Describa brevemente los principios y procesos básicos de la recombinación de ADN y la clonación molecular.

La ligación del fragmento de ADN exógeno y el vector plasmídico lineal es una nueva reacción de ligación formada entre el fosfato 5' del ADN bicatenario y el hidroxilo 3' adyacente. cadena de precios. Por ejemplo, si ambas cadenas de un vector plasmídico llevan fosfatos 5', se pueden generar cuatro nuevas cadenas de fosfodiéster. Sin embargo, si el ADN plásmido ha sido desfosforilado, puede absorber energía para formar dos nuevas cadenas de fosfodiéster. En este caso, las dos moléculas híbridas producidas tienen dos espacios monocatenarios (Figura 1.8). Cuando los heterocigotos se introducen en células competentes, los espacios pueden repararse. La formación de enlaces fosfodiéster entre 5' fosfatos adyacentes y grupos 3' hidroxilo puede ser catalizada in vitro por dos ADN ligasas diferentes, a saber, la ADN ligasa de E. coli y la ADN ligasa del bacteriófago T4. De hecho, la ADN ligasa del fago T4 es la primera opción para aplicaciones de clonación. Esto se debe a que puede ligar eficazmente fragmentos de ADN de extremos romos en las siguientes condiciones de reacción.

La conexión entre un extremo del ADN y el otro puede considerarse una reacción bimolecular. En condiciones estándar, la velocidad de reacción está determinada completamente por la concentración de extremos de ADN coincidentes. Esto es cierto ya sea que los extremos estén en la misma molécula de ADN (unión intramolecular) o en moléculas diferentes (unión intermolecular). Consideremos ahora el caso sencillo en el que la mezcla de ligación contiene sólo un tipo de ADN, es decir, ADN vectorial fosforilado preparado mediante escisión con una única enzima de restricción que produce extremos pegajosos. El sustrato funcional. Si la concentración de ADN en la reacción es menor, hay una mayor probabilidad de que ambos extremos coincidan con la misma molécula de ADN (porque la probabilidad de encontrar el otro extremo de la misma molécula en un extremo de una molécula de ADN es mayor que la probabilidad de encontrar el final de una molécula de ADN diferente). De esta forma, la recircularización del ADN plasmídico será eficaz cuando la concentración de ADN sea baja. Si la concentración de ADN aumenta durante la reacción de ligadura, aumenta la probabilidad de que el extremo de una molécula de ADN se encuentre con el extremo de otra molécula de ADN antes de que ocurra la reacción de ligadura intramolecular. Por lo tanto, cuando las concentraciones de ADN son mayores, los productos iniciales de la ligadura inversa serán dímeros de plásmidos y oligómeros más grandes. Dugaiczyk et al. (1975; véase también Focus Volumen 2, No. 2, No. 3 publicado por Bethesda Res, Lab.) discutieron teóricamente el efecto de la concentración de ADN sobre las propiedades del producto de ligación. En resumen, la proporción de productos de ligadura ciclados a productos de ligadura múltiple depende de dos parámetros: J e I. J es la concentración efectiva de un extremo de una molécula de ADN cerca del otro extremo de la misma molécula, y el valor de J se basa en el supuesto de que el ADN en solución está enrollado aleatoriamente. De esta manera, J es inversamente proporcional a la longitud de la molécula de ADN (porque cuanto más largo es el ADN, menos probable es que los dos extremos de una determinada molécula interactúen), por lo que para una molécula de ADN de una longitud determinada, J es una constante, independiente de la profundidad del ADN. J = [3/(3 ​​​​π lb0)] 3/2 donde L es la longitud del ADN en cm y B es la longitud de los fragmentos de ADN enrollados aleatoriamente. El valor de b depende de la fuerza iónica del tampón, que puede afectar la rigidez del ADN.

