al., manuscrito en preparación].
Anticuerpos antihistonas
Las histonas extracelulares y las vías TLR son los principales objetivos para el tratamiento de diversas inflamaciones. La terapia con antihistonas tiene el potencial de prevenir la inflamación inducida por histonas en xenoinjertos [26]. El uso de anticuerpos antihistonas (p. ej., anticuerpos monoclonales contra la histona H4) puede inhibir la producción de citocinas y prevenir diversas agresiones inflamatorias [45, 56, 139-147]. El efecto protector de la rTBM contra la toxicidad de las histonas está mediado mediante la activación de vías dependientes e independientes de la proteína C [148]. Los anticuerpos antihistonas no se han probado en modelos in vivo de xenoinjertos.
Inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa
Los inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa [113] reducen la activación de las CE.
La proteína de fusión del receptor de TNF (TNF-RFP) puede reducir la inflamación en modelos de perfusión xenogénica in vivo, aunque el mecanismo no está claro [113].
Inhibidores de NF-κB
NF-κB juega un papel importante en la mejora de las respuestas celulares a la inflamación. La trombina no sólo puede activar NF-κB, sino también regular positivamente los genes dependientes de NF-κB [87]. Debido a que las histonas extracelulares pueden inducir la expresión del factor tisular en las células endoteliales a través de la vía NF-κB, amplifica la generación de trombina [149]. El inhibidor de NF-κB partenolida reduce la apoptosis/muerte de células endoteliales porcinas cultivadas in vitro. Se informa que la anisolactona también tiene el efecto de reducir el shock de endotoxinas y prevenir la inflamación en la glomerulonefritis inmune [150]. Se utiliza como tratamiento preventivo para la migraña y se ha informado que tiene efectos beneficiosos en ensayos clínicos [151].
Alfa 1-cardioglobulina (AAT)
La AAT es un prototipo de inhibidor de la serina proteasa que abunda en la sangre humana. Aunque es producida principalmente por hepatocitos [152], también es producida por otras células (por ejemplo, células epiteliales [153], monocitos [154], macrófagos y neutrófilos [155, 156], células epiteliales intestinales [65438]. Los niveles plasmáticos de AAT aumentan durante la inflamación. e infección [160]
La AAT tiene efectos antiinflamatorios, antimigración de leucocitos, antiapoptóticos y antitrombóticos [161-166]. Niveles de citoquinas inflamatorias (IL-8, IL-1β, α) [115] En monos que recibieron aloinjertos de islotes, la AAT previno las respuestas inflamatorias [167], pero cuando los babuinos recibieron parches arteriales de cerdos genéticamente modificados, el tratamiento con AAT no tuvo ningún efecto sobre los niveles de IL-8 y C-RP durante el trasplante de parches [13].
Inhibidores plaquetarios
La aspirina se usa ampliamente como fármaco para prevenir enfermedades vasculares y se asocia con una reducción del infarto de miocardio y los accidentes cerebrovasculares [168]. la aspirina regula a la baja algunas citocinas proinflamatorias (como la IL-6) [116] y las vías de señalización proinflamatorias, incluido el NF-κB [169-171].
Triyodotironina
. No está claro si la T3 puede suprimir el estado inflamatorio en presencia de xenoinjertos porcinos [79], pero el tratamiento con T3 redujo la inflamación (p. ej., factor de necrosis tumoral α, IL-6) y mejoró el control glucémico en ratas diabéticas [119].
Sin embargo, como los niveles de FT3 disminuyeron en todos los babuinos después del trasplante de órganos porcinos [30], descubrimos que la administración de T3 ayuda a aumentar los niveles de FT3
Expresión de hemo oxigenasa-1
. Se sabe que HO-1 tiene efectos antiinflamatorios y reduce la apoptosis [14, 172-178]. Es una enzima antioxidante regulada por el factor 2 relacionado con el eritroide 2 (Nrf2) [194]. Inflamación inducida por el factor de necrosis α y daño oxidativo [195]. La expresión de HHO-1 en células porcinas previno el factor de necrosis tumoral α y la apoptosis mediada por cicloheximida (Figura 9) [Figura 9] y dio como resultado una regulación negativa de las moléculas de adhesión, como E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1 [175]. Los órganos que expresan HHO-1 son fundamentales para prolongar el tiempo de supervivencia de los xenoinjertos de corazón de rata [173, 177]. y la apoptosis de las células de los islotes [178]
Expresión de A20
Se ha demostrado que la proteína A20 inducida por el factor de necrosis tumoral α tiene propiedades antiinflamatorias y antiinflamatorias. efectos apoptóticos [179-181]. A20 es un regulador importante de la transducción de señales inflamatorias y puede antagonizar la activación de NF-κB. Múltiples informes han demostrado que A20 inhibe la transducción de señales de NF-κB. Juega un papel importante en la respuesta a α y microbiana. productos [180, 181]. En comparación con las pAEC de tipo salvaje, las pAEC de cerdo transgénicas hA20 han reducido significativamente la apoptosis [179]. Los corazones de cerdo transgénicos HA20 tienen un efecto protector parcial contra la lesión por isquemia/reperfusión [179].
Expresión de la trombomodulina
Varias trombomodulinas tienen propiedades antiinflamatorias, como la trombomodulina [182-187], el receptor de proteína C endotelial (EPCR) [188] y la nucleósido trifosfato difosfato hidrolasa extracelular. -1 (CD39) [189-65438+. Se ha informado que el dominio N-terminal similar a la lectina de la trombomodulina tiene actividad antiinflamatoria directa e inhibe la activación del complemento [182]. La trombomodulina también tiene efectos antiinflamatorios al promover la producción de proteína C activada [183-186], que tiene actividad anticoagulante y efectos citoprotectores directos [196]. Los receptores de endotelina C también causan efectos antiinflamatorios dependientes e independientes de la proteína C activada [188]. CD39 es una importante nucleósido difosfato hidrolasa vascular que convierte el trifosfato de adenosina (ATP) y el difosfato de adenosina (ADP) en adenosina. Se ha demostrado que CD39 protege los riñones trasplantados de la lesión por isquemia-reperfusión a través de la vía de señalización del receptor de adenosina antiinflamatorio [189] y protege los islotes pancreáticos de la respuesta inflamatoria inmediata mediada por sangre (IBMIR) [190]. TFPI es una proteína anticoagulante básica que actúa previniendo la activación de la trombina, el factor de coagulación VII a VIIa (FVIIa) y el factor de coagulación VII a Xa (FXa) [197]. En la neumonía neumocócica de ratón, el TFPI humano recombinante puede reducir la IL-6, el TNF-α, el MCP-1, el IFN-γ, las citocinas derivadas de queratinocitos y la proteína inflamatoria-2 de los macrófagos, y aumentar la citoquina antiinflamatoria IL-2. [192].
La inflamación sistémica puede desempeñar un papel importante en el xenotrasplante de órganos porcinos al activar la cascada de coagulación y la respuesta inmune. Puede ser posible ayudar a prevenir o controlar la inflamación mediante el uso de agentes antiinflamatorios o la introducción de transgenes moduladores de la inflamación humana en cerdos obtenidos de órganos genéticamente modificados. Controlar la inflamación puede reducir la intensidad de la terapia inmunosupresora exógena. Controlar la inflamación puede ser esencial si se quiere lograr la tolerancia inmune a los xenoinjertos.