Descripción general de las glicosiltransferasas
Palabras clave antibiótico glicosiltransferasa; antibióticos glucósidos; glicosilación
Los glucósidos antibióticos se utilizan principalmente en clínica con fines antibacterianos y antitumorales. Se han encontrado muchos genes que codifican glicosiltransferasas en el grupo de genes biosintéticos de antibióticos [1], pero la especificidad y el mecanismo catalítico de las glicosiltransferasas de antibióticos (Gtfs) no se comprenden bien. La combinación de grupos de azúcares con diferentes ligandos puede aumentar en gran medida la diversidad estructural de los productos naturales. Funcionalmente, estos componentes del azúcar suelen estar involucrados en el reconocimiento molecular por parte de las células diana y afectan la actividad biológica de los compuestos [2]. En la actualidad, con el uso generalizado de antibióticos, las bacterias resistentes a los medicamentos también aumentan año tras año y existe una necesidad urgente de encontrar nuevos antibióticos para competir con ellas. Aumentar los tipos de antibióticos y cambiar su actividad mediante la glicosilación es un enfoque prometedor. Al explorar el mecanismo de producción de los antibióticos glucósidos y las propiedades catalíticas de las glicosiltransferasas, se espera sentar las bases para el descubrimiento y la transformación de nuevos antibióticos activos.
1 Antibióticos glucósidos
Muchos antibióticos glucósidos sufren una glicosilación estereoespecífica y regioselectiva durante la biosíntesis. En esta reacción biológica, las glicosiltransferasas catalizan la unión de grupos de azúcares en su estructura a ligandos en forma de monosacáridos, disacáridos y cadenas de oligosacáridos para formar C? ,¿NORTE? ¿Y oh? Glucósidos (Figura 1). La glicosilación suele ser el último paso en el paso posterior a la modificación en la vía biosintética de los antibióticos glucósidos. Por ejemplo, las cadenas de azúcar de vancomicina y teicoplanina se introducen al final de la biosíntesis [3]. Figura 1C? ,¿NORTE? ¿Y O? Antibióticos glucósidos
Los antibióticos glucósidos tienen dos mecanismos de acción principales. Una es inhibir la síntesis de peptidoglicano por bacterias Gram positivas, como ramop? lanina)[4]; el otro tipo inhibe la actividad de la ADN girasa, como la novobiocina[5].
2. El papel principal de la glicosilación en los antibióticos glucósidos.
El papel y la importancia de la glicosilación se reflejan principalmente en los siguientes tres aspectos: Primero, aumenta la solubilidad en agua del compuesto. La combinación de derivados de hexosa con la aglicona del antibiótico aumenta la hidrofilicidad del antibiótico, lo que resulta beneficioso para la eficacia del fármaco. Los ejemplos típicos incluyen N? Acetilglucosamina (n? Acetil? Glucosamina, GlcNAc) y la cadena de manosa en la columna vertebral de la remoplanina, en segundo lugar, es beneficiosa para la secreción. ¿La manosiltransferasa A40926 en la vía biosintética reconoce específicamente los grupos manosilo? ¿PÁGINAS? Como donante de azúcar, el C55 promueve la secreción de antibióticos glicosilados [6]. En tercer lugar, la glicosilación es un mecanismo de autoprotección de las bacterias productoras. Durante la producción de ácido oleanólico, la glicosiltransferasa OleD glicosila el antibiótico intermedio, provocando su inactivación temporal en la célula. Una vez secretado el antibiótico, la glicosidasa lo hidroliza para eliminar el grupo de azúcar y restaurar la actividad [7]. Este mecanismo es común en los antibióticos macrólidos y la enzima con función similar es MgtA [8].
3-Glicosiltransferasa
La glicosiltransferasa cataliza la activación del azúcar y conecta diferentes moléculas receptoras en el organismo, como proteínas, ácidos nucleicos, oligosacáridos, lípidos y pequeñas moléculas. Los productos de glicosilación tienen una variedad de funciones biológicas. Entre las diferentes familias de Gtfs hay una clase de Gtfs relacionada con la biosíntesis de antibióticos. Su función es glicosilar los antibióticos en la última etapa de la biosíntesis y regular la actividad de los antibióticos cambiando la posición, el tipo y la cantidad de azúcares.