I es una medida de la profundidad de todos los extremos complementarios en solución. Para ADN de doble cadena con extremos adhesivos autocomplementarios, i=2NoMx10-3 extremos/ml donde no es la constante de Avogadro y m es la concentración molar de ADN (unidad: mol/L). Teóricamente, cuando j=i, es igualmente probable que un extremo de una determinada molécula de ADN entre en contacto con el otro extremo de la misma molécula y con el extremo de una molécula diferente. Por lo tanto, en tales condiciones, las velocidades de formación de moléculas cíclicas y moléculas multienlazadas son iguales durante las etapas iniciales de la reacción. Cuando j & gtI, es beneficioso para el reciclaje; cuando I & gtj, es beneficioso para la producción de enlaces múltiples. La Figura 1.9 muestra la relación entre el tamaño de los fragmentos de ADN y la concentración de ADN requerida cuando la proporción j:I en la mezcla de reacción de ligación es 0,5, 1, 2 y 5 respectivamente (Dugaiczyk et al., 1985). Consideremos ahora la siguiente mezcla de reacción de ligación: además del plásmido lineal, también contiene fragmentos de ADN extraños con extremos coincidentes. Para una mezcla de ligación determinada, la eficiencia de generar genomas recombinantes circulares monoméricos se ve afectada no sólo por la concentración absoluta de extremos en la reacción, sino también por las concentraciones relativas de extremos del plásmido y del ADN extraño. Cuando I es 2-3 veces mayor que J (es decir, cuando la concentración absoluta del terminal es suficiente para cumplir los requisitos de conexión intermolecular sin provocar la formación de un gran número de moléculas de oligómero), el rendimiento de recombinantes eficaces puede ser maximizado.

En estas condiciones, aproximadamente el 40% de los productos finales de las reacciones de ligación son quimeras formadas a partir de plásmidos monoméricos y ADN exógeno. Cuando la cantidad de plásmido lineal en la mezcla de ligación es constante (j:i=3) y aumenta la cantidad de ADN exógeno con extremos coincidentes, aumenta el rendimiento teórico de esta quimera al final de la reacción de ligación.

Las reacciones de ligación que involucran ADN plasmídico fosforilado lineal con extremos pegajosos deben incluir:

1) Vector ADN1 y j:I que sean suficientes para satisfacer j:I

2) Si la concentración final de ADN exógeno es igual o ligeramente superior a la concentración final de ADN del vector, si la concentración de ADN exógeno es mucho menor que la concentración del vector, entonces el número de productos de ligación eficaces será muy bajo, por lo que es difícil utilizar la inoculación recombinante para diferenciar pequeños números de colonias transformadas. En este caso, se pueden considerar algunas medidas para reducir las colonias de fondo de plásmidos no recombinantes. Como tratar el ADN plasmídico lineal con fosfatasa o construir plásmidos recombinantes mediante clonación direccional utilizando una estrategia de clonación de seguimiento.

(2) Ligadura de extremos adhesivos

1) Digerir el plásmido y el ADN exógeno con enzimas de restricción apropiadas. Si se desea, los fragmentos pueden separarse mediante electroforesis en gel y/o el ADN plasmídico puede tratarse con fosfatasa alcalina. El ADN se purificó mediante extracción con fenol:cloroformo, precipitación con etilo y luego se concentró a 100/ml con solución de TE (pH 7,6).

2) Establecer la mezcla de reacción de ligación de la siguiente manera:

A. Transferir 0,1 μl de ADN del vector a un tubo de microcentrífuga estéril y agregar una cantidad equimolar de ADN exógeno.

B. Agregue agua hasta 7,5 μl, caliente a 45 ℃ durante 5 minutos para derretir las puntas pegajosas reinflamadas y enfríe la mezcla a 0 ℃.

C. Añadir: 1 µl de tampón de ADN ligasa del fago 10xT4

NDA ligasa del fago T4 0,1 frente a unidad

5 mmol/L de ATP 1 µl

Incubar a 65438±06°C durante 1-4 horas.

Tampón de ADN ligasa de fago 10xT4

Contiene Tris 200 mmol/L. Quimioluminiscencia (pH 7,6)

50 mmol/kg de cloruro de magnesio

50 mmol/L de ditiotreitol

500 μg/ml de albúmina sérica bovina Clara de huevo (ingrediente V . Producto Sigma) (opcional)

La solución de entrenamiento lento debe dividirse en pequeñas porciones y conservarse a -20°C.

