Cómo etiquetar con isótopos
El método de rastreo de isótopos es un método de análisis de trazas que utiliza radionúclidos como trazadores para marcar objetos de investigación. Es el origen del experimento de trazadores. En 1923, Hevesi utilizó por primera vez 212Pb radiactivo natural para estudiar la distribución y transferencia de sales de plomo en leguminosas. Luego, Jolit y Curie descubrieron la radiactividad artificial en 1934, y los métodos de producción posteriores (aceleradores, reactores, etc.) proporcionaron las condiciones básicas y fuertes garantías para el desarrollo más rápido y la aplicación generalizada de los métodos de rastreo de radioisótopos.
1. Principios básicos y características del método de rastreo de isótopos
Los radionucleidos (o nucleidos estables) y sus compuestos utilizados para el rastreo de isótopos son los mismos que los correspondientes elementos comunes existentes en la naturaleza. y sus compuestos tienen las mismas propiedades químicas y biológicas pero diferentes propiedades físicas nucleares. Por lo tanto, los isótopos se pueden utilizar como etiquetas para que los compuestos marcados que contienen isótopos (como alimentos, medicamentos y metabolitos etiquetados) reemplacen a los correspondientes compuestos no marcados. Utilizando las propiedades físicas nucleares de los isótopos radiactivos que emiten continuamente rayos característicos, podemos utilizar detectores nucleares para rastrear su ubicación, cantidad y transformación dentro o fuera del cuerpo en cualquier momento. Aunque los isótopos estables no emiten radiación, pueden medirse mediante instrumentos de análisis de masas como espectrómetros de masas, cromatógrafos de gases y resonancias magnéticas nucleares. Como trazadores se pueden utilizar isótopos radiactivos y estables. Sin embargo, como trazadores, los isótopos estables tienen baja sensibilidad, pocas especies disponibles y son costosos, lo que limita su ámbito de aplicación. El uso de isótopos radiactivos como trazadores no sólo es sensible, sino también simple y fácil de medir. Puede cuantificarse y posicionarse con precisión y es consistente con las condiciones fisiológicas de los sujetos bajo estudio.
1. Alta sensibilidad
El método del trazador radiactivo puede detectar el nivel de energía de 10-14-10-18 g, es decir, se puede detectar 1 átomo radiactivo de 1015 no radiactivos. átomos. 108-107 veces más sensibles que las balanzas gravimétricas sensibles actuales, los métodos de análisis químico más precisos hasta la fecha tienen dificultades para determinar niveles de 10-12 g.
2. Este método es simple y fácil de implementar
La determinación de la radiactividad no se ve interferida por otras sustancias no radiactivas, por lo que se pueden omitir muchos pasos de separación complicados. Al rastrear in vivo, se pueden usar algunos isótopos radiactivos para liberar rayos R penetrantes y los resultados se pueden obtener in vitro, lo que simplifica enormemente el proceso experimental y logra un análisis no destructivo. Con el desarrollo de la tecnología de recuento de centelleo líquido, los isótopos radiactivos emisores de rayos β blandos 14C y 3H se utilizan cada vez más en experimentos médicos y biológicos.
3. Posicionamiento y cuantificación precisos
El método de rastreo de isótopos radiactivos puede determinar de forma precisa y cuantitativa la transferencia y transformación de sustancias metabólicas y se combina con algunas técnicas morfológicas (como la tecnología de seccionamiento de tejido patológico). , tecnología de microscopía electrónica, etc.), se puede determinar la distribución cuantitativa de trazadores radiactivos en tejidos y órganos, y la precisión de posicionamiento de tejidos y órganos puede alcanzar el nivel celular, el nivel subcelular e incluso el nivel molecular.
