Introducción a la electroforesis
Contenido 1 Pinyin 2 Referencia en inglés 3 Método de electroforesis en papel 4 Método de electroforesis en película de acetato de celulosa 5 3. Método de electroforesis en gel de agarosa 6 Método de electroforesis en gel de poliacrilamida 7 Método de electroforesis en gel de poliacrilamida SDS 1 Pinyin
diàn yǒng fǎ 2 Referencia en inglés
electroforesis
El método de electroforesis se refiere al método de electroforesis de muestras de prueba cargadas (proteínas, nucleótidos, etc.) en un medio de soporte inerte (como papel, acetato de celulosa, gel de agarosa, gel de poliacrilamida, etc.), bajo la acción de un campo eléctrico, nadan hacia sus correspondientes electrodos a su propia velocidad, provocando que los componentes se separen en Para bandas estrechas, utilice métodos de detección adecuados para registrar su electroforesis patrones de bandas o calcular su contenido porcentual.
Para cada método de electroforesis, a menos que se especifique lo contrario, opere de acuerdo con los siguientes métodos.
3 1. Método de electroforesis en papel
1. Dispositivo instrumental
Incluye cámara de electroforesis y fuente de alimentación CC.
El dispositivo de cámara de electroforesis horizontal comúnmente utilizado es el que se muestra en la figura, que incluye dos tanques de electroforesis A y una cubierta de vidrio sellable (o material correspondiente) B. Los tanques de electroforesis en ambos lados están hechos de plexiglás (o); materiales correspondientes) ) El tablero C está dividido en dos partes; el compartimento exterior está equipado con un electrodo de platino (diámetro 0,5 ~ 0,8 cm) D; el compartimento interior es un marco de tanque de electroforesis de plexiglás F que puede contener el papel de filtro E. Esta rejilla se puede sacar del tanque; el tanque de electroforesis A en ambos lados. El electrodo de platino D en el interior está conectado a la fuente de alimentación del instrumento de electroforesis externo a través de un cable aislado a través de la pared del tanque.
La fuente de alimentación es una fuente de alimentación de CC con un regulador de voltaje. La electroforesis de voltaje normal generalmente está entre 100 y 500 V, y la electroforesis de alto voltaje generalmente está entre 500 y 10.000 V.
2. Método de operación
(1) Tampón de electroforesis
Tampón citrato (pH 3,0)
Tomar Añadir 39,04 g de cítrico ácido (C6H8O7·H2O) y 4,12 g de citrato de sodio (C6H5Na3O7·2H2O) en 4000 ml de agua para disolver.
(2) Papel de filtro
Tome el papel de filtro de cromatografía y sumérjalo en una solución de ácido fórmico de 1 mol/L durante la noche. Sáquelo al día siguiente, enjuáguelo con agua hasta alcanzar el pH. El valor de la solución de lavado no es inferior a 4, colóquelo en un horno a 60 ℃ para secar y reserve. El papel de filtro se puede cortar a una longitud de 27 cm y un ancho de 18 cm según sea necesario, o según el tamaño de la cámara de electroforesis. Dibuje una línea inicial de 5 a 8 cm desde un extremo de la longitud y marque cada 2,5 a 3 cm. propósitos de muestra.
(3) Existen métodos de punto húmedo y método de punto seco. El método de la mancha húmeda consiste en sumergir todo el papel de filtro cortado en tampón de citrato (pH 3,0). Después de que esté húmedo, sáquelo, use el papel de filtro para absorber el exceso de tampón y colóquelo en la rejilla del tanque de electroforesis para que el papel de filtro se absorba. La línea de inicio está cerca del ánodo. En el extremo, sumerja ambos extremos del papel de filtro en el tampón y luego use una microjeringa para agregar con precisión la solución de prueba, 10 μl por punto, máximo 3 puntos, y deje 2 posiciones en blanco.