Además, se configuraron dos reacciones de control que contenían (1) un vector de plásmido únicamente; (2) un fragmento de ADN exógeno únicamente. Si la cantidad de ADN exógeno es insuficiente, se pueden utilizar entre 50 y 100 ng de ADN plasmídico en cada reacción de ligación. Agregue la mayor cantidad de ADN exógeno posible manteniendo el volumen de la reacción de ligación en no más de 10 µL. La actividad de la ADN ligasa del fago T4 puede reducirse. al menos Determinado por tres métodos diferentes. La mayoría de los fabricantes (excepto New England Biolabs) utilizan ahora Weiss et al (11968) para estandarizar esta enzima. Una unidad Veis se refiere a la enzima necesaria para catalizar la sustitución de 1 mmol de 32 p de pirofosfato a [γ, β-32P]ATP en 20 minutos a 37 °C. Una unidad Veis equivale a la prueba de tolerancia a exonucleasa (Modrich y Lehman). , 1970) o 60 unidades finales adhesivas (definición de New England Biolabs). Por lo tanto, 0,015 unidades Weiss de ADN ligasa del fago T4 pueden ligar el 50% del fragmento Hind del fago lambda (5 µg) a 16°C durante 30 minutos. En este libro, la ADN ligasa del fago T4 siempre se expresa en unidades Weiss. \parLa ADN ligasa del fago T4 que se proporciona actualmente es una solución concentrada (1-5 unidades/μl), que se puede diluir a 100 con 20 mmol/L de Tris. Cl (pH 7,6), KCl 60 mmol/L, ditiotreitol 5 mmol/L, albúmina sérica bovina 500 μg/ml y glicerol al 50 %. A esta concentración y en este tampón, la ADN ligasa del fagocito T4 es estable durante 3 meses a -20°C.

3) Tomar 1-2 μl de células competentes de E. coli transformadas de cada muestra.

(3) Ligadura de ADN de extremos romos

La ADN ligasa del bacteriófago T4 se diferencia de la ADN ligasa de E. coli en que puede catalizar la ligación de fragmentos de ADN de extremos romos (Sgaramela y Kelan Na, 1972; Sgaramella y Ehrlich, 1978), porque el ADN fácilmente se vuelve romo, lo cual es una propiedad enzimática extremadamente útil. Con tales propiedades físicas, cualquier molécula de ADN puede conectarse entre sí. Sin embargo, en términos relativos, la ligadura de extremos romos es una reacción ineficiente que requiere las siguientes cuatro condiciones:

1) Baja concentración (0,5 mmol/L) de ATP (Ferrati y Sgaranekka, 1981).

2) No existen poliaminas como la espermidina.

3) Concentración muy elevada de ligasa (50 unidades Vis.mL).

4) El extremo plano tiene alta concentración.

1. Coagulante

Añadir a la mezcla de reacción algunas sustancias que puedan favorecer la agregación de macromoléculas y provocar la agregación de moléculas de ADN, como el polietilenglicol (Pheiffer y Zimmerman, 1983; Qi Merman y Pfeiffer, 1983; Zimmerman T Harrison, 1985 + 0985) o el cloruro de cobalto total con hexaamina (Rusche y Howard-Flanders, 1985 + 0985) siempre pueden resolver el problema de cómo obtener la concentración adecuada de ADN de extremos romos. En la reacción de ligación, estas sustancias tienen dos funciones:

1) Pueden aumentar la velocidad de ligación del ADN de extremos romos en 1-3 órdenes de magnitud, por lo que la reacción de ligación se puede llevar a cabo en condiciones de Baja concentración de ADN enzimático.

2) Pueden cambiar la distribución de los productos de conexión, inhibir la conexión intramolecular y los productos de conexión formados son todos productos de conexión intermoleculares. De esta manera, incluso en concentraciones de ADN que favorezcan la autociclación (j:i=10), todos los productos de ADN serán polímeros lineales. \parLa siguiente información se puede utilizar como referencia al configurar reacciones de conexión que incluyan coagulantes.

(1)Polietilenglicol

1) La solución de almacenamiento de PEG 8000 (40%) preparada con agua desionizada se dividió en pequeñas porciones y se almacenó mediante congelación, pero se añadió a la reacción antes. Al mezclar la mezcla, se debe derretir y llevar a temperatura ambiente. El efecto antiirritante sobre la ligadura fue más pronunciado en la mezcla de reacción de ligadura que contenía 15% de PEG 8000. Excepto PEG 800 y ADN ligasa del fago T4, todos los componentes de la mezcla de ligación deben mezclarse a 0 °C, luego agregar un volumen adecuado de PEG 8000 (temperatura ambiente), mezclar uniformemente e incubar a 20 °C después de agregar la enzima.