4. Cumplir con las condiciones fisiológicas
En los experimentos con isótopos radiactivos, la cantidad química de compuestos marcados radiactivamente citados es muy pequeña y el cambio de peso de las sustancias originales correspondientes en el cuerpo es insignificante. Los procesos fisiológicos permanecen en un estado normal de equilibrio. Los resultados del análisis obtenidos están en línea con las condiciones fisiológicas y pueden reflejar mejor la esencia de las cosas objetivas. Las ventajas del método de rastreo de isótopos radiactivos se han presentado anteriormente, pero también existen ciertas desventajas, por ejemplo, el personal que realiza trabajos con isótopos radiactivos debe recibir una capacitación especial y contar con las medidas y condiciones de protección de seguridad correspondientes (como oxígeno y nitrógeno). ) actualmente no tienen radioisótopos adecuados. En los experimentos con trazadores también se debe prestar atención al efecto isotópico y al efecto de radiación del trazador. El llamado efecto isotópico se refiere a las diferencias obvias en las propiedades individuales causadas por ligeras diferencias en las propiedades químicas de los isótopos radiactivos (o isótopos estables) y los elementos ordinarios correspondientes. Para los elementos ligeros, el efecto isotópico es más severo. Debido a que la resolución de masa entre isótopos se duplica, por ejemplo, la masa de 3H es tres veces la de 1H y la masa de 2H es el doble de la de 1H. Por lo tanto, cuando se utiliza agua con tritio (3H2O) como trazador, su masa. en H2O ordinario el contenido no puede ser demasiado grande, de lo contrario cambiará las constantes físicas del agua, la permeabilidad de la membrana celular y la viscosidad del citoplasma. Sin embargo, en los experimentos de rastreo generales, los errores causados por los efectos de los isótopos suelen estar dentro del error experimental y pueden ignorarse. La radiación liberada por los isótopos radiactivos es beneficiosa para el seguimiento y la medición, pero cuando la radiación actúa sobre un organismo en una determinada dosis, cambiará el estado fisiológico del organismo. Este es el efecto de la radiación de los isótopos radiactivos.
Por lo tanto, la dosis de radioisótopos debe ser menor que la dosis segura y controlarse estrictamente dentro del rango permitido por el organismo para evitar que los sujetos experimentales resulten dañados por la radiación y obtengan resultados erróneos.
2. Principios de diseño de experimentos con trazadores
El diseño de experimentos con trazadores de radioisótopos debe considerarse desde tres aspectos: finalidad experimental, condiciones experimentales y nivel de protección radiactiva. En principio, los experimentos de rastreo radiactivo deben diseñarse a partir de dos aspectos principales: uno es buscar condiciones efectivas y repetibles para medir la intensidad radiactiva, y el otro es seleccionar una actividad específica adecuada λqδ (la unidad es átomos/tiempo/molécula, dpm/mol o CI/mol). donde λ =-dn' dt/n ' es la constante de desintegración del núcleo radiactivo allí. Q = n'/N', lo que significa que N' moléculas de esta forma química están marcadas con N' átomos radiactivos. δ = n'/n representa la relación entre el número de moléculas marcadas radiactivamente n' y el número total de moléculas (marcadas y no marcadas) n. Generalmente se requiere el uso de tecnología de rastreo de radioisótopos para lograr todo o parte del propósito previsto de un tema de investigación. tres pasos: fase de preparación experimental, fase experimental y fase de eliminación de residuos radiactivos.
(1) Etapa de preparación experimental
1. Selección del trazador
La actividad específica λqδ del trazador radiactivo seleccionado debe ser lo suficientemente grande como para garantizar la sensibilidad requerida. para el experimento, pero hágalo lo más pequeño posible para que la autodescomposición por radiación pueda ignorarse en las condiciones de este experimento. En términos generales, de acuerdo con el propósito del experimento y la duración del período del experimento, se seleccionan isótopos radiactivos con modo de desintegración, tipo de radiación y vida media adecuados y baja toxicidad por radiación. Hasta el momento se han identificado 58 radionucleidos, incluidos 58 radionucleidos naturales y 1.300 radionucleidos artificiales, la mayoría de los cuales no pueden utilizarse regularmente como trazadores radiactivos. Las principales razones son la dificultad de preparación, la vida media inadecuada y la radiactividad insuficiente. En cualquier método de producción, es probable que los pasos de producción impliquen más o menos procesamiento químico, por lo que el experimentador del trazador necesita conocer las propiedades químicas de un nucleido y los elementos que lo rodean, ya que pueden convertirse en el isótopo radiactivo de las impurezas.
