¿Cuáles son los métodos de extracción de proteínas vegetales más utilizados actualmente?
1. Método de extracción de proteína de tejido vegetal
1. Según el peso de la muestra (1 g de muestra, agregue 3,5 ml de solución de extracción, que se puede agregar adecuadamente según los diferentes materiales). ), preparar y extraer sobre hielo líquido.
2. Colocar la muestra en un mortero y triturarla con nitrógeno líquido. Después de triturarla, añadirla a la solución de extracción y dejar reposar en hielo (3-4 horas).
3. Centrifugar a 8000rpm40min4℃ o 11100rpm20min4℃
4. Extraer el sobrenadante y completar la preparación de la muestra.
Solución de extracción de proteínas: 300ml
1. 1Mtris-HCl (PH8) 45ml
2. Glicerol (Glicerol) 75ml
3 , Polivinilpolipirrolidona (Polivinilpolipirrolidona) 6g
¡Este método es para SDS-PAGE y electroforesis en placa vertical!
2. Método de extracción de proteína de tejido vegetal
Método de precipitación con ácido cloroacético-acetona
1. Triturar las hojas en nitrógeno líquido
2 Añadir 3 veces el volumen de muestra y extraer durante la noche a -20°C, luego centrifugar (8000 rpm por encima de 4°C durante 1 hora) y desechar el sobrenadante.
3. Añadir un volumen igual de acetona en un baño de hielo (que contenga 0,07% de β-mercaptoetanol), agitar bien y luego centrifugar (a 4°C y 8000 rpm durante más de 1 hora) y luego aspirar. secar el precipitado para su uso posterior.
4. Agregue la solución de lisis antes del muestreo y déjela a temperatura ambiente durante 30 minutos para disolver completamente la proteína en la solución de lisis, luego centrifugue (15 °C y 8000 rpm durante más de 1 hora, sin precipitación). como estándar), y se puede conservar temporalmente. Reservar a 4°C.
5. Cuantifique utilizando el método Brandford y luego haga alícuotas a -80 ℃ para su uso posterior.
Fármaco: Solución de extracción: acetona, que contiene un 10% de ácido tricloroacético y un 0,07% de β-mercaptoetanol. Solución de lisis: disuelva 2,7 g de urea y 0,2 g de CHAPS en 3 ml de agua desionizada estéril (el volumen final es de 5 ml), luego agregue 65 ul/ml de DTT 1 M antes de usar.
¡Este método es adecuado para electroforesis bidimensional, con menos impurezas y menor concentración de iones! Por supuesto, también es aplicable la electroforesis unidimensional, ¡pero las bandas de electroforesis se reducirán!
3. Tejido: mucosa intestinal
Finalidad: WESTERN BLOT detecta la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis
Pasos para la extracción de proteínas mediante TRIPURE:
Añadir alcohol isopropílico al sobrenadante que contiene proteínas: (Añadir 1,5ml de TRIPURE por 1ml)
Invertir para mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 10 minutos
Centrífuga: 12000 g , 10 minutos 4 grados centígrados, descartar el sobrenadante
Añadir clorhidrato de guanidina 0,3 M/etanol 95%: (2 ml por 1 ml de TRIPURE)
Agitar bien y dejar en ambiente. temperatura durante 20 minutos
Centrifugar: 7500 g, 5 minutos, 4 grados Celsius, desechar el sobrenadante
Repetir el paso de clorhidrato de guanidina 0,3 M/etanol al 95 % 2 veces
Añadir etanol 100% a los 2 ml de precipitación
Agitar bien y dejar reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos
Centrifugar: 7500g, 5 minutos, 4 grados centígrados, descartar el sobrenadante y secar el precipitado con secador
1 Disolver el pellet con % SDS
Centrífuga: 10.000g, 10 minutos, 4 grados Celsius
Centrífuga: 10.000g, 10 minutos, 4 grados centígrados
Disolver el pellet con SDS al 1%.
Coger el sobrenadante y almacenarlo a -20 grados (también se puede utilizar directamente en WESTERN BLOT)
Problema: Después de añadir SDS al 1%, el precipitado no se disuelve y se todavía es un trozo grande, 4 Después de la centrifugación, hay mucho precipitado blanco. ¿Está cristalizada la SDS? Se midió la concentración y el contenido fue sólo de aproximadamente 1 mg/ml.
Solución: Kit de extracción de proteínas, además del tamaño de tejido adecuado, añadir 2X BUFFER inmediatamente después de triturar, y cocinar durante 5-10 minutos, el efecto es muy bueno.
4. Materiales vegetales: plántulas de arroz, vainas de hojas, raíces
1. Tomar 200 mg de muestra y triturarla en hielo
2. Añadir tampón de lisis y centrifugar. , 10000 rpm, 4 grados, tomar el sobrenadante durante 5 minutos
3. Repetir la centrifugación durante 5 minutos
Tampón de lisis: urea np -40 anfolina 2-me pvp-40 p>
5. Preparación de muestras de proteínas Preparación de muestras de proteínas
Extraer muestras de proteínas de plántulas según el método de Davermal et al (1986).
Cortar 100 mg de material en trozos, añadir 10 mg de PVP-40 (polivinilpirrolidona) y una pequeña cantidad de arena de cuarzo, molerlo hasta convertirlo en polvo con nitrógeno líquido, y después añadir 1,5 ml de tricloroacético al 10%. ácido (preparación de acetona, que contiene 10 mmol, es decir: 0,07% de β-mera) y 0,07% de β-mera-1 (polivinilpirrolidona), añadiendo 1,5 ml de ácido tricloroacético al 10% (preparación de acetona, que contiene 10 mmol, es decir, 0,07 % de etanol del grupo β-mercapto), agitar, precipitar a -20°C durante 1 hora, centrifugar a 15000 rpm durante 15 minutos a 4°C, descartar el sobrenadante. Redisolver el precipitado en 1,5 ml de acetona fría (que contiene β-mercaptoetanol 10 mM), luego precipitar a -20°C durante 1 hora, centrifugar como se indicó anteriormente, desechar el sobrenadante (el 80% de la solución obtenida mediante congelación criogénica y secado al vacío debe Se utilizó acetona (que contiene precipitados de β-mercaptoetanol 10 mM).
Añadir 20 μl (ajustable) de solución UKS [9,5 M de urea, 5 mM de carbonato de potasio, 1,25 % de SDS, 0,5 % de DTT (ditiotreitol), 2 % de anfolina (Amersham) por mg de polvo seco Pharmacia Biotech Inc. , pH 3,5-10), 6% Tritón X-100]. La solución debe incubarse a 37°C durante 30 minutos, agitarse varias veces durante el período de incubación y luego centrifugarse a 16000 r/min durante 15 minutos a 28°C (una temperatura baja y una concentración alta de urea harán que la solución se congele). ¡Cuanto mayor sea la fuerza centrífuga, mayor será el tiempo, mejor! Se puede tomar una muestra del sobrenadante para electroforesis. O almacenar a menos 70 grados
6. Extracción de proteínas de las raíces de las plantas
(1) Muestreo y molienda con nitrógeno líquido
(2) Carga de 1,5 ml tubo de centrífuga
(3) Añadir 1M KH2PO4 K2HPO4 700 ul
(4) 12000 rpm, 4 grados, 10-15 min
(4) 12000 rpm, 4 grados, 10-15 minutos
(5) 1. , 10-15 minutos
(5) Tome el líquido superior, con la proteína que contiene
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