2) Cuando la mezcla de ligadura contiene 0,5 mmol/L de ATP y 5 mmol/L de MgCl2, el efecto estimulante sobre la reacción de ligadura es más significativo incluso si la concentración de ATP aumenta ligeramente o la concentración de MgCl2 disminuye ligeramente. se estimulará la reacción de ligadura. Reducción severa de la intensidad de la estimulación (Pheiffer y Zimmerman, 1983).

3) PEG 8000 en una concentración del 15% puede estimular la eficiencia de ligación de moléculas de ADN con extremos pegajosos para aumentar de 10 a 100 veces. El producto principal de la reacción es un conector en tándem.

4) PEG 8000 puede estimular la ligadura de extremos romos de oligómeros sintéticos de tan solo 8 nucleótidos, lo cual es diferente del cloruro de cobalto y hexamina a este respecto.

(2) Cloruro de hexametilo con alto contenido de cobalto

1) El cloruro de hexametilcobalto se puede preparar en una solución de almacenamiento de 10 mmol/L con agua y almacenar a -20 °C. Alta confiabilidad de concentración en. respuesta a conexiones de estímulo. El efecto estimulante es mayor cuando la profundidad de la sal en la mezcla de reacción es de 1,0 a 1,5 µmol/L. El cloruro de hexamina y cobalto puede aumentar la eficiencia de la conexión de extremo a extremo a aproximadamente 50 W, pero sólo puede aumentar la eficiencia de la conexión de extremo a extremo en un factor de 5 (Rusche y Howard-Flanders, 1985).

2) En presencia de cationes monovalentes (30 mmol/L KCl), la ligadura de extremos romos todavía se puede estimular, pero la distribución de los productos de la ligadura ha cambiado. El producto de ligadura ya no es un producto de ligadura intermolecular homogéneo, sino que el ADN circular pasa factura.

3) A diferencia de PEG 8000, el cloruro de hexaamina cobalto no puede mejorar significativamente la tasa de ligación de oligonucleótidos sintéticos.

(4) Clonación rápida en vectores plasmídicos

El paso más lento en la clonación de plásmidos es la purificación electroforética de fragmentos de ADN exógenos y los correspondientes fragmentos de ADN plasmídico. El siguiente protocolo [modificado por S. Michaelis según Struhl (1985)] consiste en recuperar el bloque de agarosa del gel purificado y ligar directamente el plásmido al ADN extraño después de la fusión. Este método es igualmente eficaz para la ligadura de extremos romos y la ligadura de extremos adhesivos, pero requiere una gran cantidad de ligasa y la eficiencia es aproximadamente un orden de magnitud menor que el protocolo operativo estándar.

1) Digerir el ADN exógeno con una enzima de restricción adecuada en una cantidad suficiente para producir aproximadamente 0,2 μg del fragmento diana. El volumen de reacción debe ser de 20 µl o menos. En otro tubo de ensayo, digerir aproximadamente 0,5 μg de ADN vector con la enzima de restricción correspondiente en un volumen de reacción total de 20 μl o menos. Si el ADN del vector tiene extremos idénticos, debe tratarse con ácido fosfórico de la siguiente manera: después de la digestión completa con enzimas de restricción, agregue 2,5 μL de tris 100 mmol/L. Cl (pH 8,3) y 10 mmol/l de ZnCl2, añadir 0,25 unidades de fosfatasa alcalina intestinal de ternera e incubar a 37 °C durante 30 minutos.

2) Separar el fragmento diana mediante electroforesis en gel de agarosa. El gel debe llenarse con agarosa de bajo punto de fusión y se utiliza 1xTAE que contiene bromuro de etidio (0,5 μg/ml) en lugar del 0,5xTBE convencional como tampón de electroforesis para preparar el gel y realizar la electroforesis.

3) Compruebe el gel bajo irradiación UV de longitud de onda larga y estime la cantidad de ADN contenido en función de la intensidad de fluorescencia relativa de la banda objetivo (consulte el Apéndice E). Utilice una hoja de afeitar para cortar la banda deseada y mantenga el volumen de agarosa lo más pequeño posible (generalmente 40-50 l). Coloque los trozos de gel cortados en tubos de microcentrífuga etiquetados.

4) Calentar a 70°C durante 10-15 minutos para derretir la agarosa.

5) Combine los geles pequeños derretidos y colóquelos en un tubo mediano calentado a 37 °C. El volumen * * * final no debe exceder los 65438 ± 00 μl, y la proporción molar de ADN exógeno al vector plasmídico. debería estar cerca de veintiuno.