El método de la mancha seca consiste en manchar la solución de prueba en el papel de filtro, secar con secador y luego manchar nuevamente, repitiendo varias veces hasta que se manche la cantidad especificada de la solución de prueba, y luego rociar el papel de filtro. con un rociador. El lugar donde se aplica la muestra se rocía con humedad al final. Este método es adecuado para una solución de prueba diluida.
(4) Electroforesis
Agregue una cantidad adecuada de tampón de electroforesis al tanque de electroforesis, sumerja el electrodo de platino, encienda la fuente de alimentación regulada del instrumento de electroforesis y ajuste el voltaje. gradiente a 18 ~ 20 V/cm, realice electroforesis durante aproximadamente 1 hora y 45 minutos, sáquelo, séquelo inmediatamente, colóquelo bajo luz ultravioleta (254 nm) para inspección y use un lápiz para marcar la ubicación de las manchas moradas.
(5) Determinación del contenido
Recorte las manchas de la muestra de prueba y el papel de filtro en blanco con un área similar a las manchas, córtelos en tiras finas y colóquelos en tubos de ensayo respectivamente. Agregue 0,01 mol/5 ml de solución de ácido clorhídrico, agite bien, déjelo reposar durante 1 hora, fíltrelo con un embudo de vidrio fundido No. 3 o utilice sedimentación natural o centrifugación para verter el sobrenadante, mida la absorción según. las regulaciones bajo cada artículo del medicamento, y calcular el coeficiente de absorción Calcular el contenido. 4 2. Método de electroforesis de película fina de acetato de celulosa
1. Instrumentación
La cámara de electroforesis y la fuente de alimentación de CC son las mismas que las de la electroforesis en papel.
2. Reactivos
(1) Para el tampón de barbitúrico (pH 8,6), tomar 2,76 g de barbitúrico y 15,45 g de barbitúrico de sodio, añadir agua y disolver para obtener 1000 ml.
(2) Solución de tinte negro amino
Tomar 0,5g de negro amino 10B y disolverlo en una mezcla de 50 ml de metanol, 10 ml de ácido acético glacial y 40 ml de agua.
(3) Solución de enjuague
Tomar 45ml de etanol, 5ml de ácido acético glacial y 50ml de agua, y mezclar bien.
(4) Líquido transparente
Tomar 25ml de ácido acético glacial, añadir 75ml de etanol absoluto y mezclar bien.
3. Método de operación
(1) Película de acetato de celulosa
Tome la película de acetato de celulosa y córtela en tiras de película de 2 cm × 8 cm boca abajo, sumérjala. en tampón barbitúrico (pH 8,6), espere hasta que esté completamente empapado, sáquelo y sujételo en papel de filtro, absorba suavemente el exceso de tampón, coloque el lado mate de la tira de membrana hacia arriba y colóquelo en la rejilla del tanque de electroforesis. Sumergir en tampón barbitúrico (pH 8,6) a través del puente de papel de filtro.
(2) Manchado y electroforesis
En la tira de membrana, a 2 cm del extremo negativo, dejar caer de 2 a 3 μl de la solución problema con un contenido de proteína de aproximadamente el 5 % en un Tira electroforesis bajo gradiente de potencial de 10 ~ 12 V/cm. La distancia adecuada de la zona de electroforesis es de 4 a 5 cm.
(3) Tinción
Después de la electroforesis, retire la tira de membrana y sumérjala en una solución de tinción de negro amino. Después de 2 a 3 minutos, enjuáguela varias veces con la solución de enjuague hasta que quede bien. hasta que se elimine el color base.
(4) Transparente
Remoje la tira de membrana lavada y completamente seca en el líquido transparente durante 10 a 15 minutos, sáquela y colóquela sobre un plato de vidrio limpio. secado La película transparente resultante se puede medir en un espectrofotómetro y usarse para el almacenamiento a largo plazo de muestras.
(5) Determinación del contenido
El patrón de electroforesis de la película de acetato de celulosa sin tratamiento transparente se puede determinar de acuerdo con el método especificado para cada fármaco. Generalmente, el método de elución o el método de escaneo es. utilizado. Determine el contenido porcentual relativo de cada componente proteico.