Todos los isótopos radiactivos se desintegran (con o sin estados intermedios) en nucleidos hijos en estado fundamental, acompañados de diversas formas de radiación energética, como la radiación α, β-, β+, γ y X. Al seleccionar un trazador, el experimentador del trazador debe estudiar cuidadosamente el esquema de desintegración y decidir qué radiación utilizar en función de las condiciones experimentales y de conteo. En la transformación del diagrama de desintegración, la suma de las distancias entre las dos líneas horizontales que representan los niveles de energía nuclear representa la diferencia de energía, ↑ o ↓ representa el cambio del nivel de energía con el aumento o disminución del número atómico, y ↓ representa el transición homogénea del estado excitado al estado fundamental. Generalmente es necesario seleccionar el isótopo radiactivo más apropiado con una vida media τ de modo que τ sea lo suficientemente larga para que la corrección de la desintegración sea significativa o no necesaria en absoluto, lo suficientemente corta para realizar experimentos con trazadores de manera segura y para que los desechos radiactivos sean fáciles de manejar. . En el trabajo práctico, la vida media del isótopo radiactivo utilizado debería ser compatible con la duración experimental t. Por ejemplo, para un experimento en el que t/τ = 0,04, la corrección de desintegración para el radioisótopo seleccionado debe ser 3,5. Cuando t/τ = 0,10, la corrección de desintegración del isótopo radiactivo debería ser del 6,6%. Cuando t/τ = 0,15, su corrección de caída debe ser del 10%.
En condiciones de rastreo in vitro, generalmente se seleccionan trazadores radiactivos con vidas medias largas e intensidad de radiación moderada, que no solo favorecen la detección, sino que también son fáciles de proteger y preservar. En condiciones de rastreo in vivo, si el período experimental es corto, se deben seleccionar isótopos radiactivos con vidas medias cortas y capaces de emitir rayos gamma de cierta intensidad si el período experimental es largo, cuando es necesario medir los tejidos y órganos por separado; después de matar animales, se deben seleccionar radioisótopos con vidas medias largas de isótopos radiactivos. Además, los trazadores de etiquetado con o sin localización se eligen según el propósito experimental. Por ejemplo, cuando se estudia la descarboxilación de aminoácidos, es necesario marcar 14C en el grupo carboxilo. Sólo los aminoácidos con esta etiqueta de posicionamiento pueden producir 14CO2 después de la descarboxilación. Sin embargo, algunos experimentos no requieren marcadores de ubicación específicos, sólo marcadores uniformes.
La selección de trazadores radiactivos también debe cumplir con los requisitos de alta pureza química y alta pureza radionuclear. Durante la preparación y almacenamiento de trazadores, los disolventes, reactivos químicos y enzimas utilizados en el sistema de prueba pueden generar impurezas químicas, impurezas radioquímicas e impurezas radiactivas resultantes de la autodescomposición de la radiación. La presencia de estas impurezas hace que el trazador utilizado en el experimento con trazadores sea impuro, lo que afecta en mayor o menor medida a los resultados experimentales e incluso conduce a conclusiones erróneas. La timidina tritiada (3H-TDR) y la uridina (3H-UR) son dos trazadores de uso común.
El primero se une eficazmente al ADN y el segundo se mezcla con el ARN. Su tasa de radiólisis aumenta con el aumento de la radiactividad relativa y el tiempo de almacenamiento, y su estabilidad es diferente a diferentes temperaturas y en diferentes soluciones. Aproximadamente el 35 % del ~3H-TdR almacenado durante ocho años se descompuso radiolíticamente en ~3H-timina, lo que dio lugar a formas de diol e hidrato. En experimentos, esta impureza se incorpora rápidamente a las células, uniéndose a moléculas grandes (probablemente proteínas) en lugar de ADN y ARN, y estas impurezas no se eliminan cuando las células se tratan con ADNasa y ARNasa. La velocidad de separación de la radiación de 3H-TDR y 3H-UR en una solución de criopreservación de -20 ℃ es 3-4 veces mayor que +2 ℃, pero la baja temperatura (-140 ℃) también favorece el almacenamiento, lo que ayudará a los experimentadores de trazadores a elegir Los trazadores arrojan algo de luz.
2. Selección del método de medición del radioisótopo
La elección del método de medición depende del tipo de rayo. Para los rayos alfa, normalmente se pueden utilizar cristales de sulfuro de zinc, cámaras de ionización, látex nuclear y otros métodos para la detección. Para los rayos β de alta energía, se pueden usar tubos contadores de ventana de mica, cristales de centelleo de plástico y látex nuclear para medir. Para los rayos β de baja energía, se pueden usar contadores de centelleo líquido para medir. y para la detección se pueden utilizar cristales de centelleo de yoduro de sodio (talio). En la actualidad, la mayoría de los laboratorios utilizan principalmente el recuento de centelleo de cristales y el recuento de centelleo de líquidos.