Utilice otros dos tubos de ensayo para configurar dos reacciones de control, una que contenga solo el vector plasmídico y la otra que contenga solo el fragmento de ADN exógeno.

6) Incubar los tres tubos de ensayo a 37°C durante 5-10 minutos, luego agregar 10 μl de mezcla de ADN ligasa de fagocitos 2xT4 pretratada con hielo a cada tubo de ensayo y cargar antes de que la agarosa se solidifique. contenido de cada tubo de manera uniforme e incubar a 16°C durante 12-16.

La mezcla de ADN ligasa del fago 2xT4 se puede preparar de la siguiente manera:

1 mol/L de Tris. Cloro (pH 7,6) 1,0 μl

100 mmol/L cloruro de magnesio 1,0 μl

200 mmol/L tritiotreitol 1,0 μl

10 mmol/L ATP 1,0 μl

Agua 5,5 μl

ADN ligasa del bacteriófago T4 11 unidades

Agitar uniformemente y colocar en un baño de hielo.

7) Al final de la reacción de ligadura, sacar tres tubos de 200 μl de células competentes de E. coli congeladas a -70°C.

8) Calentar a 70°C durante 10-15 minutos para redisolver la agarosa en la mezcla de ligadura.

9) Tomar inmediatamente 5 μl de la mezcla de cada tubo de ensayo, añadirlos a 200 μl de células competentes de E. coli, agitar con cuidado y mezclar el contenido rápidamente. Repita los pasos anteriores eliminando 5 l de cada mezcla de ligadura restante y coloque la mezcla transformada en un baño de hielo durante 30 minutos.

10) La clonación molecular es un método de purificación y amplificación de fragmentos específicos de ADN a nivel molecular. A menudo contiene el gen diana, que se inserta en el vector de clonación mediante recombinación in vitro para formar un vector de clonación recombinante. Se introduce en un huésped adecuado mediante transformación y transducción para su replicación y amplificación, y luego se aísla y se purifica a partir del huésped seleccionado. células. El vector de clonación requerido se genera para obtener múltiples copias del ADN insertado, amplificando así el gen diana. La palabra clon proviene del griego klon, que significa rama.

