¿Cómo realizar la mutagénesis bacteriana mediante métodos químicos? ¿Alguien ha hecho este proyecto? ¿Cuál es el proceso de operación específico?

Son conocidos agentes alquilantes, análogos de bases, hidroxilamina, pigmentos de acridina, etc.

Tipos y mecanismos de acción de mutágenos químicos de uso común

(1) Agentes alquilantes

Es el tipo de mutágeno más importante que induce mutaciones en cultivos cultivados. . Agentes con uno o más grupos alquilo reactivos. La sustitución de átomos de hidrógeno de otras moléculas mediante sustitución alquilo se denomina "alquilación", por lo que este tipo de sustancia se denomina agente alquilante.

Los agentes alquilantes se dividen en las siguientes categorías:

1. Alquilsulfonatos y alquilsulfatos

Agente representativo: éster de metanosulfonato de etilo (EMS), sulfato de dietilo ( DES)

2. Compuestos nitrosoalquilados

Agentes representativos: nitrosoetilurea (NEH), compuestos N-nitrosoalquilados Nitro-N-etiluretano (NEU)

3. y óxidos de etileno

Agentes representativos: etilenimina (EI)

4. Gases mostaza

Mostazas nitrogenadas, mostazas azufradas

El mecanismo de Acción de los agentes alquilantes: la alquilación se centra en los ácidos nucleicos, lo que lleva a la fragmentación, eliminación o reparación del ADN.

(2) Análogos de bases de ácidos nucleicos

Este tipo de compuestos tienen una estructura similar a las bases del ADN.

Fármacos representativos:

5-bromouracilo (BU) y 5-bromodesoxiuridina (BudR) son análogos de la timina (T)

2-Aminopurina (AP) es un análogo de la adenina (A)

La hidrazida del ácido maleico (MH) es un isómero del uracilo (U)

Mecanismo de acción: como componente del ADN, penetra en el ADN moléculas, provocando errores de emparejamiento durante la replicación del ADN, provocando así mutaciones en el organismo.

(3) Otros mutágenos

El ácido nitroso puede desaminar purinas o pirimidinas, cambiar la estructura y propiedades de los ácidos nucleicos y provocar trastornos en la replicación del ADN. El HNO2 también puede provocar entrecruzamiento entre las dobles hebras del ADN y provocar efectos genéticos.

La azida sódica (NaN3) es un inhibidor respiratorio que puede provocar mutaciones genéticas, alcanzar una alta frecuencia de mutaciones y no tiene toxicidad residual.

Los siguientes son métodos de uso específicos, ¡espero que te sean útiles! ! ! ! ! ! ! ! ! !

La dosis de mutágeno químico viene determinada principalmente por su concentración y tiempo de tratamiento.

Los mutágenos químicos son todos tóxicos, y más del 90% de ellos son carcinógenos o fármacos extremadamente tóxicos. Se debe tener mucho cuidado al utilizarlos. No es aconsejable inhalarlos por vía oral. La piel No sólo debes prestarte atención a ti mismo para garantizar la seguridad, también debemos prevenir la contaminación ambiental y los peligros públicos.

1. Análogos de bases

Los análogos de bases utilizados para inducir mutaciones incluyen 5-BU, 5-FU, BUdr, 5-IU, etc. Son la estructura de los análogos de timina. , AP y 6-MP son análogos estructurales de la adenina. Los más utilizados son 5-BU y AP.

Cuando estas sustancias se añaden al medio de cultivo, pueden incorporarse a las moléculas de ADN bacteriano durante el proceso de reproducción sin afectar la replicación del ADN. Su efecto mutagénico es reemplazar la posición de la base en la molécula de ácido nucleico y luego provocar mutaciones mediante la replicación del ADN. Esto también se llama mutágeno adulterado. Obviamente, este tipo de mutágeno requiere que las células microbianas estén en un período vigoroso de metabolismo para poder obtener el mejor efecto mutagénico.

(1) Mecanismo de mutagénesis de los análogos de bases

Las bases normales tienen isómeros, y la tautomería ocurre en la molécula de pirimidina en forma de cetona y aparece en forma de enol, mientras que en la molécula de purina, amino e imino son alostéricos entre sí. Generalmente, la tautomerización ocurre con más frecuencia en bases análogas que en bases de ADN normales.

