Describa brevemente métodos comunes para medir la función de las células T
Los métodos de detección inmunológica se pueden dividir en ensayos de inmunidad humoral y ensayos de inmunidad celular. 1． El inmunoensayo humoral utiliza principalmente la unión específica de antígenos y anticuerpos correspondientes in vitro, y reacciona con la participación de algunos cofactores, de modo que antígenos o anticuerpos conocidos pueden usarse para detectar anticuerpos o antígenos desconocidos. Además, también incluye la detección de diversas moléculas inmunes solubles en fluidos corporales, como complemento, inmunoglobulinas, complejos circulantes, lisozima, etc. 2． El inmunoensayo celular mide varias células inmunes y sus subpoblaciones en función de los marcadores únicos en la superficie de varias células inmunes (células T, células B, células K, células NK, macrófagos, etc.) y la cantidad y función de las citocinas. de las células se utilizan para ayudar a comprender el nivel de inmunidad celular del cuerpo. Método de inmunoensayo humoral 1. Reacción de aglutinación. Los antígenos particulados (bacterias o glóbulos rojos, etc.) se unen específicamente a los anticuerpos correspondientes y forman una aglutinación visible con la participación de electrolitos, lo que se denomina reacción de aglutinación. 1) Reacción de aglutinación directa. El fenómeno de aglutinación es causado por la combinación directa de antígenos granulares y los anticuerpos correspondientes. Los primeros son principalmente componentes estructurales de la superficie celular, como antígenos estructurales de superficie de bacterias o glóbulos rojos. ⑴ Método de diapositiva: se utiliza principalmente para la detección cualitativa de antígenos. ⑵ Método del tubo de ensayo: se utiliza principalmente para la detección cuantitativa de anticuerpos. 2) Reacción de aglutinación indirecta. La adsorción de antígenos solubles en la superficie de partículas portadoras (como partículas de látex, glóbulos rojos, etc.) se denomina partículas sensibilizantes. Cuando las partículas sensibilizantes se combinan con los anticuerpos correspondientes, se produce la aglutinación. Esta reacción se usa comúnmente para determinar anticuerpos bacterianos, anticuerpos virales, anticuerpos contra Leptospira y Treponema pallidum y ciertos autoanticuerpos (como anticuerpos antinucleares, anticuerpos antirrenales, anticuerpos antitiroideos, etc.). Según el principio de la reacción de aglutinación, también existen pruebas de inhibición de la aglutinación indirecta, pruebas de aglutinación indirecta inversa, pruebas de aglutinación sinérgica, etc. 2． reacción de precipitación. Los antígenos solubles (exotoxinas, suero, filtrado de cultivo bacteriano, lixiviado de tejido, etc.) se unen específicamente a los anticuerpos correspondientes y, con la participación de electrolitos, se forma un precipitado, que se denomina reacción de precipitación. Los antígenos en la reacción de precipitación son principalmente polisacáridos, lípidos, proteínas, etc. 1) Prueba de difusión unidireccional. Esta es una prueba cuantitativa de antígeno, que es una reacción de precipitación en la que el antígeno soluble se difunde en un medio de agar que contiene anticuerpos. Este método se utiliza a menudo para detectar los niveles de inmunoglobulinas séricas y componentes del complemento. 2) Prueba de difusión bidireccional. Se trata de una reacción de precipitación en la que antígenos y anticuerpos solubles se difunden entre sí en medios de agar. Este método se utiliza a menudo en pruebas cualitativas, como la detección de inmunoglobulinas séricas, alfafetoproteína, antígeno de superficie de la hepatitis B, etc. Tecnología de anticuerpos monoclonales 3) Inmunoelectroforesis a contracorriente. La electroforesis por convección es un método de detección rápido y sensible, que es una inmunodifusión bidireccional bajo la acción de un campo eléctrico. Este método se utiliza comúnmente para detectar el antígeno de superficie de la hepatitis B y la alfafetoproteína en suero. 