En biología, su significado sustantivo se refiere a una célula o individuo que produce un grupo de células o individuos mediante reproducción asexual. Estas células o individuos tienen exactamente los mismos rasgos genéticos sin mutaciones, generalmente llamadas líneas (celulares) de reproducción asexual. ) se refiere a la inserción de un gen específico en una molécula vector mediante tecnología recombinante in vitro, es decir, tecnología de clonación molecular. El fragmento de ADN (o gen) se conecta a la molécula de ADN del vector, luego se introduce en la célula huésped y luego se obtienen clones recombinantes mediante detección. Según el propósito de la clonación, se puede dividir en clones de ADN y clones de ADNc. La clonación de ADNc utiliza ARNm como materia prima, realiza una transcripción inversa in vitro para sintetizar ADN complementario (ADNc) y luego lo conecta a la molécula de ADN portadora y la introduce en la célula huésped. Cada ADNc refleja la estructura de un ARNm y la distribución de los clones de ADNc también refleja la distribución del ARNm. Las características son: ① Algunos organismos, como los virus de ARN, no tienen ADN y solo pueden clonarse utilizando ADNc; ② Los clones de ADNc son fáciles de detectar porque la biblioteca de ADNc no contiene clones de genes no estructurados y cada clon de ADNc solo contiene. la información de un ARNm; ③ el ADNc se puede expresar en bacterias. El ADNC sólo representa la información genética expresada en una determinada etapa de desarrollo, y sólo las bibliotecas de genes contienen la información genética completa de un organismo. Clonación molecular - método (1) Preparación de fragmentos de ADN: Los siguientes métodos se utilizan comúnmente para obtener fragmentos de ADN: ① Utilice endonucleasas de restricción para cortar ADN de alto peso molecular en fragmentos de ADN de un tamaño determinado; obtener fragmentos de ADN aleatorios; ③ sintetizar artificialmente el fragmento del gen correspondiente cuando se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína; ④ generar ADNc a partir de ARNm mediante transcripción inversa. (2) Selección del ADN vector: ① Plásmido: El plásmido es un elemento genético extracromosómico bacteriano. El ADN es circular y tiene un tamaño de 1 a 200 pares de kilobases (kb). Existe en forma libre superenrollada en las células y es fácil de preparar. El ADN plasmídico se puede introducir en la bacteria huésped mediante transformación. Las células tienen dos estados, uno es "denso" y el segundo es "relajado". Además, también debe tener las características de peso molecular pequeño, fácil transformación y uno o más marcadores selectivos. Los vectores plásmidos sólo pueden transportar fragmentos de ADN de menos de 10 kb y son adecuados para construir bibliotecas de genes procarióticos, bibliotecas de ADNc y clonación secundaria. ② ADN del fago: el ADN del fago lambda comúnmente utilizado es de doble cadena, mide aproximadamente 49 kb de largo y contiene alrededor de 50 genes, el 50% de los cuales son necesarios para el crecimiento de los fagos y la lisis de las bacterias del huésped, y se distribuyen en ambos extremos del ADN del fago. Después de la transformación, se forman una serie de moléculas vectoriales con diferentes propiedades. El sistema de vector lambda es el más adecuado para construir bibliotecas de genes y bibliotecas de ADNc de eucarióticos. El fago M13 es un sistema de vector único que solo puede atacar a E. coli que porta el gen F sin lisar la bacteria huésped. M13DNA (RF) es una molécula circular de doble cadena en la bacteria huésped. Es casera como un plásmido y su método de preparación es el mismo que el de un plásmido. La bacteria huésped puede secretar el fago M13 que contiene ADN monocatenario, y el ADN monocatenario también se puede preparar fácilmente para análisis de secuencia de ADN, mutagénesis dirigida e hibridación de ácidos nucleicos. ③ Plásmido cos: es un tipo de molécula de ADN plásmido con secuencias de extremos pegajosos de ADN de fago. Esta es una mezcla de fagos y plásmidos. Esta molécula vector tiene una gran capacidad y puede transportar un fragmento de ADN extraño de 45 kb. También puede transportar pequeños fragmentos de ADN como plásmidos ordinarios y transformar directamente las bacterias huésped. Este vector se utiliza habitualmente para construir bibliotecas de genes de organismos superiores. (3) Conexión de fragmentos de ADN a vectores: la conexión de moléculas de ADN a moléculas de vectores es uno de los vínculos importantes en el proceso de clonación. Los métodos incluyen: ① Conexión de extremo adhesivo. Las secuencias de bases complementarias en ambos extremos de un fragmento de ADN se denominan extremos adhesivos. La digestión del ADN con la misma endonucleasa de restricción puede producir los mismos extremos adhesivos. Bajo la acción de la ligasa, puede restaurarse a su estado original. Aunque algunas enzimas de restricción reconocen secuencias diferentes, pueden producir extremos idénticos. ② Ligadura de extremos romos. El ADN preparado mediante métodos físicos suele tener extremos romos y algunas enzimas también pueden producir extremos romos. Algunas ADN ligasas pueden ligar fragmentos de ADN de extremos romos, pero la eficiencia de la ligadura no es tan alta como la de los extremos pegajosos. ③ Conecte los extremos del oligonucleótido. (4) Ligación artificial de la molécula conectora, agregando un fragmento de oligonucleótido sintético con un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción al extremo del fragmento romo de ADN, que producirá extremos pegajosos después de que actúe la enzima de restricción. Preste atención a la proporción de ADN del vector a fragmentos de ADN durante la reacción de ligadura. Cuando se utiliza el plásmido λ o Cos como vector, se forman moléculas de ADN multiplexadas lineales y la proporción entre el vector y los fragmentos de ADN es mejor.