La 5-BU provoca la conversión de pares de bases A:T en bases GC

La 2-aminopurina también puede inducir A:T-G:C o G:C en moléculas de ADN - A: Conversión de T.

(2) Método de tratamiento por mutagénesis de análogos de bases (tomando 5-BU como ejemplo)

1. Tratamiento separado

Cultivar el líquido microbiano hasta la fase logarítmica. Centrifugar para retirar el medio de cultivo y añadir solución salina fisiológica o tampón. Deje de consumir el cultivo durante 8 a 10 horas para consumir las sustancias almacenadas en el cuerpo. Agregue 5-BU al medio de cultivo después del ayuno. La concentración del tratamiento es de 25 a 40 ug/ml y la temperatura es uniforme. Agregue 0,1-0,2 ml de suspensión bacteriana al medio de agar y extiéndalo para cultivo. A una temperatura adecuada, se lleva a cabo la mutagénesis durante el proceso de crecimiento. Después del cultivo, se recogieron y examinaron colonias individuales. Si se trata de hongos y esporas de actinomicetos, se debe aumentar la concentración de 5-BU. La concentración de tratamiento habitual es de 0,1 mg/ml.

2. Tratamiento compuesto con radiación

Según los informes, si las bacterias se tratan primero con análogos de bases como 5-BU, primero penetrarán en la fracción de ADN y luego se irradiarán con radiación para provocar la mutagénesis. El efecto será mejor que usar ray solo. Por tanto, los análogos de bases también son sensibilizadores para la mutagénesis por radiación. aumentando así la tasa de mutación.

2. Agentes alquilantes

(1) Mecanismo de acción de los agentes alquilantes

Los agentes alquilantes se dividen en agentes alquilantes monofuncionales y bifuncionales o multifuncionales. Agentes alquilantes funcionales Hay dos categorías principales de agentes alquilantes. El primero tiene un solo grupo alquilante, tiene una baja toxicidad biológica y un gran efecto mutagénico. Este último tiene dos o más grupos alquilantes, es altamente tóxico, tiene una alta tasa de letalidad y tiene escasos efectos mutagénicos. La razón principal es que los agentes alquilantes bifuncionales incluyen mostaza de azufre y mostaza de nitrógeno.

Los agentes alquilantes alquilan principalmente las bases y los fosfatos de la molécula de ADN a través de grupos alquilantes. Esto puede provocar errores en el emparejamiento de bases durante la replicación del ADN y provocar mutaciones en las purinas. Entre ellos, la guanina N7 es el sitio más reactivo y puede alquilarse con casi todos los agentes alquilantes. Además, los sitios de alquilación más comunes en las moléculas de ADN son la guanina O6 y la timina O4, que pueden ser los principales sitios que causan mutaciones. Los segundos sitios que causan la alquilación son guanina N3, adenina N2, adenina N7 y citosina N3. Estos sitios provocan sustituciones de bases sólo en aproximadamente el 10% de las alquilaciones. Por lo tanto, las mutaciones causadas por cambios en estos sitios son sólo una minoría.

Los agentes alquilantes también pueden provocar que se rompa el enlace de valencia entre el fosfato y la ribosa, provocando mutaciones.

(2) Propiedades de los agentes alquilantes

Las propiedades de los agentes alquilantes en solución son relativamente activas e inestables y son propensas a descomponerse en soluciones acuosas. La mayoría de sus vidas medias son muy cortas y su duración está estrechamente relacionada con la respuesta a la temperatura y el pH de la solución. Por lo tanto, los mutágenos químicos deben prepararse frescos y protegidos de la luz. Al preparar agentes alquilantes, utilice un tampón adecuado. ¡venenoso! ! ! !

(3) Agentes alquilantes de uso común

Nitrosoguanidina (NTG)

Sustancia cristalina amarilla, de naturaleza inestable, fácil de fotolizar y se vuelve amarilla Cuando es verde, el efecto mutagénico es realmente bajo.

