Simplifique la diferencia entre secuenciación de metilación y secuenciación de metilación
En pocas palabras, la metilación del ADN es la adición selectiva de grupos metilo a la citosina bajo la acción de la ADN metiltransferasa (DNMT) para formar el proceso de 5'-metilcitosina. La metilación del ADN es uno de los primeros métodos de modificación epigenética de genes. Desempeña un papel importante en el mantenimiento de la función celular normal, la impronta genética, el desarrollo embrionario y el desarrollo de tumores. Es uno de los puntos críticos de investigación en la actualidad y en el futuro. .
Secuenciación de metilación de ADN
Con el desarrollo de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento, podemos analizar la 5'-metilcitosina, la modificación de histonas y otros eventos a nivel del genoma completo. no se puede encontrar en la investigación genómica, ¡esto es "secuenciación de metilación del ADN"! En los últimos años, con la continua disminución de los costos de secuenciación y la actualización iterativa de la tecnología de secuenciación, los métodos de secuenciación por metilación del ADN se han vuelto más selectivos.
Actualmente, los métodos de secuenciación comúnmente utilizados para la investigación de la metilación del ADN epigenético incluyen: secuenciación de metilación con bisulfito de todo el genoma [WGBS], secuenciación precisa de metilación e hidroximetilación del ADN [oxBS-seq], secuenciación de metilación simplificada optimizada [RRBS/dRRBS] /XRBS], secuenciación de metilación del genoma completo de una sola célula/microcélula [scWGBS], secuenciación de (hidroxi)metilación de amplicones, inmunidad al ADN (hidroxi)metilado* *.
(1) Secuenciación de metilación de bisulfito de todo el genoma (WGBS)
La secuenciación de metilación de bisulfito de todo el genoma (WGBS) puede detectar con precisión todos los genes de todo el genoma. El nivel de metilación de un. La base única de citosina (base C) es el estándar de oro para la investigación de la metilación del ADN. WGBS puede proporcionar un apoyo técnico importante para el estudio de modificaciones espaciotemporales específicas de la metilación del ADN genómico. Puede usarse ampliamente en el estudio de los mecanismos de la ontogenia, el envejecimiento y las enfermedades. También es la primera opción para estudiar los perfiles de metilación de varias especies. .
La tecnología convencional de secuenciación de metilación del genoma completo utiliza ADN ligasa T4 para romper las secuencias enlazadoras en ambos extremos de los fragmentos de ADN genómico mediante ultrasonido, y se utiliza un tratamiento con bisulfito para eliminar la citosina C no metilada. Convertir en uracilo U, y luego convertir el uracilo U en timina T mediante tecnología de PCR mediada por secuencia enlazadora.
Ventajas técnicas:
lAmplia gama de aplicaciones: adecuada para la investigación en humanos y en la mayoría de animales y plantas (se conoce el genoma de referencia)
lCobertura del genoma completo: máxima obtención la información de metilación de todo el genoma más completa y dibujar con precisión mapas de metilación.
lAnálisis de base única: el estado de metilación de cada base C se puede analizar con precisión.
Caso de investigación:
Secuencias duales de todo el genoma de dos grupos metileno de ADN interconvertibles diferentes en células madre embrionarias de ratón. Estudio proteómico de metilación de células madre embrionarias de ratón en dos condiciones.
①Antecedentes
Las células madre embrionarias de ratón generalmente crecen en una matriz que contiene suero y se denominan células madre séricas. Agregar dos inhibidores de quinasa puede mantener las células madre embrionarias en un estado fundamental pluripotente sin suero, llamadas células madre 2i (2i ESC). Estos dos tipos de células madre embrionarias pueden transformarse entre sí. En el pasado, la investigación sobre la metilación en este campo se basaba principalmente en la espectrometría de masas, con una cobertura y resultados de investigación limitados. También hay una falta de investigación proteómica sobre la metilación en células madre embrionarias 2i.
②Métodos
Se utilizó la secuenciación de metilación por bisulfito de genoma completo (WGBS) para estudiar la genómica de la metilación de estas dos células madre embrionarias de ratón.
③Conclusión
Las modificaciones de la metilación del ADN de dos tipos de células madre embrionarias de ratón se detectaron y compararon sistemáticamente de forma exhaustiva y precisa. Las 2iESC masculinas estaban globalmente hipometiladas en comparación con las ESC séricas; en suero, las ESC femeninas eran similares a las 2ESC masculinas en términos de hipometilación global, pero los niveles de metilación se redujeron aún más en el estado de 2ESC.
(2) Secuenciación precisa de metilación e hidroximetilación del ADN (oxBS-seq)
La hidroximetilación del ADN es una nueva modificación del ADN descubierta en los últimos años y rápidamente se convirtió en un punto de investigación. A medida que la investigación profundizó, se descubrió que el método de secuenciación con bisulfito, que anteriormente se consideraba el "estándar de oro" para detectar la metilación del ADN, no puede distinguir entre la metilación del ADN (5 mC) y la hidroximetilación del ADN (5 hmC).