Un mismo detector tiene diferentes condiciones óptimas de trabajo para diferentes cantidades de trazador. En la etapa de preparación del experimento, es necesario verificar si el detector ha ajustado las condiciones de trabajo del isótopo trazador utilizado. De lo contrario, es necesario utilizar una cierta cantidad de trazador como fuente radiactiva (o seleccionar la fuente estándar de). El isótopo) para ajustar las condiciones de trabajo óptimas del detector, asegurando que el rendimiento del detector sea estable y confiable.
El método de selección para detectar las mejores condiciones de trabajo: uno es medir la "curva de plataforma" y el otro es encontrar el mejor factor de calidad. Para los tubos fotomultiplicadores, en teoría no existe una "meseta". A medida que aumenta el alto voltaje, el número de pulsos no cambia mucho dentro de un cierto rango, formando una curva de pulsos de voltaje con una pendiente menor, que generalmente se denomina meseta. Método para aplanar la curva: fije la fuente radiactiva y seleccione inicialmente una ganancia de amplificador (aumento) y un umbral discriminador en función de su energía de radiación. Cambie continuamente el alto voltaje (de bajo a alto, aumentando el voltaje de manera uniforme). Cada vez que se cambia el alto voltaje, mida la tasa de conteo del fondo y de la fuente radiactiva, y finalmente haga la tasa de conteo del fondo de alto voltaje y el conteo. curva de la fuente radiactiva de alto voltaje. De la misma manera, haga una curva de tasa de conteo de alta presión bajo otro umbral de detección (aumento constante) y haga repetidamente varias curvas más. Si es necesario, se puede fijar el umbral de detección, se puede cambiar la ampliación y se puede obtener una curva de tasa de conteo de alta presión. Las condiciones de trabajo del instrumento para la medición formal del tiempo deben ser las condiciones de trabajo de la curva con una "meseta" relativamente plana, es decir, el umbral de resolución y la ganancia de amplificación. El valor de alto voltaje debe seleccionarse desde el punto medio del ". meseta" hasta la sección de inicio. El factor de calidad, también conocido como factor de calidad, se refiere al tiempo necesario para alcanzar una estadística adecuada bajo ciertas condiciones. Es función de la eficiencia de conteo E del instrumento y del conteo de fondo Nb: el factor de calidad F = E2/Nb, que es una medida del contador de indicadores de desempeño. Cuanto mayor sea el factor de calidad F del instrumento, mejor. Cuanto mayor sea el factor de calidad F, mayor será la eficiencia de medición E y menor el fondo NB. Si la fuente estándar del trazador radiactivo tiene problemas como la dificultad de la fuente, se puede utilizar en su lugar el factor de calidad relativa f = ns/nb, donde ns se refiere a la tasa de conteo de la muestra radiactiva. El método para encontrar el mejor factor de calidad es el mismo que el de la curva de meseta. Haga varias curvas F (o F) de alta presión y seleccione la curva con el pico más alto entre varias curvas. Las condiciones correspondientes al valor pico de esta curva: alto voltaje, umbral de discriminación, magnificación, etc. , que es la condición de funcionamiento óptima del instrumento para el isótopo que se está midiendo. Los factores de mejor calidad no necesariamente caen en "plano", algunos están cerca de "plano" y otros se encuentran en el extremo inferior de "plano". Los experimentadores trazadores que se centran en contar todo el pico del espectro de energía de un isótopo abogan por condiciones de trabajo correspondientes a lo "plano", mientras que los experimentadores que se centran en valores sobresalientes abogan por condiciones de trabajo correspondientes al mejor factor de calidad y algún compromiso. Si el fondo del instrumento es muy bajo, el ruido del tubo fotomultiplicador es muy bajo y la resolución del espectro de energía es alta, debería haber poca diferencia entre los dos. Las condiciones de trabajo óptimas del mismo instrumento cambian a medida que se prolonga la vida útil del instrumento, y las condiciones de trabajo óptimas de diferentes isótopos radiactivos también son diferentes. Por lo tanto, las condiciones óptimas de trabajo de los instrumentos de detección nuclear son excluyentes y, a menudo, es necesario seleccionar las condiciones óptimas de trabajo para diferentes períodos. Además, debemos utilizar las mismas condiciones de trabajo independientemente del tipo de isótopo a medir.