Gracias a la investigación en profundidad sobre los grupos de genes biosintéticos de antibióticos, se han aislado a partir de actinomicetos más de 100 genes de glicosiltransferasa relacionados con la biosíntesis de antibióticos. El análisis de secuencia mostró que las proteínas codificadas por estos genes pertenecen a la familia de las glicosiltransferasas. La mayoría de los genes de glicosiltransferasa son ricos en glicina (¿ricos en glicina), que también está presente en la UDP? Glicosil y UDP glucuronosiltransferasas. Seleccione las 119 secuencias representativas de glicosiltransferasa registradas en GenBank y utilice el método vecino más cercano para construir un árbol filogenético (Figura 2-2).
El análisis del árbol filogenético muestra que la relación genética entre los genes de la glicosiltransferasa no puede inferir con precisión sus funciones biológicas [9]. Por ejemplo, EryCⅲⅲ y megcⅲ tienen un 83,4% de identidad a nivel de aminoácidos y pueden reconocer el mismo ligando. UrdGT1b y UrdGT1c muestran una alta homología (91% de aminoácidos idénticos, con solo unos pocos aminoácidos diferentes en la región de 31 aminoácidos), pero transportan diferentes azúcares hexosas. UrdGT1c a L? Azúcar de adelfa (l?Rodinosa), UrdGT1b a d? Azúcar de oliva (d?olivose)[10]. ¿C-C? n y c? No existe una diferencia obvia en la secuencia genética y el nivel de aminoácidos entre las glicosiltransferasas formadas por enlaces glicosídicos, como Asm25 (cataliza C? Gtfs) [9 está formada por N glucósido] [9, 11], UrdGT2 (cataliza C? está formado por glucósido C) GTFS) [12], GtfB (cataliza C? GTFS formado a partir de glucósidos O) [13].
Durante el proceso de posmodificación de vancomicina, ¿cuál es el papel de la glicosiltransferasa GtfB en la conversión de UDP? El grupo glucosa de la glucosa se transfiere a la columna vertebral de la vancomicina. El estudio de su estructura cristalina mostró que la enzima tiene dos dominios, con un surco en la región media que posiblemente contenga UDP. Región de unión a glucosa [13]. La determinación estructural de las glicosiltransferasas proporcionará información sobre su especificidad catalítica.
Dos características distintivas de Gtfs son: primero, funciona al final de la biosíntesis de antibióticos, lo que permite su uso flexible en biosíntesis combinatoria, y la elucidación de la especificidad de su estructura de sustrato puede proporcionar ideas para el descubrimiento. la base para nuevos compuestos estructurales y funcionales. En la reacción de glicosilación catalizada por Gtfs, el C1 de la hexosa se activa mediante la desfosforilación del nucleósido trifosfato, capturando así el sustrato de azúcar en la posición C1 electrófila y luego uniéndose al grupo hidroxilo del ligando glucósido mediante ataque nucleofílico. En segundo lugar, la mayoría de las glicosiltransferasas pueden catalizar la activación de azúcares hexosas y combinarse con el grupo hidroxilo de sustratos glucósidos para formar C? o glucósidos, con raras excepciones, como la vía C? n y c? Un compuesto unido por un enlace de carbono al glucósido. El N-glucósido de amnesia se aisló del caldo de fermentación de amnesia cultivado en placas YMG. El grupo azúcar en su estructura está conectado al esqueleto del ligando del glucósido a través del N en el enlace amida [11]. En la biosíntesis de uldamicina, puede ser que el átomo de C nucleofílico y el grupo hidroxilo fenólico estén en la posición orto, lo que da como resultado C? La formación del enlace glicosídico C [12], pero cataliza C? n y c? La especificidad de las glicosiltransferasas formadas a partir de C no se ha estudiado en profundidad.
3.1 Investigación de aplicaciones de Gtfs
(1) La investigación in vivo sobre Gtfs se lleva a cabo principalmente mediante métodos genéticos. Un enfoque consiste en reemplazar el TDP de la propia bacteria huésped con un gen mediado por un plásmido. El gen de la desoxihexosa sintasa y los mutantes seleccionados sirven como fábricas celulares para transformar antibióticos. Estos estudios incluyen la ingeniería de la vía de la pirarubicina [15] en el segmento 4′? Antibióticos anisotrópicos glicosilados y antraciclinas con diferentes unidades de azúcar [16, 17].
Otro enfoque es expresar ectópicamente Gtfs en un huésped diferente; ejemplos de esto incluyen expresar el gen oleGII en el huésped Staphylococcus erythraea para producir 3? oh? ¿Rhamnosilo? 6?DEB, la expresión del gen tylM2 produce 5? oh? Deoxiaminocaprolactona [18].