3. Prueba de neutralización. Los anticuerpos específicos pueden inhibir la actividad de la sustancia antigénica correspondiente, y la reacción en la que el anticuerpo elimina la toxicidad o infectividad del antígeno correspondiente es una prueba de neutralización. Por ejemplo, las antitoxinas neutralizan la toxicidad de las exotoxinas y los anticuerpos neutralizantes contra los virus pueden hacer que los virus pierdan su infectividad. La prueba de toxina antiestreptocócica "O" para diagnosticar la fiebre reumática también es una prueba de neutralización. Los estreptococos hemolíticos tipo beta pueden producir una toxina hemolítica "O" que disuelve los glóbulos rojos humanos y de conejo. La toxicidad hemolítica de esta toxina puede neutralizarse mediante anticuerpos anti-toxina hemolítica "O" sin hemólisis. Durante la prueba, el suero del paciente se mezcla con la toxina hemolítica "O" y, después de un tiempo, se agregan glóbulos rojos humanos. Si los glóbulos rojos no se disuelven, es una reacción positiva, lo que indica la presencia de anti. -anticuerpos de la toxina hemolítica "O" en el suero del paciente. Cuando el título de anticuerpos séricos alcanza más de 400 unidades, indica que el paciente ha sido infectado con estreptococo hemolítico tipo B, lo que es útil para el diagnóstico de fiebre reumática. 4. Método de inmunofluorescencia (método de anticuerpos fluorescentes). Los tintes de fluoresceína (como el isotiocianato amarillo fluorescente, etc.) se utilizan para marcar anticuerpos sin afectar su actividad. Dichos anticuerpos se denominan anticuerpos fluorescentes. Utilice un tipo conocido de anticuerpo fluorescente para impregnar las células o secciones de tejido que contienen el antígeno que se va a analizar. Si hay un antígeno correspondiente, el antígeno se unirá específicamente al anticuerpo, formando un complejo que se adhiere a las células y es difícil de eluir. Se convierte en un objeto visible que emite fluorescencia bajo un microscopio de fluorescencia, que puede usarse con fines de diagnóstico o posicionamiento. Incluyendo método directo y método indirecto. 5. Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. El principio de este método es utilizar antígenos o anticuerpos marcados con enzima (comúnmente peroxidasa de rábano picante) para determinar si hay antígenos o anticuerpos correspondientes en la muestra que se está analizando. Hay tres tipos: método indirecto, método de doble anticuerpo y método de competición. 6. Prueba de placa hemolítica. 7. Técnica de transferencia Western.
La tecnología de inmunotransferencia o inmunotransferencia (inmunotransferencia o Westernblot) es una nueva tecnología inmunobioquímica desarrollada sobre la base de la transferencia Southern (Southernblotting) creada por la reacción del antígeno-anticuerpo Southern (1975). Método de detección de inmunidad celular La inmunología moderna ha adoptado ampliamente diversas tecnologías, como la biología celular, la serología inmune, el etiquetado inmunológico y la inmunohistoquímica. Ha desarrollado y mejorado continuamente una serie de tecnologías de detección inmune celular para detectar la superficie de varias células inmunes (incluidas. antígenos y receptores), activación celular, proliferación, fagocitosis, función asesina, actividad o contenido de diversas citocinas, etc. Estas tecnologías proporcionan medios útiles para el estudio y la comprensión en profundidad de los cambios fisiológicos y patológicos del sistema inmunológico del cuerpo, y para dilucidar la patogénesis y el diagnóstico clínico y el tratamiento de determinadas enfermedades. Con el rápido desarrollo de la inmunología celular, de vez en cuando aparecen nuevas tecnologías de detección de inmunidad celular. A principios de la década de 2000, los nuevos avances se centraron en la detección de citoquinas y receptores celulares. 1． Ensayo de transformación de linfocitos. Cuando los linfocitos humanos se incuban con antígenos específicos (como la tuberculina) o mitógenos no específicos (como la fitohemaglutinina, PHA) in vitro, las células T se activan y se transforman en linfoblastos. El proceso de transformación de las células T puede ir acompañado de una mayor síntesis de ADN, ARN y proteínas y, en última instancia, conduce a la división celular. El número de linfoblastos transformados se puede contar bajo un microscopio óptico. También se puede incorporar nucleósido de timidina marcado con tritio (3H-TdR) en los linfocitos en división, y se puede utilizar un medidor de centelleo líquido para determinar la cantidad de incorporación para identificar los linfocitos. tasa. En el año 2000, comenzó a aparecer un método de prueba para la respuesta de proliferación de linfocitos que no utilizaba isótopos y podía medirse con instrumentos, llamado prueba MTT. MTT es una sal de metazazol, que