Para lograr un conteo preciso, puede contar una vez durante mucho tiempo o medir varias veces en poco tiempo. Los errores estándar de los dos son básicamente los mismos. Para evitar la influencia de factores externos, es más razonable y aplicable realizar múltiples mediciones en un corto período de tiempo en el trabajo real. El fondo es un factor importante a la hora de medir la radiactividad de una muestra. Cuando el fondo es alto, el error estándar y la desviación estándar aumentarán, especialmente cuando el número de muestras es bajo, el fondo tiene un mayor impacto en el error estándar y la desviación estándar, lo que afecta la precisión de los resultados experimentales. Para lograr una cierta precisión, es necesario aumentar el tiempo de medición de la muestra. De acuerdo con la ley estadística de la desintegración nuclear, si el número de muestras en el experimento es pequeño, es razonable elegir tN = 1,4 tb (donde tN es el tiempo de medición de la radiactividad de la muestra y tb es el tiempo de medición del fondo); el número de muestras es grande, el tiempo de medición de fondo tb Para ampliar, tome el tiempo promedio de tb, y tN puede ser relativamente corto, lo que puede ahorrar tiempo y acortar el ciclo experimental. Para el diseño de experimentos con trazadores, el requisito de la intensidad radiactiva contenida en la muestra es hacer que su tasa de recuento radiactivo sea mayor o igual a 10-20 veces el recuento de fondo.
3. Realizar experimentos de simulación no radiactiva y ensayar todo el proceso del experimento.
Los experimentos de rastreo de isótopos requieren precisión y meticulosidad. Apresurarse a realizar experimentos formales con una leve negligencia o falta de consideración no sólo conducirá al fracaso del experimento, sino también al desperdicio de suministros experimentales, como los trazadores, y a un aumento de los desechos radiactivos. , aumentando el nivel de fondo en el laboratorio y provocando que el experimentador reciba dosis de radiación innecesarias. Por lo tanto, el experimento de simulación no sólo puede verificar si el equipo y los medicamentos utilizados en el experimento formal están calificados, sino también capacitar a los operadores para garantizar el buen progreso del experimento formal.
(2) Etapa experimental formal
1. Seleccionar la dosis de isótopo radiactivo.
El isótopo debe ser capaz de resistir la dilución, de modo que se reduzca la radiactividad del mismo. La muestra final no puede ser inferior al fondo. En términos generales, los isótopos radiactivos no se diluyen completa y uniformemente en los organismos vivos y pueden acumularse selectivamente en ciertos órganos, tejidos, células y ciertas moléculas, y parte de la radiactividad acumulada será muy fuerte. En este caso, la dosis del trazador debe considerarse en función de la tasa de acumulación del trazador en el sitio de interés. En experimentos de rastreo, como cultivos celulares, aislamiento de cortes y reacciones enzimáticas, la cantidad de trazador debe considerarse según el propósito del experimento, el tiempo de reacción y el volumen de reacción, y generalmente es inferior a un microcurio o varios microcurios. Debido al efecto de radiación de los isótopos radiactivos, la dosis debe controlarse dentro de la dosis máxima permitida según el tipo de radionúclido utilizado, a fin de evitar que una dosis excesiva cause efectos de radiación y grandes errores en el experimento.
2. Seleccione la ruta de suministro del trazador.
En todo el experimento del trazador, se debe seleccionar una ruta de alimentación que sea fácil de absorber y operar de acuerdo con el propósito del experimento. Generalmente, la cantidad y el volumen administrados son relativamente pequeños y la dosis requerida debe ser precisa para evitar posibles pérdidas y contaminación innecesaria. En los experimentos de rastreo in vitro, se debe agregar una cierta dosis de trazador al sistema de reacción de acuerdo con un cierto vínculo de los pasos experimentales diseñados en el experimento, y la operación debe ser precisa y meticulosa.