Los estudios han demostrado que Gtfs tiene adaptabilidad de sustrato a diferentes moléculas de azúcar. El grupo de investigación de Salas creó un sistema de expresión * * * y expresó con éxito el casete del gen de síntesis de glicosilo, derivado biológicamente. gen de la glicosiltransferasa elMGT del grupo de genes sintéticos [19]. Aunque se ha demostrado que muchos sustratos de glicosiltransferasas son de amplio espectro, todavía hay muchos informes bibliográficos sobre la existencia de genes de glicosiltransferasas específicos, por ejemplo, UrdGT2 en C. cyanogenus [20] y S. spheroidal CIMB NOVM [211891]. No hay duda de que con el descubrimiento de más genes que codifican Gtfs y la investigación en profundidad sobre el mecanismo de acción, también aumentarán las estrategias y métodos de modificación por glicosilación de antibióticos en los organismos. Por lo tanto, se pueden establecer nuevas fábricas microbianas para producir productos naturales con diferentes modificaciones de glicosilación, como la expresión de policétidos glicosilados (PK), péptidos no ribosómicos (NRP) y antibióticos híbridos PK/NRP, detectando así nuevos compuestos activos.
(2) Estudios in vitro de Gtfs Los estudios in vitro de Gtfs se basan en Gtfs activos, diversos ligandos de glucósidos y donantes de glicosilo.
Dado que el contenido de antibiótico glicosiltransferasa es muy bajo en el cuerpo y la operación de expresión heteróloga es relativamente simple, los investigadores a menudo la obtienen mediante expresión heteróloga en microorganismos como Escherichia coli o Streptomyces lividans [22]. Ha habido varios ejemplos exitosos, por ejemplo, NovM se descubrió y clonó por primera vez en Saccharomyces cocculiformis y se expresó y purificó en forma activa en Escherichia coli [21]. ¿El TDP se produce por síntesis química y catálisis enzimática biológica? ¿d? La glucosa es posible [23]. En comparación, las agliconas son las más fáciles de obtener y su producción puede controlarse mediante la degradación del antibiótico original. Por ejemplo, las agliconas correspondientes se pueden obtener fácilmente a partir de vancomicina y teicoplanina respectivamente, y el neosacárido se puede obtener a partir de la reacción catalizada por ácido de neomicina. Además, se pueden obtener diferentes ligandos mediante síntesis total o modificación parcial. Como la síntesis química de daunorrubicina, eritromicina (eritromicina) y derivados de bleomicina [23 ~ 25].
Aplicación de las glicosiltransferasas en la biosíntesis combinatoria
La producción de nuevos policétidos y compuestos peptídicos mediante métodos genéticos ha atraído cada vez más atención. Superficialmente, la biosíntesis recombinante de compuestos glicosilados es tan compleja como los policétidos y los péptidos, pero en comparación con la complejidad de los policétidos y las péptidos sintetasas, las enzimas que catalizan la generación de desoxiazúcar y sus mecanismos de reacción son conservadores, por lo que la síntesis recombinante de compuestos glicosilados es más práctico [25].
El grupo de investigación de Salas en España estableció con éxito un sistema de expresión y clonación de genes para producir desoxiazúcar activo. El gen diana se encuentra aguas abajo del operón y puede expresarse en Streptomyces bajo el control del promotor. Integrar el gen de la glicosiltransferasa oleGII en Streptomyces albicans e introducirlo en L? La adelfa (l? oleanol), la eritromicina lactona B (eritritolida B) y el gen de la glicosiltransferasa elmGT se integraron en el biosintético L? El plásmido olivoso pOLV puede producir con éxito tetraciclina C) [26, 27].
Los compuestos de estaurosporina están compuestos por una molécula de azúcar y una unidad de indol heterocíclico y son difíciles de obtener mediante métodos químicos. Se han aislado y caracterizado aproximadamente 30 derivados de estaurosporina expresando rebecamicina y otros genes biosintéticos de estaurosporina en organismos [28]. Es difícil alterar la especificidad de Gtfs utilizando enfoques genéticos. El grupo de investigación de Salas reemplazó con éxito el grupo de azúcares naturalmente unido al grupo indocazol mediante la expresión del casete del gen biosintético glicosil, el gen Gtfs (staN y staG) y el gen biosintético de la estaurosporina para recombinar la glicosiltransferasa. La aplicación en la biosíntesis sentó las bases y demostró que es recombinante. La biosíntesis es más propicia para la producción de nuevos productos de glicosilación que la química medicinal [16].