es el sustrato de la deshidrogenasa mitocondrial celular. La enzima de la célula puede descomponer el MTT para producir un componente azul-negro. La cantidad de este producto es directamente proporcional al número de células viables, y la densidad óptica se puede medir con un lector de microplacas (595 nm) como indicador del método MTT. 2． Método de guirnalda electrónica. Hay un receptor de células de oveja (CD2) en la superficie de las células T humanas que puede combinarse con los glóbulos rojos de oveja para formar una estructura de roseta. Es decir, la suspensión de células mononucleares periféricas separada del fluido de separación se mezcla con glóbulos rojos de oveja in vitro, se incuba a 37°C durante 5 a 10 minutos y luego se coloca a 4°C durante la noche. La suspensión de células se toma y se cuenta. Aproximadamente entre el 70 % y el 80 % de los linfocitos de sangre periférica son linfocitos que forman una roseta y son células T. Este método se puede utilizar para aislar células T. 3. Detección de subconjuntos de células T. 4. Prueba de citotoxicidad. Las células Tc, las células NK, las células LAK, las células TIL, etc. tienen efectos citotóxicos (destructores) directos sobre sus células diana. El método de detección comúnmente utilizado para la preparación de anticuerpos es el método de liberación de 51Cr (cromo). La solución salina 51Cr-Na2CrO4 y las células diana (diferentes células requieren diferentes células diana, como las células diana de las células NK son K562) se cultivan a 37°. C durante aproximadamente 1 hora, el 51Cr ingresa a las células objetivo y se combina con el citoplasma. Después de lavar el 51Cr libre, se pueden obtener las células objetivo marcadas con 51Cr. (La proporción es de aproximadamente 50:1 o 100:1), cuantas más células objetivo se matan, más 51Cr libre se libera en el sobrenadante y otras células ya no pueden absorberlo. Utilice un instrumento de medición de rayos gamma para detectar. el valor de cpm en el sobrenadante y puede calcular. Verifique el nivel de actividad de destrucción celular. La detección de citotoxicidad es de gran valor para la inmunidad tumoral. 5. Determinación de la función de fagocitosis de macrófagos. Coloque papel de filtro (de 1 cm2 de tamaño) impregnado con extracto etanólico de medicina tradicional china (10% cantáridas) sobre la piel flexora del antebrazo del sujeto y retire el papel de filtro después de 4 a 5 horas. En 48 horas, la piel puede desarrollar ampollas que contienen macrófagos. Se toman 0,5 ml de líquido de la ampolla y se añaden 0,01 ml de suspensión de glóbulos rojos de pollo. Después de 30 minutos a 37°C, se realiza un frotis, tinción y examen microscópico para determinar el porcentaje de fagocitosis y el número medio de glóbulos rojos de pollo fagocitados por cada macrófago. se calculan. Esta prueba es útil para observar el estado del tumor y el efecto terapéutico. 6. Prueba de inhibición del movimiento. Cuando los linfocitos sensibilizados vuelven a entrar en contacto con su antígeno específico, pueden producir el factor inhibidor de la migración (MIF). Este factor puede inhibir el movimiento de macrófagos y neutrófilos, localizarlos y potenciar su efecto inmunológico. Esta prueba se utiliza para observar si los linfocitos del sujeto producen MIF después de ser estimulados por antígenos específicos in vitro, a fin de medir la función de la respuesta inmune celular específica del cuerpo a un determinado antígeno. 7. Tecnología de medición de fluorescencia resuelta en el tiempo.
La tecnología de medición de fluorescencia resuelta en el tiempo (fluorometría resuelta en el tiempo, TrF) es una nueva tecnología de análisis no radiactivo de ultratrazas. La sensibilidad y especificidad de esta tecnología son similares a las de la tecnología de medición de radionúclidos, pero no tiene las desventajas de la medición radiactiva. Por lo tanto, aunque existe desde hace poco tiempo, se ha desarrollado extremadamente rápido y tiene el potencial de hacerlo. reemplazar la medición radiactiva. 8. Tecnología de detección de citoquinas. La detección de citoquinas se ha utilizado ampliamente en la MTC clínica y de laboratorio desde 2005. 9． Detección de receptores celulares. El receptor es uno de los marcadores de la superficie celular. Al detectar el receptor, podemos comprender la función de la célula y proporcionar cierta base teórica para la patogénesis de determinadas enfermedades.