3. Preparación de muestras biológicas radiactivas
Las muestras biológicas radiactivas se preparan según el propósito del experimento y las propiedades de los radioisótopos marcados por el trazador, donde se determinan las propiedades de los radiactivos. Los isótopos son muestras biológicas. La base principal para preparar el formulario. Si se trata de un trazador que emite rayos R, la preparación de la muestra es relativamente fácil. Simplemente se extrae cuantitativamente la sustancia medida y se coloca en un cristal de NaI(TL) bien formado, y luego se puede realizar la medición. Si se libera un trazador de rayos beta duro, la muestra biológica debe convertirse en un líquido diluido, o el líquido puede extenderse para que se seque, o puede reducirse a cenizas y extenderse, y colocarse en un centelleador de cristal de plástico para su medición, o una forma de campana Cubra el tubo contador para la detección; si el isótopo marcado solo emite rayos beta suaves, la muestra debe convertirse en una muestra de centelleo líquido (consulte el capítulo sobre medición de radiactividad para obtener más detalles) y medirse en un contador de centelleo líquido. Independientemente del método de medición utilizado, las muestras deben recolectarse cuantitativamente. Algunas muestras radiactivas dispersas deben concentrarse adecuadamente. Por ejemplo, para medir la radiactividad de las proteínas en los tejidos, las proteínas deben extraerse y luego prepararse en las muestras de medición correspondientes. Algunas muestras requieren métodos de incineración, pero los métodos de incineración no son adecuados para isótopos volátiles o muestras de tejido volátiles.
4. Medición de muestras radiactivas
Los métodos de medición se dividen en medición absoluta y medición relativa. Las mediciones absolutas miden la intensidad de radiactividad real de una muestra y descubren la tasa real de desintegración del isótopo marcado en la muestra. En la medición absoluta, es necesario corregir algunos factores, incluido el ángulo sólido relativo de la sonda del instrumento con respecto a la fuente radiactiva, la probabilidad de contar después de que la sonda recibe los rayos, la retrodispersión y el efecto de autoabsorción de la fuente radiactiva.
La medición relativa es sólo una medición relativa de la intensidad radiactiva en un instrumento de detección fijo y no persigue su tasa de desintegración real. En los experimentos de rastreo generales, las mediciones relativas se utilizan principalmente para comparar diferencias entre muestras. Durante las mediciones relativas, se debe tener cuidado de mantener fija la posición geométrica entre la muestra y el detector. La influencia de las condiciones geométricas es el factor más importante en las mediciones de radiactividad. Cuando dos muestras con la misma intensidad de radiactividad se colocan en diferentes posiciones geométricas en la medición, o las condiciones geométricas causadas por el proceso de preparación de la muestra son diferentes, sus tasas de conteo serán muy diferentes, especialmente cuando la distancia entre la muestra y la sonda es cerca . Cuando la distancia entre la muestra y la sonda es mayor, la diferencia entre las dos tasas de conteo se reducirá significativamente debido al ángulo sólido relativo más pequeño formado entre la muestra y la sonda. Al medir la intensidad de la radiactividad de los marcadores 3H utilizando el método del disco de papel, se debe prestar atención a la posición del disco de papel en el vial de centelleo y el lote de muestras debe ser consistente. Si el papel de filtro se corta en forma de círculo como soporte, el diámetro del disco debe ser igual al diámetro del fondo del vial de centelleo para garantizar que el papel de filtro permanezca en una posición fija en el vial de centelleo. Hay tres formas de reducir el impacto de las condiciones geométricas en las mediciones de radiactividad: (1) Elegir un detector con una ventana de detección grande, como un tubo fotomultiplicador (2) Al preparar una muestra, preste atención a convertir la muestra en una fuente puntual; tanto como sea posible, de modo que cuando la intensidad de radiactividad de la muestra sea débil, se pueda ignorar la influencia del desplazamiento horizontal que puede ser causado por estar cerca de la ventana de detección (3) No importa qué tan lejos esté la muestra; la ventana de detección, la muestra debe colocarse en el eje vertical de la ventana de detección para reducir la distancia entre la muestra y la ventana de detección.
(3) Descontaminación radiactiva y tratamiento de residuos radiactivos
Los experimentos radiactivos, ya sea después de cada experimento o en experimentos por fases, pueden contener diversos grados de contaminación radiactiva y residuos radiactivos. Por lo tanto, después del experimento se debe realizar la descontaminación y eliminación de residuos radiactivos. Cuando sea necesario, durante el experimento, es necesario eliminar la contaminación y limpiar los desechos radiactivos.
