Métodos de extracción de muestras de ARN y análisis de preguntas frecuentes en la sala de conferencias de divulgación científica
Ácido ribonucleico (abreviado como ARN)
Ácido), un portador de información genética que existe en las células biológicas y en algunos virus y viroides. El ARN es una molécula en forma de cadena formada por la condensación de ribonucleótidos mediante enlaces fosfodiéster. Las moléculas de ribonucleótidos están compuestas de fosfato, ribosa y bases. El ARN tiene principalmente cuatro bases, a saber, A (adenina), G (guanina), C (citosina) y U (uracilo), donde U (uracilo) reemplaza a la T (timina) de DN. La función principal del ARN en el cuerpo es guiar la síntesis de proteínas.
Extracción de ARN (método de extracción TRlzol)
1. Muestreo y trituración (tejido): Saque rápidamente la muestra de tejido y pese entre 0,3 y 0,5 g con una balanza electrónica (el muestreo). La cantidad también se puede determinar de acuerdo con la situación real) Estimación empírica), colóquelo en un mortero preenfriado con nitrógeno líquido y agregue nitrógeno líquido mientras se tritura para evitar que el tejido se derrita durante todo el proceso.
2. Craqueo:
(1) Tejido: cada 100
Agregue 1 ml de TRIzol a mg de tejido, continúe moliéndolo hasta obtener un polvo fino y lise. el tejido Transfiera la solución a tubos de centrífuga de 1,5 ml, cada tubo tiene aproximadamente 1 ml, y déjelo reposar a temperatura ambiente durante más de 15 minutos. También puede usar directamente una punta de pipeta para raspar el polvo fino molido en una centrífuga de 1,5 ml; tubo que contiene 1 mL de TRIzol, y colocarlo a 4°C 10 minutos o más de 15 minutos a temperatura ambiente;
(2) Células: (las células suspendidas requieren pretratamiento: 4°C, 3000°C.
Rpm, centrifugar durante 10 minutos, recoger el sedimento celular en el fondo del tubo de centrífuga de 1,5 ml); desechar el medio de cultivo, agregar una cantidad adecuada de 1xPBS para lavar una vez, desechar 1xPBS y agregar 1 ml.
Reactivo TRIzol (la dosificación de TRIzol se basa en el número de células (1mL/0,5-1x 107) o el área del frasco de cultivo (1 mL/10? Cm2), soplar suavemente con una pipeta varias veces y colocar a temperatura ambiente. Dejar en una mesa limpia durante más de 15 minutos y transferir 1 ml de líquido a un tubo de centrífuga de 1,5 ml.
(3) Si no se extrae inmediatamente. se puede congelar en refrigerador a -80°C
3. Extracción: Agregar cloroformo en una proporción de 0,2 ml de cloroformo/1 ml de triazol, agitar en el agitador durante 30 segundos o agitar vigorosamente manualmente durante 15 segundos. dejar reposar a temperatura ambiente durante 2-3 minutos, centrifugar a 4°C, 12000 rpm durante 15 minutos; transferir con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 ml, no aspirar la capa media. Precipitación: Añadir alcohol isopropílico en una proporción de alcohol isopropílico/sobrenadante = 1:1 e invertir. Mezclar, dejar reposar a -20 °C durante 30 min y centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min. retire el alcohol isopropílico restante.
5. Enjuague: agregue 1 ml de etanol al 75%, voltee hacia arriba y hacia abajo varias veces y centrifugue a 12.000 rpm durante 5 minutos. Centrifugar y utilizar una pipeta para aspirar el etanol restante al 75 %.
6. Secar al aire y disolver: secar de forma natural en una mesa limpia durante 5 a 10 minutos. No es necesario centrifugar el ARN. secar completamente para evitar la disolución completa; disolver el ARN en agua DEPC e incubar a 60-65 °C durante 5-10 minutos. 7. Cuantificar: si no se almacena inmediatamente, almacene las muestras a -80 °C. Cuantificación de ARN
Normalmente medimos el valor de absorción de las muestras de ARN a 260 nm con un espectrofotómetro UV de nanogota para calcular el contenido de ARN. Tanto el ADN como el ARN tienen la propiedad de absorber la luz ultravioleta. Sistema de doble enlace de yugo del anillo de purina y anillo de pirimidina, por lo que la purina y la pirimidina y todas las sustancias que las contienen, ya sean nucleósidos, nucleótidos o ácidos nucleicos, tienen la propiedad de absorber la luz ultravioleta. No puede distinguir entre ADN y ARN y solo puede ser. Se utiliza para identificar la pureza y el contenido de los ácidos nucleicos.
Con el espectrofotómetro UV de nanogotas se pueden obtener los siguientes parámetros:
OD230: absorbancia de impurezas (hidratos de carbono, como fenol y glucógeno);
OD260: Absorbancia del ácido nucleico;
OD280: absorbancia de la proteína;
OD260/280: La proporción de ARN puro está entre 1,5 y 2,1. Si la proporción es baja, indica contaminación proteica.
OD260/230: La proporción de ARN puro está entre 2,0-2,5. Si la proporción es baja indica que está contaminada por materia orgánica como azúcar, péptidos y fenoles.
Identificación de la integridad del ARN
Generalmente utilizamos electroforesis, Agilent2100 y otros instrumentos para identificar la integridad del ARN.
Valor RIN
RIN (número de integridad del ARN) representa el valor de la integridad del ARN. La integridad del ARN total se evalúa numéricamente, con un rango de 1 a 10. Cuanto más cerca esté el valor de 10, más completa será la muestra y menos completa, como se muestra en la imagen siguiente.