Yigene y la Universidad de Cambridge han establecido la tecnología de secuenciación por bisulfito oxidativo (OXBS-SEQ), que no solo puede detectar con precisión la metilación del ADN y eliminar la influencia de la hidroximetilación del ADN, sino que también puede detectar con precisión la metilación del ADN combinando bibliotecas duales y resolución de base única. Detectar hidroximetilación del ADN.
Principio técnico:
OxBS-Seq oxida 5 hmC a 5 fC, y 5 fC se puede convertir en U mediante bisulfito, logrando así una detección precisa de 5 mC, al mismo tiempo, se compara; La comparación convencional de resultados con bisulfito permite una detección precisa de 5 hmC.
Ventajas técnicas:
l El nuevo "estándar de oro" para la detección de metilación del ADN
l Detección de base única de genoma completo de la modificación de la hidroximetilación del ADN
Múltiples estándares verifican una alta eficiencia de oxidación y una alta tasa de conversión de bisulfito
l Baja preferencia experimental y alta repetibilidad (r? & gt0.98)
l Puede satisfacer las necesidades de diversas aplicaciones de secuenciación: secuenciación de metilación oxidativa genómica simplificada (oxRRBS) y Target-oxBS.
Caso de investigación:
Secuenciación cuantitativa con resolución de base única de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina (niveles de 5mC y 5hmC en células madre embrionarias de ratón oxbs, detección de base única).
①Antecedentes
Con el descubrimiento de 5hmC en genomas de mamíferos, la secuenciación tradicional con bisulfito ya no puede distinguir con precisión las diferencias de modificación entre 5hmC y 5hmC. En los resultados de secuenciación de la BS tradicional, el nivel de modificación de 5 HMC es en realidad una colección de 5 HMC y 5 señales de HMC, por lo que existe una necesidad urgente de establecer una tecnología experimental para distinguir con precisión las dos.
②Métodos
Utilice la tecnología de secuenciación oxBS para detectar y cuantificar la metilación e hidroximetilación del ADN en células madre embrionarias de ratón.
③Conclusión
Este estudio estableció por primera vez la tecnología experimental de oxidación química combinada con tratamiento con bisulfito. Esta tecnología primero oxida 5 hmC a 5 fC y luego lo convierte en U mediante bisulfito, eliminando así la interferencia de señal de 5 hmC en 5 mC y logrando el propósito de detectar con precisión 5 mC en el genoma. Los estudios que utilizaron esta tecnología en células madre embrionarias de ratón encontraron que 5hmC es muy abundante en las regiones reguladoras transcripcionales relacionadas con CGI y en los elementos LINE1, lo que indica que puede desempeñar un papel importante en la reprogramación epigenética.
(3) Secuenciación de metilación simplificada (RRBS/dRRBS/XRBS).
La secuenciación representativa reducida con bisulfito (RRBS) realiza digestión con enzimas de restricción en el genoma, enriquece importantes regiones reguladoras epigenéticas, como promotores e islas CpG, y realiza secuenciación con bisulfito. Esta tecnología mejora significativamente la profundidad de secuenciación de regiones con alto CpG y puede obtener una resolución de alta precisión en islas CpG, regiones promotoras y regiones de elementos potenciadores. Se trata de un método de investigación de la metilación del ADN preciso, eficiente y económico, que tiene amplias perspectivas de aplicación en la investigación de muestras clínicas a gran escala. Para satisfacer las necesidades de la investigación científica y la tecnología, hemos desarrollado aún más RRBS de doble digestión (dRRBS), que puede capturar sitios CpG en un área más grande y estudiar la metilación en un área más amplia, incluida la costa CGI y otras áreas.
Para facilitar el análisis multidimensional de volúmenes de muestra bajos, desarrollamos un método de secuenciación dirigida a la metilación: secuenciación binaria de presentación extendida (XRBS), que es rica en islas CpG, promotores, sitios de unión Enhancer y CTCF. permiten una alta sensibilidad y reutilización de muestras, y son altamente escalables para muestras limitadas y células individuales.
Ventajas técnicas:
Alta precisión: Se puede conseguir una resolución de base única dentro de su área de cobertura.
Buena repetibilidad: la repetibilidad del área de cobertura de múltiples muestras puede alcanzar el 85% -95%, lo que es adecuado para el análisis de diferencias entre múltiples muestras.
l Rendimiento de alto costo: el área de secuenciación está dirigida a áreas de alto CpG, lo que resulta en una mayor utilización de datos.
Caso de investigación:
La inhibición de la transferencia de metilo del ADN revierte los fenotipos incrustados epigenéticamente en el cáncer de pulmón, afectando preferentemente el impacto de los cambios de metilación del ADN en la capacidad invasiva de las células cancerosas.
① Antecedentes
El fenotipo de las células cancerosas está determinado hasta cierto punto por la apariencia, como la metilación del ADN. Las características metastásicas del cáncer en etapas posteriores del desarrollo pueden estar relacionadas con alteraciones en las modificaciones epigenéticas.