Aplicación del método de rastreo de isótopos en bioquímica y biología molecular
El método de rastreo de isótopos radiactivos se usa ampliamente en bioquímica y biología molecular, y es muy importante para revelar los cambios en el cuerpo y las células. . Los secretos de los procesos físicos y químicos y el esclarecimiento de la base material de las actividades vitales desempeñan un papel extremadamente importante. En los últimos años, se han producido muchos avances nuevos en la tecnología de rastreo de isótopos, como la tecnología de doble y múltiple etiquetado, la tecnología de rastreo de isótopos estables, el análisis de activación, la tecnología de microscopía electrónica, la combinación de tecnología de isótopos y otras nuevas tecnologías, etc. Debido al desarrollo de estas tecnologías, la bioquímica ha pasado del nivel estático al dinámico, del nivel celular al nivel molecular, y se han aclarado una serie de cuestiones importantes como el código genético, los receptores de la membrana celular y la transcripción inversa ARN-ADN, abriéndose nuevas vías para que los seres humanos entiendan los fenómenos básicos de la vida. A continuación se presenta la aplicación de la tecnología de rastreo de isótopos en bioquímica y biología molecular.
1. La investigación de Xie sobre la sustitución de materiales
Hay muchos tipos de sustancias en el cuerpo humano. ¿Cómo cambian? Si utiliza marcadores isotópicos apropiados como trazadores y analiza los cambios en el contenido de isótopos en estas sustancias, puede conocer la relación entre ellas, distinguir quién es el precursor y quién es el producto, y analizar en qué partes de las moléculas de la sustancia existe el trazador isotópico. atómicamente, infiriendo así aún más el mecanismo de transformación entre varias sustancias. Para estudiar la biosíntesis y el metabolismo del colesterol, se utilizó el método de etiquetado de precursores para revelar las vías y pasos de la producción de colesterol. Los experimentos han demostrado que todos los compuestos que el cuerpo puede convertir en acetil-CoA pueden utilizarse como materia prima para la producción de colesterol. Todo el proceso biosintético del acetato al colesterol implica al menos 36 reacciones químicas, con 20 intermediarios entre el escualeno y el colesterol. La vía de biosíntesis del colesterol se puede simplificar como: ácido acético → metildihidroxivalerato → colesterol. Por ejemplo, al estudiar la fuente del colesterol en el hígado, los experimentos con trazadores con inyección intravenosa del isótopo radiactivo 3H-colesterol mostraron que la mayor parte de la radiactividad ingresa al hígado y reaparece en las heces. La tiroxina puede acelerar este proceso, lo que indica que el hígado. procesa el colesterol plasmático. El principal órgano del cuerpo, el mecanismo por el cual la glándula tiroides reduce los niveles de colesterol en sangre es que acelera la transferencia del colesterol plasmático al hígado.
2. Investigación sobre la transformación material
La ley de transformación mutua de las sustancias en el organismo es un contenido importante y esencial de las actividades de la vida. En el pasado, la enzimología in vitro se utilizaba generalmente para estudiar la transformación de sustancias, pero es posible que los resultados de la enzimología in vitro no representen toda la situación. La aplicación de la tecnología de rastreo de isótopos ha acortado en gran medida el ciclo experimental de transformación de sustancias. Puede aplicarse a sistemas in vitro, de cuerpo entero y sin células, simplifica las operaciones, mejora la sensibilidad de la determinación y puede usarse para análisis tanto cualitativos como cuantitativos. .
En los estudios que aclaran la conversión de ácidos ribonucleicos en desoxirribonucleótidos, se utiliza el método de doble marcaje, mediante el cual la radiactividad del producto se mide mediante doble marcaje o después de una separación química. Por ejemplo, las bases y ribosa de los nucleótidos de guanina (GMP) se marcan con 14C respectivamente, y se añaden nucleótidos de desoxiguanina (dGMP) al sistema in vitro. Luego, después de la hidrólisis ácida y la separación cromatográfica de la etiqueta original y el producto (una mezcla de dGMP y GMP doblemente marcado), se midió la radioactividad de las respectivas bases y azúcares pentosas. Los resultados mostraron que las relaciones de radioactividad de las dos partes eran. básicamente lo mismo. Demuestra que el azúcar pentosa del producto dGMP es el azúcar pentosa del GMP original etiquetado y no tiene otra fuente. De lo contrario, la proporción de bases a ribosa en el producto dGMP debe ser significativamente diferente de la proporción de las dos partes del producto. Etiquetado GMP original. Este experimento demostró que la desoxigenación de las pentosas se llevó a cabo sin recordar la base y el azúcar pentosa, lo que demuestra que los desoxirribonucleótidos se convirtieron directamente a partir de ribonucleótidos, en lugar de que los ribonucleótidos se descompusieran primero en ribosa y bases, que luego se vuelven a unir a los desoxirribonucleótidos. Los experimentos de rastreo sin células pueden analizar la transformación de sustancias intracelulares, como los experimentos de rastreo de incorporación de ADN que utilizan 3H-dTTP como precursor. Después de la incorporación de acuerdo con un diseño experimental determinado, se mide la radiactividad del ADN producto recién sintetizado. Indicadores de detección de ADN.