Cuando se utilizan plásmidos como vectores, se forma una molécula circular y la proporción suele ser de 1:1. (4) Introducción de células huésped: ① Transformación o transfección, mezcle ADN plasmídico recombinante o ADN de fago (M13) con células huésped tratadas con cloruro de calcio y colóquelas en hielo. Una vez absorbido el ADN, se extiende sobre un medio de placa y luego se utiliza un medio selectivo para detectar recombinantes de acuerdo con el diseño experimental. Generalmente, la eficiencia de transformación de las moléculas recombinantes es menor que la del ADN no recombinante, porque la eficiencia de conexión no es alta y muchas moléculas de ADN no tienen capacidad de transformación después de la recombinación. ②Transducción. El proceso mediante el cual el virus infecta a la bacteria huésped se llama transducción y la eficiencia de la transducción es generalmente mayor que la de la transformación. (5) Selección de clones: ① Detección directa: algunos vectores tienen marcadores genéticos identificables que pueden distinguir eficazmente las moléculas recombinantes del fondo. Por ejemplo, las placas formadas por algunos fagos lambda que portan genes extraños cambiarán de turbias a claras; después de que algunas moléculas vectoriales porten genes extraños, el color de las colonias o placas formadas cambiará significativamente, como por ejemplo de azul a incoloro; infecta a la bacteria A pero no a la bacteria B, pero puede infectar a la bacteria B después de transportar fragmentos de ADN extraños, por lo que los fagos liberados por la bacteria B son todos moléculas recombinantes. (2) Detección indirecta: hay un gen que hace que la molécula portadora porte uno o más marcadores de resistencia a los medicamentos. Cuando se inserta ADN extraño en la región del gen de resistencia, el gen se inactiva y la resistencia desaparece. Si un plásmido tiene dos genes de resistencia a fármacos, A y B, cuando el gen extraño se inserta en la región del gen B, sólo resistirá al fármaco A pero no al fármaco B. Por lo tanto, puede crecer normalmente en el medio de cultivo del fármaco A pero no en el medio de cultivo. fármaco A. Son las moléculas recombinantes las que no pueden crecer normalmente en el medio del fármaco B. ③Hibridación de ácidos nucleicos: ampliamente utilizada para detectar clones con secuencias de ADN específicas. El método consiste en "imprimir" colonias o placas sobre soportes como membranas de nitrocelulosa, desnaturalizarlas y fijarlas in situ y luego hibridarlas con sondas de ácido nucleico marcadas. La ubicación del punto positivo es el clon deseado. ④Métodos inmunológicos: si el clon recombinante se puede expresar en la bacteria huésped, se pueden usar anticuerpos proteicos específicos como sondas para la hibridación in situ para seleccionar clones específicos. Clonación molecular: la importancia de la tecnología de clonación molecular no se desarrolló hasta la década de 1970. Su aparición y aplicación han abierto un nuevo campo de investigación en genética molecular, abriendo la puerta para que los humanos comprendan, identifiquen, aíslen y modifiquen genes y creen nuevas especies. Los resultados tendrán un profundo impacto en la industria, la agricultura, la ganadería y la medicina, y abrirán nuevas vías para resolver las tres principales crisis de energía, alimentación y protección ambiental que enfrenta el mundo. En medicina, genes como la insulina, la hormona de crecimiento humana, bovina y de pollo, el interferón humano, la relaxina, la eritropoyetina, el antígeno del virus de la hepatitis B y el antígeno del virus de la fiebre aftosa se han convertido en bacterias diseñadas mediante tecnología de clonación molecular y Fermentación Producción industrial en masa. También puede aumentar la producción de proteasas y antibióticos producidos por los propios microorganismos. en terapia génica. Mediante ingeniería genética podemos ver que las células cancerosas tienen la posibilidad de transformarse en células normales. Por ejemplo, las células tumorales de ratón causadas por el virus SV40 pueden transformarse reversiblemente en células normales a altas temperaturas. Para tratar la galactosemia, se infectaron células cultivadas de pacientes con galactosemia con el fago operón lambda de lactosa de E. coli. Se descubrió que estas células tenían niveles normales de galactosidasa y podían metabolizar la galactosa. En la producción industrial, la ingeniería genética, la ingeniería celular, la ingeniería enzimática y la ingeniería de fermentación basadas en la tecnología de clonación molecular están estrechamente relacionadas y, a menudo, se utilizan de forma integral. Muchos reactivos químicos, como el ácido acrílico, el ácido adípico, el etilenglicol, el metanol, el óxido de etileno, el ácido aconítico y el ácido salicílico, se pueden obtener mediante técnicas de clonación molecular. En términos de protección ambiental, las personas realizan manipulación genética según las necesidades, transfiriendo los genes de un microorganismo a otro y creando algunas cepas nuevas con mayor capacidad para degradar sustancias nocivas, descomponiendo así sustancias tóxicas en las aguas residuales industriales. En la industria alimentaria, las bacterias producen proteínas, aminoácidos y azúcares valiosos para el ser humano. En la producción agrícola, la ingeniería genética vegetal permite aumentar el rendimiento de los cultivos y generar nuevas variedades de cultivos. Se han introducido con éxito muchos genes extraños en las plantas.