Método de elución
Seque las tiras de membrana lavadas con papel de filtro, corte las zonas electroforéticas de cada patrón de electroforesis de la solución de prueba y sumérjalas en hidróxido de sodio al 1,6%. solución, agitar varias veces hasta que se complete la elución y medir la absorbancia a una determinada longitud de onda. Al mismo tiempo, corte la parte libre de proteínas correspondiente a la tira de membrana del producto de prueba y opere de la misma manera que un control. Calcule primero el valor de absorción total y luego calcule el porcentaje de cada componente proteico.
Método de escaneo
Utilice un escáner cromatográfico para trazar automáticamente la película de acetato de celulosa seca en el registrador mediante reflexión (película no transparente) o transmisión (gráfico de curva de componentes de proteína). , la abscisa es la longitud de la tira de membrana, la ordenada es la absorbancia y se calcula el contenido porcentual de cada componente proteico. También se puede utilizar una microcomputadora para procesar el cálculo integral. 5 3. Método de electroforesis en gel de agarosa
1. Instrumentos y equipos
La cámara de electroforesis y la fuente de alimentación de CC son los mismos que los de la electroforesis en papel.
2. Reactivos
(1) Tampón ácido acético-sal de litio (pH3.0)
Tomar 50ml de ácido acético glacial, añadir 800ml de agua, mezcle y use hidrógeno. Ajuste el pH a 3,0 con óxido de litio y agregue agua a 1000 ml.
(2) Solución de azul de toluidina
Tomar 0,1g de azul de toluidina y añadir 100ml de agua para disolver.
3. Método de operación
(1) Elaboración del gel
Tomar unos 0,2 g de agarosa, añadir 10 ml de agua, colocarlo al baño maría y calentar. hasta completar la hinchazón y luego calentar 10 ml de tampón de sal de litio y ácido acético caliente (pH 3,0), mezclar bien, aplicar la solución de pegamento en una placa de vidrio de tamaño adecuado (2,5 cm × 7,5 cm o 4 cm × 9 cm) mientras Se calienta, con un espesor de unos 3mm, y se deja reposar, se espera hasta que el gel forme una capa fina uniforme y sin burbujas.
(2) Preparación de solución estándar y solución prueba.
Preparar según las disposiciones de cada fármaco.
(3) Manchado y electroforesis
Agregue tampón de sal de acetato de litio (pH 3,0) al tanque de electroforesis, coloque la placa de gel en la rejilla del tanque de electroforesis y el papel de filtro. El puente está sumergido en un amortiguador. Coloque 1 μl de cada muestra en el extremo negativo de la placa de gel, encienda la alimentación inmediatamente, realice la electroforesis durante aproximadamente 20 minutos en condiciones de un gradiente de voltaje de aproximadamente 30 V/cm y una intensidad de corriente de 1 a 2 mA/cm. y luego apague la alimentación.
(4) Tinción y decoloración
Retira la placa de gel, tiñe con solución de azul de toluidina y lava el exceso de solución de tinción con agua hasta que el fondo quede incoloro. 6 4. Método de electroforesis en gel de poliacrilamida
1. Dispositivo instrumental
Generalmente consta de un instrumento de electroforesis de flujo constante y un tanque de electroforesis de disco o placa plana. La cámara de electroforesis tiene dos tanques, superior e inferior, y cada tanque tiene un electrodo de platino fijo. El electrodo de platino está conectado al deflector de flujo constante del instrumento de electroforesis a través de un cable aislado.
2. Reactivos
(1) Solución A
Tomar 36,6 g de trihidroximetilaminometano, 0,23 ml de tetrametiletilendiamina, añadir 0,1 mol/L de solución de ácido clorhídrico, añadir agua para disolver y diluir a 100ml, ponerlo en una botella marrón y guardarlo en el frigorífico.
(2) Solución B
Tomar 30,0 g de acrilamida y 0,74 g de metinobisacrilamida, añadir agua para disolver y diluir a 100 ml, filtrar, poner en una botella marrón y conservar en el frigorífico. .