3. Investigación del equilibrio dinámico
Aclarar que las sustancias de los organismos vivos se encuentran en un estado de equilibrio dinámico constantemente actualizado es una de las principales contribuciones de los métodos de rastreo de radioisótopos a las ciencias de la vida. Al introducir marcadores isotópicos apropiados en el cuerpo y medir los cambios en el contenido de isótopos de la sustancia en diferentes momentos, podemos comprender los cambios en la sustancia en el cuerpo, calcular cuantitativamente la tasa metabólica de la sustancia en el cuerpo y calcular la renovación. velocidad y tiempo de la sustancia. Varias sustancias en el cuerpo tienen diferentes reservas metabólicas y el tamaño de la reserva metabólica se puede obtener mediante el método de dilución de isótopos.
4. Análisis de sustancias traza en muestras biológicas
Antes de la aplicación de la tecnología de rastreo de radioisótopos, debido a la pérdida de muestras, la tasa de recuperación era baja y la sensibilidad de la medición no era alta. , y fue difícil determinar las sustancias traza correctas que desempeñan un papel importante en las funciones normales del cuerpo. El radioinmunoensayo es un método de análisis de ultratrazas que se ha desarrollado rápidamente y se utiliza ampliamente en los últimos años. Puede detectar más de 300 sustancias, la mayoría de las cuales son hormonas, incluidas hormonas esteroides, hormonas peptídicas, hormonas no peptídicas, sustancias proteicas, nucleótidos cíclicos, enzimas, antígenos relacionados con tumores, anticuerpos, patógenos, trazas de fármacos y otras sustancias.
5. Método de análisis de secuencia del vecino más cercano.
La tecnología de rastreo de isótopos radiactivos es uno de los métodos importantes en la investigación de biología molecular. Desempeña un papel muy importante en el estudio de la biosíntesis de proteínas, desde la replicación del ADN y la transcripción del ARN hasta la traducción de proteínas. El método de análisis de secuencia del vecino más cercano utiliza tecnología de rastreo de isótopos combinada con la teoría de la digestión enzimática y la teoría estadística para estudiar y confirmar la regularidad de la disposición de las bases en las moléculas de ADN. El experimento de síntesis de ADN in vitro se llevó a cabo en cuatro lotes. Cada lote se marca con un trifosfato de desoxinucleósido 32P diferente. El 32P se marca en la posición 5'C de la pentosa. Después de la síntesis en condiciones completas, se utiliza una enzima específica para abrir el enlace 5'C-P, de modo que el 5'C original. el enlace de la pentosa puede ser 32P en la base se mueve al vecino más cercano. El análisis de la secuencia del vecino más cercano propuso por primera vez las bases biológicas moleculares de la replicación del ADN y la transcripción del ARN, estableciendo así la tecnología de hibridación molecular. Por ejemplo, se añade una cierta cantidad de ADN T2 y otro ADN al ARN [32P], y las dobles hebras de ADN se abren mediante calentamiento e incubación. Los complejos de ADN-[32P]ARN se aíslan mediante centrifugación en gradiente de densidad o membranas microporosas para medir su radiactividad. Los resultados experimentales son precisamente esto: demuestran que las bases de las plantillas de ARN y ADN son complementarias en un emparejamiento especial y también confirman el fenómeno de la transcripción inversa de ARN a ADN. Además, las contribuciones de la tecnología de rastreo de radioisótopos a la biología molecular incluyen: (1) estudiar las tres etapas consecutivas de la síntesis de proteínas, a saber, el inicio, el alargamiento y la terminación de la cadena peptídica (2) el aislamiento y la purificación de ácidos nucleicos (3); ) terminales de ácidos nucleicos Análisis de nucleótidos y determinación de secuencias; (4) La relación entre la estructura y función de los ácidos nucleicos. 5. (5) Investigación sobre cómo se transfiere la información genética del ARN a los aminoácidos de la proteína del huevo; nucleótidos, etc. Para aplicar mejor la tecnología de rastreo de radioisótopos, además de la alta calidad del trazador y la alta sensibilidad del detector nuclear, la clave reside en los supuestos científicos, el diseño experimental creativo y la aplicación integral de diversas tecnologías nuevas.