②Métodos
Uso de la tecnología RRBS para detectar la actividad de líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas altamente invasivas (A549 y HTB56) y las líneas celulares correspondientes tratadas con el inhibidor de la metilación azacitidina. modificación. Explorar el impacto de los cambios de metilación en la capacidad de invasión de las células de cáncer de pulmón.
③Conclusión
Durante el desarrollo de líneas celulares altamente invasivas, las modificaciones de la metilación del ADN sufren cambios extensos. En comparación con líneas celulares menos invasivas, el 2,5% de las regiones ricas en CpG detectadas por RRBS se modificaron diferencialmente. Cuando se utilizó el inhibidor de la metilación del ADN azacitidina, la capacidad invasiva de las líneas celulares se revirtió con la pérdida de modificaciones de la metilación en estos sitios hipermetilados.
Reversión de la capacidad invasiva inducida por 5-azacitidina
(4) Secuenciación de metilación del genoma completo (scWGBS) de células individuales/microcélulas.
La investigación genómica sobre la metilación del ADN en células individuales y muestras traza está limitada en gran medida por la construcción de bases de datos y la tecnología de secuenciación. Los métodos tradicionales de construcción de bibliotecas o las tecnologías de amplificación unicelular similares al ADN genómico son difíciles de aplicar a los experimentos de metilación. Yigene ha establecido una tecnología basada en la amplificación lineal y la construcción de bibliotecas en un solo tubo, que puede reducir por completo el sesgo de la biblioteca y completar con precisión la investigación de la metilación de todo el genoma en muestras preciosas.
La metilación de células individuales y muestras raras se utiliza principalmente en campos de investigación como la patogénesis de tumores, la investigación del cáncer, el diagnóstico preimplantacional, el desarrollo embrionario temprano, la recombinación de células germinales, las células madre y la heterogeneidad celular. Las muestras de aplicación incluyen células individuales y microcélulas.
Ventajas técnicas:
l Cantidad inicial ultrabaja: células individuales o cantidad inicial ultrabaja de ADN para la construcción de bibliotecas.
l Alta cobertura de secuenciación: se puede obtener la máxima información sobre la metilación de todo el genoma y se pueden dibujar mapas de metilación con precisión.
lAnálisis de base única: el estado de metilación de cada base C se puede analizar con precisión.
Caso de investigación:
Secuenciación del genoma de ADN unicelular de embriones humanos preimplantacionales. Perfil de metilación del ADN unicelular del desarrollo embrionario previo a la implantación humana.
①Antecedentes
En los genomas de los mamíferos, la citosina (principalmente citosina en CpG) se metilará bajo la catálisis de la ADN metilasa. Los estudios han demostrado que la metilación del ADN es fundamental para muchos procesos biológicos, como la represión de la expresión genética, la regulación de la actividad transcripcional de los transposones, la inactivación del cromosoma X y el mantenimiento de la impronta genómica. Estudios anteriores han demostrado que sólo se produce una desmetilación del ADN a gran escala durante el desarrollo embrionario temprano antes de la implantación. Sin embargo, los datos de este estudio muestran que la desmetilación del ADN a gran escala en embriones humanos tempranos va acompañada de grandes cantidades de metilación de novo del ADN altamente específica después de la fertilización del esperma y el óvulo, lo que sugiere que durante la primera ronda de desarrollo en los embriones humanos tempranos En la reprogramación de los grupos de metilación del ADN, el "resultado neto" de la desmetilación global del ADN es en realidad el resultado de un equilibrio dinámico entre la desmetilación del ADN a gran escala altamente ordenada y la metilación del ADN local que se antagonizan entre sí.
②Métodos
Utilizando el método de secuenciación de alto rendimiento del metiloma del ADN unicelular, se analizó por primera vez el proceso de desarrollo de embriones humanos previos a la implantación con resolución unicelular.
③Conclusión
Para estudiar más a fondo las características dinámicas del proceso de reprogramación de la metilación del ADN a nivel de una sola célula, este artículo utiliza la secuenciación de alto rendimiento del metiloma del ADN del genoma completo de una sola célula. tecnología para estudiar sistemáticamente el análisis de una sola base unicelular en cada etapa crítica del desarrollo embrionario previo a la implantación humana. Los principales hallazgos son los siguientes: (1) Se descubrió por primera vez que existe una gran cantidad de metilación de novo específica del ADN durante el desarrollo embrionario previo a la implantación humana. (b) Se descubrió por primera vez que el nivel de metilación residual en el genoma materno se invierte a partir de la etapa embrionaria de dos células. En la misma célula, el nivel de metilación residual en el genoma materno es significativamente mayor que la metilación residual en el genoma materno. nivel del genoma paterno. (c) El primer descubrimiento de que la distribución asimétrica de la metilación del ADN durante la escisión embrionaria temprana puede utilizarse para rastrear el linaje genético de cada célula en el mismo embrión. Fuente del contenido: Tecnología Yigene