El impacto del grado de degradación del ARN en varios proyectos de secuenciación
①? Secuenciación del transcriptoma: el grado de degradación afectará la calidad de los datos en el extremo 5';
②? Secuenciación de MicRNA: debido a que los fragmentos son pequeños, se ven menos afectados por la degradación;
③? Secuenciación de bacterias degradantes: si se degradan por fuentes exógenas, volverá a la degradación endógena y será muy afectado;
④? Secuenciación de LncRNA y circRNA: se utiliza un método de eliminación de rRNA para construir la base de datos, que tiene poco efecto en la degradación de la muestra.
El impacto de la contaminación nuclear original en varios proyectos de secuenciación
① Secuenciación del transcriptoma: generalmente, no afectará los datos. Cuando la contaminación es leve, se puede ignorar. es grave, se requiere una construcción adicional de la base de datos;
②Secuenciación de micRNA: tiene poco impacto en los datos. Generalmente, la tasa de comparación y la cantidad efectiva de datos se pueden ignorar cuando. la contaminación es ligera y la cantidad de datos debe medirse cuando la contaminación es alta;
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③ ¿Grupo de degradación: la situación es la misma que la del transcriptoma?
④? Secuenciación de lncRNA y circRNA: tiene un gran impacto. La forma en que está configurada la base de datos determina que si está contaminada, si no se procesa, los datos pueden quedar completamente inutilizables, por lo que debemos estar muy atentos a este problema.
Análisis de preguntas frecuentes
Bajo rendimiento:
①?La muestra no está completamente rota ni homogeneizada;
②?La precipitación del ARN es no está completamente disuelto.
a260/A280<1.65(RIN<7):
? ①Al detectar absorbancia, la muestra de ARN no es soluble en agua, pero sí en TE. Los valores de A280 son más altos a concentraciones bajas de iones y valores de pH bajos.
? ② Se agregaron muy pocos reactivos al homogeneizar la muestra;
? ③? No dejar reposar a temperatura ambiente durante 5 minutos para homogeneizar la muestra;
? ④?Mezclar la fase orgánica al absorber la fase acuosa;
? ⑤?El sedimento de ARN no está completamente disuelto.
? Degradación del ARN:
? ①El tejido no se procesa ni se congela inmediatamente después de su extracción;
? ②Las muestras de ARN que se van a extraer se almacenan a -5 ~-20 ℃;
? ③Tratamiento excesivo de tripsina de las células;
? ④La solución o el tubo de centrífuga no han sido eliminados por la ribonucleasa;
? ⑤El valor de pH del formaldehído utilizado para la electroforesis es inferior a 3,5.
Contaminación del ADN:
① Se añaden muy pocos reactivos al homogeneizar la muestra.
② La muestra contiene disolventes orgánicos (como etanol, DMSO, etc.) ), Tampones fuertes o soluciones alcalinas, así como contaminación por proteoglicanos y polisacáridos: durante el proceso de precipitación de ARN se pueden realizar las siguientes mejoras. En el séptimo paso, agregar 0,25 ml de alcohol isopropílico y 0,25 ml de solución rica en sal (citrato de sodio 0,8 M y NaCl 1,2 M) a la fase acuosa, mezclar y centrifugar, y realizar la operación anterior. Este método retiene proteoglicanos y polisacáridos en solución y precipita eficazmente el ARN puro. Al extraer ARN de plantas que contienen una gran cantidad de polisacáridos, es necesario homogeneizar y centrifugar, y añadir los pasos anteriores.
Acerca de Aobai Yikang
Beijing Aobai Yikang Pharmaceutical Technology Co., Ltd. (en adelante, "Aobai Yikang") es una subsidiaria de propiedad total de Tianjin Aobai Pharmaceutical Technology Co. , Ltd. La empresa, fundada por un equipo de científicos senior de tecnología de secuenciación unicelular de alto rendimiento, se compromete a construir una marca avanzada de diagnóstico y tratamiento del cáncer unicelular en China, proporcionando soluciones completas, como instrumentos de diagnóstico unicelulares. , reactivos de diagnóstico y análisis de tecnología de diagnóstico médico para investigación científica y uso clínico, y permite de manera eficiente proporcionar diagnóstico y tratamiento personalizados de tumores.
Aobai Yikang es uno de los pocos equipos nacionales que ha logrado un crecimiento independiente y sustancial en el "mercado de I+D+". El equipo directivo, el equipo técnico y el equipo de marketing de la empresa cuentan con una rica experiencia en servicios e I+D en el campo de las células unicelulares. Han liderado y construido con éxito el equipo de servicios de investigación unicelular líder del país, tienen una cooperación profunda con empresas líderes internacionales de plataformas unicelulares como 10x Genomics, BD y MissionBio, y tienen una profunda acumulación en temas relacionados con la detección unicelular. tecnologías, productos y aplicaciones. Basándose en un equipo de científicos bien configurado y experimentado, Bio-Health ha logrado un desarrollo innovador de la tecnología de secuenciación unicelular y puede completar de manera más rápida y estable todo, desde el procesamiento de muestras, el aislamiento unicelular de paso alto y la construcción de bibliotecas de secuenciación hasta los datos. análisis y minería de importancia clínica. Flujo de procesos clave de una sola célula, que proporciona soluciones técnicas completas que cubren instrumentos de diagnóstico de una sola célula, reactivos de diagnóstico y análisis de tecnología de diagnóstico médico. ?
Negocio principal
Los servicios de investigación científica de Aobai Yikang se centran en servicios unicelulares y se basan en secuenciación y chips de alto rendimiento, brindando un servicio integral que se combina con otros multigrupo. servicios Los servicios integrales de investigación científica logran soluciones sistemáticas y completas desde el nivel de una sola celda hasta el nivel de lote.