Conocidas como supermutágeno, las soluciones tampón comúnmente utilizadas incluyen el tampón fosfato y el tampón Tri.

Método de tratamiento de mutagénesis:

① Lavar con un cierto valor de tampón fosfato o Tri tampón para preparar una suspensión bacteriana. ②Licor madre NTG: para la preparación, debe agregar un poco de cosolvente formamida o acetona y luego agregar tampón. La proporción es 9 ml de tampón: 1 ml de solución de acetona NTG y la concentración es NTG 1 mg/ml; cuando lo use, tome 0,2 ml de licor madre + 1,8 ml de suspensión bacteriana, la concentración final de NTG es de 100 ug/ml. Generalmente, varía según las diferentes especies bacterianas. Las bacterias son generalmente de 100 a 1000 ug/ml, y los actinomicetos y hongos son de 1000 a 3000 ug/ml. ③Cultivo de actinomicetos a una temperatura adecuada para el crecimiento (bacterias 30-35°C, hongos 25-28°C, actinomicetos 30-32°C) durante un cierto período de tiempo, generalmente 20-60 minutos para bacterias y 90-120 minutos. para esporas ④ Terminar la reacción. Diluirlo 50 veces con suero fisiológico frío, o lavarlo por centrifugación, y separarlo en placa a una dilución determinada. Si se trata de bacterias, agregue el medio de poscultivo al sedimento bacteriano a una cierta concentración, cultive con agitación durante 1,5 a 2 horas, después de 2 a 3 divisiones celulares, luego cubra la placa.

Una vez finalizado el tratamiento, remojar inmediatamente con NaOH los vasos que han estado en contacto con NTG.

Además del tratamiento directo anterior con solución, NTG también se puede mutagenizar según el siguiente método y agitar en un matraz: añadir 5-10 ug/ml de NTG al medio de cultivo después de la inoculación. Y agregue unas gotas de Tween 60 o Tween 80 para emulsionarlo (preste atención a si Tween afecta el crecimiento de bacterias maneje el proceso de crecimiento en una placa: si se mezclan NTG, agar y bacterias en una placa, NTG The); La concentración es de 10 a 50 ug/ml. O haga medio agar en un plato. Luego mezcle NTG y células bacterianas y aplíquelas para el análisis. En este momento, la concentración de NTG es de 10 a 20 ug/ml.

Medio de cultivo para cultivo posmenstrual. Excepto algunas separaciones de placas. Al medio de cultivo restante se le puede añadir una cantidad adecuada de medicamento y guardarlo en el frigorífico durante varios días. Por ejemplo, alguien en Japón almacenó el fluido de cultivo de E. coli tratado con NTG con 50 % de glicerol (concentración final 12,5 %) a -40 °C y -80 °C. Se puede sacar, descongelar, diluir y separar en cualquier momento durante los próximos días, y los mutantes rara vez morirán.

Según informes. Ya sea tratada con radiación o con mutágenos químicos, la suspensión bacteriana o la solución de mejora posterior se sumerge en un baño de hielo durante 2 a 3 horas y la repetibilidad de la prueba es muy buena. Se cree que esta medida se puede tomar para mejorar el efecto mutagénico en Escherichia coli, Bacillus subtilis y actinomicetos.

NTG es un carcinógeno fuerte. Use guantes de goma, ropa de trabajo y una máscara cuando opere. Use una botella de pesaje para pesar, preferiblemente en una campana extractora. Todos los utensilios que hayan entrado en contacto con NTG deben manipularse de forma inmediata e individualizada; por ejemplo, enjuáguelos con grandes cantidades de agua del grifo o déjelos en remojo en NaOH 1-2 N durante la noche y lávelos.

2. Metanosulfonato de etilo (EMS para abreviar)

El metanosulfonato de etilo es un compuesto alquílico con mejor efecto mutagénico entre los ésteres de sulfonato. Aparece como polvo o líquido incoloro, inestable y fácilmente hidrolizado en sustancias inactivas.

