Cómo configurar el medio de enraizamiento

(1) Preparación de la solución madre de elementos macronutrientes MS Generalmente, los elementos macronutrientes se preparan en una solución madre 100 veces mayor y luego se diluyen 100 veces respectivamente cuando se usan. Pesar 37 g de NH4NO3, 165 g de KH2PO4, 17 g de KNO3, 190 g de CaCl2-2H2O, 44 g de MgSO4-7H2O y agregarlos a 1 litro de licor madre. Vierta en una botella de reactivo de 1 litro y guárdelo en el frigorífico. (2) Preparación de la solución madre de oligoelementos MS Los oligoelementos generalmente se preparan en una solución madre 100 veces mayor. Pese KI 0,083 g Na2MoO4-2H2O 0,025 g H3BO3 0,62 g CuSO4-5H2O 0,0025 g MnSO4-H2O 1,69 g CoCl2-6H2O 0,0025 g ZnSO4-7H2O 0,86 g Prepare 1 litro de solución madre, viértalo en una botella de reactivo de 1 litro y colóquelo. el refrigerador. Dado que CuSO4-5H2O y CoCl2-6H2O pesan muy poco, si la precisión de la balanza no puede alcanzar una diezmilésima, primero se puede preparar una solución de ajuste. Pesar 0,05 g de CuSO4-5H2O y 0,05 g de CoCl2-6H2O y añadir 0,05 g de cada uno a 100 ml de solución de ajuste. Tomar otros 5 ml y aún tener 0,0025 g. Pese 10 g de mioinositol, 0,01 g de clorhidrato de tiamina (VB1), 0,05 g de niacina, 0,2 g de glicina y 0,05 g de clorhidrato de piridoxina (VB6) para preparar 1 litro de solución madre y viértalo en una botella de reactivo de 1 litro. y guárdelo en el refrigerador. (4) Prepare el licor madre de sal de hierro MS. En circunstancias normales, prepare 100 veces el licor madre de sal de hierro MS. Pese 3,73 g de etilendiaminotetraacetato disódico y 2,78 g de FeSO4-7H2O a su vez para preparar 1 litro de solución madre, viértalo en una botella de reactivo de 1 litro y guárdelo en el refrigerador. De esta manera, existen 5 tipos de licores madre MS de macroelementos, más licores madre MS de oligoelementos, licores madre MS orgánicos y licores madre MS de sal de hierro, para un total de 8 tipos de licores madre. Preparación de la solución madre de hormonas: varias auxinas y citoquininas deben prepararse por separado y no se pueden mezclar. Las hormonas de crecimiento generalmente se disuelven con una pequeña cantidad de alcohol al 95% o 1 cantidad igual de NaOH generalmente se disuelve con 1 cantidad igual de clorhídrico. Luego agregue agua destilada para completar el volumen. Generalmente se toman 100 mg para preparar 100 ml de solución madre. 2. Preparación del medio de cultivo. Tomando como ejemplo la preparación de 1 litro de medio de cultivo MS, la secuencia de operación es la siguiente: (1) Primero coloque una cantidad adecuada de agua destilada en el vaso de precipitados. (2) Tome 10 ml de los 8 tipos de licor madre anteriores y viértalos en ellos. (3) Generalmente pese 30 gramos de sacarosa y viértala, revuelva para que se disuelva. (4) Utilice una probeta graduada para agregar agua destilada y disolver hasta 1 litro. (5) Agregue varias hormonas de acuerdo con el plan de diseño, porque la dosis de hormonas es muy pequeña y las hormonas son cruciales para el crecimiento de las plantas de cultivo de tejidos. Por lo tanto, es mejor utilizar pipetas ajustables de microvolumen siempre que sea posible para reducir errores. (6) Utilice papel de prueba de precisión o un acidómetro para ajustar el pH a 5,7-5,8 (utilice un acidómetro si es posible, que es más preciso). El pH de la solución se puede ajustar con 1 cantidad igual de HCL y 1 cantidad igual de NaOH. Prepare 1 volumen igual de HCL: use una probeta graduada para medir 8,3 ml y obtener 100 ml de solución. Prepare una cantidad igual de NaOH: pese 4 g de NaOH para obtener 100 ml de solución. (7) Pese unos 5 gramos de agar en polvo (agar en polvo de alta calidad), viértalo en la solución preparada anteriormente y caliéntelo en una estufa eléctrica hasta que hierva hasta que el agar en polvo se derrita. (8) Dejar enfriar un poco y poner en un recipiente de cultivo. Los recipientes sin tapa deben sellarse con film sellador o papel kraft y atarse con una goma o cordón. (9) Colóquelo en un esterilizador durante unos 20 minutos. 10) Después de la esterilización, saque el medio de cultivo del esterilizador, colóquelo sobre la mesa experimental y déjelo enfriar y solidificar.

2. Esterilización

La esterilización es una de las tareas importantes del cultivo de tejidos. Los principiantes deben ser conscientes del alcance de las bacterias y la esterilidad.