(3) Tampón de electrodo (pH 8,3)
Tomar 6 g de trishidroximetilaminometano y 28,8 g de glicina, añadir agua para disolver y diluir hasta 1000 ml, y conservar en el frigorífico. Diluir. 10 veces antes de usar.
(4) Solución indicadora de azul de bromofenol
Tomar 0,1 g de azul de bromofenol, añadir 3,0 ml de solución de hidróxido de sodio de 0,05 mol/l y 5 ml de etanol al 90 % y calentar para disolver. , agregue etanol al 20% para obtener 250 ml.
(5) Solución de tinción
Tome 2,5 ml de solución Coomassie Brilliant Blue Glt [250]gt al 0,25 % (p/v); V) San solución de ácido cloroacético a 10ml.
(6) Solución de tinción diluida
Tome 2 ml de la solución de tinción anterior y agregue una solución de ácido tricloroacético al 12,5 % (p/v) a 10 ml.
(7) Solución decolorante
Solución de ácido acético al 7%.
3. Método de operación
(1) Fabricación de gel
Tome 2 ml de solución A y 5,4 ml de solución B, agregue 2,9 g de urea para disolver. luego agregue 4 ml de agua, mezcle uniformemente, bombee aire para eliminar las burbujas en la solución, agregue 2 ml de solución de persulfato de amonio al 0,56%, mezcle bien para hacer una solución de pegamento e inmediatamente use una jeringa o un gotero fino equipado con una aguja larga para. agregue la solución de pegamento a lo largo de la pared del tubo hasta que haya una capa en el fondo. Coloque el tapón de goma en un tubo de vidrio pequeño (10 × 0,5 cm) para que la altura de la capa de pegamento alcance 6 ~ 7 cm, luego agregue lentamente. Una pequeña cantidad de agua para cubrir la superficie del pegamento. Las burbujas de aire en el fondo del tubo deben eliminarse durante unos 30 minutos hasta que aparezcan signos evidentes cuando se alcance la interfaz y la capa de agua. es succionado.
(2) Preparación de la solución estándar y de la solución de prueba.
Seguir la normativa de cada fármaco.
(3) Electroforesis
Coloque el tubo de vidrio de gel preparado en el tanque de electroforesis del disco y agregue de 50 a 100 μl de solución de prueba o estándar a cada tubo, para evitar la difusión. , puede agregar de 1 a 2 gotas de glicerol o solución de sacarosa al 40 % y 1 gota de solución indicadora de azul de bromofenol al 0,04 %. También puede agregar directamente unas gotas de solución indicadora de azul de bromofenol al 0,04 % al tampón del tanque superior y utilizarlo. en la parte superior del tubo de vidrio. Se llena la solución tampón del electrodo, el extremo superior está conectado al electrodo negativo y el extremo inferior está conectado al electrodo positivo. Ajuste la corriente inicial a 1 mA para cada tubo. Después de unos minutos, aumente la corriente a 2 a 3 mA para cada tubo. Cuando el líquido indicador de azul de bromofenol se mueva a 1 cm del fondo del tubo de vidrio, apague la alimentación. .
(4) Teñido y decoloración
Una vez completada la electroforesis, utilice una jeringa equipada con una aguja larga llena de agua para presionar el agua desde el fondo de la manguera a lo largo de la pared de Deslícela fuera del tubo, sumerja la tira en una solución de tinte diluida durante la noche o sumérjala en una solución de tinte durante 10 a 30 minutos, enjuáguela con agua y luego decolore con una solución decolorante hasta que el color de fondo de el gel sin proteínas es transparente.
(5) Juicio del resultado
Coloque la tira bajo la luz y obsérvela, y haga un juicio basado en la posición de la banda de color y la profundidad del color de la muestra de prueba y el producto estándar. .