Método de tratamiento de mutagénesis EMS:

① Preparación de la solución madre EMS: Para mayor seguridad y prevención de fallas, enfríe previamente los recipientes requeridos en el refrigerador antes de la preparación y luego prepárelos en un baño de hielo. Tome 0,5 ml de solución madre de EMS, agréguelos a 10 ml de tampón fosfato de pH 7,2, tápelo y gire suavemente el tubo de ensayo. Dado que es fácilmente ineficaz en solución acuosa, debe almacenarse a baja temperatura tanto como sea posible y debe estar listo para su uso.

② Tome células bacterianas frescas y cultívelas hasta la fase logarítmica antes de la menstruación. Centrifugar, lavar y utilizar tampón para preparar 8 ml de suspensión bacteriana (107-108 ml-1). Para las esporas de hongos filamentosos, cultívelas hasta la etapa de germinación y la suspensión contiene 106 ml-1.

③ Tome 2 ml de solución madre de EMS y agréguelos a 8 ml de suspensión bacteriana. Procesar a una temperatura adecuada durante un período de tiempo determinado (determinado con base en resultados experimentales preliminares). La concentración final del tratamiento es de 0,1mol/L. Para las esporas de hongos, es de 0,2 a 0,5 mol/l.

④Después del tratamiento con EMS durante un cierto período de tiempo, diluya con 50 veces solución salina normal o agregue una cierta cantidad de solución de NaS2O3 al 2% o centrifugue y lave varias veces para detener la reacción.

El EMS es un mutágeno altamente tóxico. La seguridad debe observarse estrictamente durante todo el proceso de mutagénesis, incluida la preparación de medicamentos, manipulación, almacenamiento, etc., y no debe haber contacto con la piel. con EMS debe usarse solo en grandes cantidades. Enjuague y lave con agua, o sumérjalo en una solución de NaS2O3 al 10% durante la noche y luego enjuague con agua limpia.

3. Agente desaminador

El ácido nitroso es un mutágeno de baja toxicidad de uso común. Inestable y volátil. Su sal de sodio produce fácilmente NO y NO2 en tampones ácidos

(1) Mecanismo de mutagénesis del ácido nitroso

Elimina el grupo amino de la base y lo convierte en un grupo cetona, provocando la conversión Y mutar. A→H, C→U, G→X. A:T→G:C y G:C→A:T. La mutagénesis del ácido nitroso también puede causar mutaciones de reversión.

Además de la desaminación, el ácido nitroso también puede provocar entrecruzamiento y replicación del ADN, provocando cambios.

(2) Método de tratamiento del ácido nitroso

1. Preparación de reactivos

(1) Solución tampón de acetato pH 4,5 1 mol/L

(2) Solución de nitrito sódico 0,1 mol/L

(3) 0,07 mol/L pH8,6 solución de hidrogenofosfato disódico

Los reactivos anteriores deben esterilizarse antes de su uso.

2. Método de tratamiento

Tomar 1 ml de suspensión de esporas, 2 ml de tampón de ácido acético de pH 4,5 y 1 ml de solución de nitrato de sodio. La concentración final del tratamiento es de 0,025 mol/L y se incuba a 25-26 °C. 10-20 minutos, añadir ácido fosfórico. Se añadieron 20 ml de solución de hidrógeno disódico para reducir el pH a aproximadamente 6,8 para terminar la reacción. Diluir y separar en platos.

Si se tratan bacterias, la concentración final de nitrito es de 0,05 mol/L.

Al tratar bacterias o esporas con ácido nitroso se debe controlar estrictamente la temperatura, de lo contrario el efecto mutagénico se verá afectado.

4. Mutágeno de cambio de marco

El mutágeno de cambio de marco se combina con el ADN para provocar la adición o eliminación de bases, lo que resulta en mutaciones. Incluyen principalmente amarillo de acridina, naranja de acridina, ICR-171, ICR-191, etc. Los mutágenos de cambio de marco tienen un fuerte efecto mutagénico sobre los bacteriófagos y son más eficaces para inducir la eliminación de plásmidos en bacterias y actinomicetos que otros mutágenos. Como ciertos actinomicetos productores de antibióticos. Después del tratamiento, se descubrió que el rendimiento disminuyó significativamente, principalmente debido a la eliminación del plásmido que controla la síntesis de antibióticos.