El equipo, las paredes y los pisos de la sala de inoculación deben limpiarse periódicamente con una solución de permanganato de potasio al 1-3% para mantener la higiene de la sala de inoculación. Además de la desinfección con luz ultravioleta y formaldehído antes de su uso, puede rociar alcohol al 70% o Lysol al 3% durante el uso para depositar las partículas de polvo en el aire. Las operaciones asépticas se pueden realizar de acuerdo con los siguientes pasos: (1) Fumigar la sala de inoculación con formaldehído 4 horas antes de la inoculación y encender la lámpara ultravioleta para esterilización (2) 20 minutos antes de la inoculación, encender el ventilador del ultra-; mesa de trabajo limpia y luz ultravioleta en la mesa Luces (3) El personal de vacunación se lava las manos y se pone batas y pantuflas de laboratorio especiales en la sala de amortiguación. (4) Después de subirse al banco de trabajo, límpiese las manos, especialmente las uñas, con un algodón con alcohol. (5) Limpie las herramientas de vacunación con bolas de algodón con alcohol, luego queme las pinzas y las tijeras de principio a fin y luego queme las puntas repetidamente. La placa de Petri debe quemarse hasta secarse (6) Durante la vacunación, el vacunador no puede abandonar el banco de trabajo; con las manos, no puede hablar ni caminar, toser, etc. 7) Después de la vacunación, se debe limpiar y desinfectar la mesa de trabajo con luz ultravioleta durante 30 minutos. Si se continúa con la vacunación, se debe desinfectar una vez cada 5 días. (7) Después de la inoculación, la mesa de trabajo debe limpiarse y esterilizarse con luz ultravioleta durante 30 minutos. La inoculación es un proceso en el que raíces, tallos, hojas y otros órganos aislados esterilizados se cortan o cortan en pequeños segmentos o trozos y se colocan en el medio de cultivo. Los procedimientos previos y posteriores a la vacunación se describirán de manera coherente. Pasos de la inoculación aséptica: (1) Poner los materiales previamente lavados y cortados en un vaso de precipitados, llevarlo a la mesa ultralimpia, desinfectarlo con desinfectante, enjuagarlo con agua esterilizada, finalmente escurrir el agua, sacarlo y colocarlo. en el esterilizador. (2) Después de drenar el material, sostenga unas pinzas en una mano y unas tijeras o un bisturí en la otra para cortar el material adecuadamente. Por ejemplo, corte las hojas en trozos pequeños de 0,5 cm cuadrados; corte los tallos en secciones pequeñas que contengan un nudo. Las puntas pequeñas de los tallos deben pelarse hasta alcanzar el tamaño de la punta de un tallo que contenga sólo 1 o 2 hojas tiernas, etc. El equipo de vacunación debe quemarse con frecuencia durante el proceso de vacunación para evitar infecciones cruzadas. (3) Insertar o colocar el explante cortado en el medio de cultivo con un instrumento cauterizado. El proceso de operación específico (tomando un tubo de ensayo como ejemplo) es: primero desatar el papel de la boca del tubo, sostener el tubo de ensayo casi horizontalmente, acercar la boca del tubo de ensayo a la llama de la lámpara de alcohol y girar la boca del tubo por encima del llama para quemar el interior y el exterior de la boca del tubo durante unos segundos. Si la boquilla está cubierta con un tapón de algodón, cauterice primero el exterior de la boquilla, retire el tapón de algodón y luego cauterice el interior de la boquilla. Luego use unas pinzas para tomar un trozo de explante cortado, colóquelo en el tubo de ensayo e insértelo suavemente en el medio de cultivo. Si las hojas están directamente adheridas al medio de cultivo, lo adecuado es colocar 1-3 hojas. En cuanto al método de colocación de los materiales, no existe un requisito unificado excepto que las puntas del vástago y los segmentos del vástago deben colocarse en posición vertical (con la punta hacia arriba). Después de la inoculación, la boca del tubo se mantiene sobre una llama durante unos segundos más. Y tápelo con un tapón de algodón, envuélvalo con papel para la boca y el interior del papel para la boca también debe sobrecalentarse.

4. Cultivo

El cultivo se refiere al cultivo de materiales en una sala de cultivo (luz, condiciones de temperatura, esterilidad) para crecer, dividirse y diferenciarse para formar callos o diferenciarse aún más. plantas regeneradoras. 1. Método de cultivo (1) Método de cultivo sólido, que utiliza medio solidificado con agar para cultivar materiales vegetales. Este es actualmente el método más utilizado. Aunque este método cuenta con un equipo simple y es fácil de implementar, la distribución de nutrientes es desigual, la tasa de crecimiento es desigual y, a menudo, se produce oscurecimiento y envenenamiento. (2) Método de cultivo líquido Este es un método de cultivar materiales vegetales en un medio líquido sin agregar un agente de curado. Debido al bajo contenido de oxígeno en el líquido, generalmente es necesario agitar o hacer vibrar la solución de cultivo para garantizar el suministro de oxígeno. Para el cultivo se utiliza un vibrador alternativo o un vibrador giratorio, y la velocidad de rotación es generalmente de 50 a 100 r/min. Este método de inmersión convencional, no sólo puede uniformar el medio de cultivo, sino también garantizar el suministro de oxígeno.