Movilidad relativa Las zonas electroforéticas de la muestra problema y del estándar a veces pueden compararse con la movilidad relativa (R''lt; [m]gt;). La fórmula de cálculo es la siguiente:
La distancia desde el extremo de entrada del pegamento hasta la muestra de prueba o zona estándar
Movilidad relativa (R''lt; [m]gt;) = ─ ────────────────
La distancia desde el extremo de alimentación de pegamento hasta la zona de azul de bromofenol
Escaneo
La tira transparente se escanea y se integra en un escáner de capa fina de doble longitud de onda o en un escáner de electroforesis en gel, y el contenido porcentual de cada componente se calcula a partir del área del pico. 7 5. Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS determina el peso molecular de las proteínas basándose en el hecho de que la mayoría de las proteínas pueden reaccionar con el tensioactivo catiónico dodecilsulfato de sodio (SDS) combinado en un complejo según el peso. relación, la carga negativa de las moléculas de proteínas excede con creces la carga negativa de las moléculas de proteínas naturales, eliminando el efecto de carga de diferentes moléculas de proteínas y aumentando la movilidad relativa de las moléculas de proteínas (R''lt; [m] El tamaño de gt;) depende completamente del peso molecular. Por lo tanto, el peso molecular de la muestra de prueba se puede calcular a partir de la curva estándar del logaritmo y la movilidad relativa de la proteína estándar con peso molecular conocido.
1. Instrumentación
Salvo que se especifique lo contrario, igual que la electroforesis en gel de poliacrilamida.
2. Reactivos
(1) Solución líquida de acrilamida
Pesar 22,2 g de acrilamida y 0,6 g de bisacrilamida, disolver en 100 ml de agua y almacenar. en botellas marrones a baja temperatura.
(2) Tampón gel
Pesar 8,82g de dihidrógenofosfato sódico (NaH2PO4·2H2O), 51,55g de hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4·12H2O) y 2,0g de dodecano sulfato sódico, añadir agua hasta 1000ml (si hay precipitación, se puede calentar a 37°C para que se disuelva).
(3) Tampón de electroforesis
Diluir el tampón de gel 1 veces.
(4) Solución de tinción
Pesar 25 mg de Coomassie Brilliant Blue Rlt;[250]gt y disolverlo en 100 ml de una mezcla de 57% de etanol y 9,2% de acético; ácido.
(5) Solución decolorante
Tomar 75ml de etanol absoluto, añadir 50ml de ácido acético glacial y diluir a 1000ml con agua.
3. Método de operación
A excepción de las siguientes disposiciones, todo lo demás es igual que la electroforesis en gel de poliacrilamida.
(1) Producción de gel
Utilice solución de acrilamida - tampón de gel - agua - solución de persulfato de amonio al 1,6% de tetrametiletilendiamina (requiere enfriamiento) (10,1: 15,0∶3,4∶1,5∶0,045).
(2) Preparación de la solución de proteína estándar y la solución de prueba
Tome la proteína estándar, agregue agua para hacer una solución que contenga de 2 a 5 mg por 1 ml y mézclela con el hidrolizado. (Tomar 21,6 gy 0,04 g de dodecilsulfato de sodio (disuelto en 40 ml de agua) se mezclaron en una proporción de 1:3 y se colocaron en el refrigerador durante la noche. La muestra de prueba se prepara según el método anterior.
(3) Electroforesis
Ajustar la corriente a 8mA en cada tubo.
4. Cálculo de la movilidad relativa y el peso molecular
Utilice calibradores o método de posicionamiento de escaneo para medir la distancia de movimiento del tinte, la longitud de la tira antes de la tinción y el movimiento de proteínas de la zona decolorada electroforéticamente. Distancia y longitud de la tira después de la decoloración. Calcula la movilidad relativa según la siguiente fórmula:
La distancia que recorre la proteína es la longitud de la tira antes de teñir
Movilidad relativa (R''lt; [m]gt; ) =── ────────×───────────
a lo largo de la tira después de la decoloración, la distancia del borde anterior del movimiento del tinte será R ''lt; [m]gt; como coordenadas de dirección transversal, el logaritmo de la proteína estándar de peso molecular conocido es la ordenada, dibuje en el papel de coordenadas semilogarítmicas y averigüe el peso molecular de la muestra de prueba a partir del estándar. curva.