Propiedades y uso de la acriflavina:

Cristal de color amarillo claro, ligeramente soluble en agua caliente, soluble en etanol y éter, inestable y fácil de descomponer cuando se expone a la luz.

A la hora de utilizarlo, primero disolverlo con un poco de etanol para hacer una solución madre de cierta concentración. El método de tratamiento habitual es agregarlos al medio de cultivo para que la concentración final sea de 10 a 50 ug/ml. Después de mezclarlos, se colocan en placas, se cultivan a la temperatura adecuada y se procesan durante el proceso de crecimiento. Además, también se puede añadir acriflavina al medio de cultivo en una concentración de 10-20 ug/ml y procesar durante el proceso de cultivo con agitación en condiciones de temperatura apropiadas.

5. El agente hidroxilante toma como ejemplo la hidroxilamina.

La hidroxilamina, abreviatura de HA, a menudo existe en forma de clorhidrato de hidroxilamina. Es un cristal blanco, soluble en agua, inestable. Fácil de descomponer y sexo corrosivo.

1. Mecanismo mutagénico de la hidroxilamina

Cuando la concentración de hidroxilamina es de 0,1-1,0 mol/L pH6,0, reacciona principalmente con la citosina para emparejar el C hidroxilado con el A, a 0,1. -1,0 mol/L pH9,0, la hidroxilamina puede reaccionar con guanina, y a 10-3 mol/L, la hidroxilamina puede reaccionar con timina, guanina y uracilo. Pero según el análisis, la reacción entre la hidroxilamina y T y G es su producto, no en sí misma. Además, la hidroxilamina a veces reacciona con otras sustancias de las células para producir peróxido de cloro, que también tiene efectos mutagénicos.

2. Método de tratamiento de hidroxilamina

La concentración común es del 0,1% al 5%, que se puede tratar directamente en la solución durante 1 a 2 horas y luego separar y cultivar. Pero generalmente se agrega a placas de agar o medios de agitación. Luego inserte esporas o bacterias, cultívelas a una temperatura adecuada y manipúlelas durante el proceso de crecimiento. La concentración utilizada es menor que cuando se trata directamente.

6. Sales metálicas

Las sales metálicas utilizadas para la reproducción por mutaciones incluyen principalmente cloruro de litio, sulfato de manganeso, etc. Entre ellos, el cloro se usa comúnmente y el efecto es bastante significativo cuando se combina con otros mutágenos.

El cloruro de litio se denomina comutágeno. El cloruro de litio es un polvo blanco fácilmente soluble en agua y que suele añadirse al medio de cultivo durante su uso.

Para evitar daños rápidamente. Al verter la placa, agréguela a la placa cuando la temperatura del medio de cultivo se enfríe a 50-60°C, y luego esparza las bacterias o esporas para separarlas. La concentración final del tratamiento es 0,3%-1,5%.

7. Otros mutágenos químicos

1. Colchicina

La colchicina es un mutágeno que induce la poliploidía en las células. El principal efecto de la colchicina es interrumpir la formación de fibras del huso durante la mitosis. Conducir a la generación de poliploidía.

2. Antibióticos

Los antibióticos que son mutágenos incluyen principalmente estreptomicina, fotomicina, mitomicina, actinomicina, mitramicina y doxorrubicina.

Todos estos antibióticos son medicamentos contra el cáncer. Aunque se utilizan en la reproducción microbiana, sus efectos no son tan significativos como los de los mutágenos como los agentes alquilantes y no se utilizan ampliamente. Generalmente no se usa solo, sino que a menudo se usa en combinación con otros mutágenos.

8. Mire directamente la seguridad operativa de los mutágenos químicos.

La mayoría de los mutágenos químicos son fármacos cancerígenos extremadamente tóxicos. Eliminación después de las operaciones de mutagénesis y la manipulación de mutágenos. Protección de seguridad en el almacenamiento y otros aspectos. es extremadamente importante. Si eres negligente, puede tener consecuencias negativas para tu salud y el medio ambiente. No debes quedarte paralizado.