4.1 Utilizar bacterias de producción como fábricas de células.
Como fábricas de células se utilizan microorganismos que producen compuestos glucósidos. Los mutantes se generan insertando marcadores de resistencia a los antibióticos o eliminando parte del gen en la región codificante del gen, introduciendo genes de glicosiltransferasa exógenos y utilizando moléculas de azúcar activadas en células e intermediarios del metabolismo secundario microbiano para sintetizar nuevos antibióticos. Este método se ha utilizado para muchas cepas de producción, como eritromicina [29], micomicina, uldamicina, etoximicina [29] y picromicina. micina) se aplicó [30].
Otra estrategia para promover la unión de diferentes unidades de azúcar a ligandos es expresar Gtfs de forma heteróloga en organismos que producen compuestos bioactivos similares, con el huésped actuando como una fábrica celular para proporcionar una fuente de azúcar activada por nucleósidos. El esqueleto del ligando puede ser sintetizado por el huésped, o puede sintetizarse controlando los genes cromosómicos y los genes exógenos del huésped, o puede alimentarse con compuestos. Se formó un nuevo derivado glicosil A47934 expresando el gen gtrE de la cepa productora de vancomicina Aspergillus orientalis en especies de Streptomyces [17]. No produce polipéptido glicosil A47934.
Gtfs transporta diferentes azúcares a átomos de C específicos de la columna vertebral del ligando, y tiene más sentido cambiar la posición del azúcar en la columna vertebral mediante ingeniería genética. Esta idea ha dado como resultado fármacos antineoplásicos híbridos de uritromicina y puromicina [30].
4.2 Utilizar bacterias no productivas como fábricas de células
En el experimento de transformación de cepas recombinantes, dado que el huésped no produce un esqueleto de ligando, es necesario biosintetizar un esqueleto de ligando. Plásmidos genéticos se integran en el huésped o los ligandos se añaden al medio de cultivo y se modifican mediante biotransformación. Las moléculas de azúcar se obtienen mediante la transferencia de uno o más plásmidos que contienen los genes necesarios.
Ahora se han desarrollado como herramientas importantes algunos plásmidos que pueden sintetizar diferentes azúcares desoxihexosas [31].
Perspectivas de la investigación de la 5-glicosiltransferasa
Recientemente se han obtenido cristales de Gtfs en el sistema biosintético de glicopéptidos. La determinación estructural muestra que este tipo de familia Gtfs tiene dos dominios idénticos. ¿PND? ¿Azúcar y c combinados? terminalmente, el ligando glicosídico se une a n? Fin (AGV/GtfB, DVV/GtfA)[13]. Esta estructura de doble división está conectada solo por dos péptidos, lo que sugiere que es posible mezclar y combinar sus respectivos dominios [32, 33]. Por lo tanto, la mezcla de ADN o la evolución dirigida de enzimas relacionadas pueden construir Gtfs aparentemente absurdos, cambiar su especificidad de sustrato para unidades de hexosa y ligandos, aumentar en gran medida la diversidad estructural de los glucósidos y sentar las bases para la detección de nuevos glucósidos activos.
En resumen, existen tres requisitos para estudiar la diversidad de patrones de glicosilación en la biosíntesis.
(1) Establecimiento de una biblioteca de glicosiltransferasas Para producir nuevos glucósidos antibióticos mediante biosíntesis recombinante, es necesario establecer una biblioteca de genes de glicosiltransferasas para una aplicación industrial en profundidad. A medida que se secuencian más grupos de genes, el número de GTF aumentará año tras año y habrá N? ¿O c? La región terminal Gtfs se utiliza para construir un sistema catalítico híbrido, que puede cambiar el reconocimiento de ligandos y desoxiazúcar y encontrar nuevos sitios de unión para desoxiazúcar específicos [34].
(2) Establecer una biblioteca de compuestos de ligandos. Estos compuestos incluyen estructuras simples de aminocumarina, péptidos no ribosómicos (NRP) y ligandos de policétidos aromáticos [25]. Pero, ¿C? ¿Carolina del Norte? La glicosilación requiere más estudios.
(3) La compleja biblioteca de donantes de azúcar debe incluir muchos azúcares activados UDP o TDP y desoxiazúcares. Una vez que el desoxiazúcar natural se une al ligando, le da nueva actividad. La carbamilación del desoxiazúcar existe en muchas clases de compuestos como policétidos (neomicina), péptidos no ribosómicos (como la teicoplanina) y otros antibióticos, entonces, ¿todos los TDP? ¿d? ¿Y qué pasa con el TDP? ¿yo? Los derivados de desoxihexosa son dignos de preparación en bibliotecas [32, 33].