Describa brevemente los pasos de la hibridación in situ.
La hibridación in situ consiste en utilizar sondas de ácido nucleico para combinarlas específicamente con ácidos nucleicos en tejidos o células según el principio de emparejamiento de bases para formar híbridos, y luego utilizar métodos de histoquímica o inmunoquímica para realizar la localización intracelular bajo un microscopio. o tecnología de detección de expresión genética. Los pasos operativos son los siguientes:
(1) Limpieza y procesamiento de portaobjetos La limpieza de portaobjetos es muy importante, especialmente sin contaminación por nucleasas. Para evitar que el tejido o las células se caigan del portaobjetos durante los pasos posteriores de hibridación y lavado, el portaobjetos se puede recubrir con polilisina.
(2) Fijación de tejidos y células Las células o tejidos para la hibridación in situ deben fijarse, a menudo utilizando paraformaldehído al 4%
(3) Detección de sonda El diseño y método de la aguja se determinan basándose en la secuencia de nucleótidos que se está determinando. Al mismo tiempo, para penetrar la sonda, las sondas utilizadas para la hibridación in situ de células y tejidos son relativamente cortas, mientras que para la hibridación in situ de cromosomas celulares, a menudo se utilizan sondas más largas para mejorar la señal de hibridación.
(4) En la hibridación in situ en caja húmeda, se utiliza menos solución de hibridación para cada muestra para evitar que el líquido del sistema de hibridación se evapore y provoque que la solución de hibridación se concentre o incluso se seque. se debe utilizar una caja húmeda.
(5) Pretratamiento de la hibridación del tejido celular La hibridación in situ sigue los principios generales de la hibridación de ácidos nucleicos, pero la diferencia es que los ácidos nucleicos en los tejidos y las células se combinan con proteínas intracelulares, y los ácidos nucleicos El complejo ácido-proteína es El efecto de reticulación del fijador durante el proceso de fijación hace que las biomoléculas formen una rejilla, lo que afecta la penetración de la sonda y dificulta la formación de híbridos. Por lo tanto, se deben utilizar detergentes y/o proteasas parcialmente. digerir tejidos y células para eliminar proteínas en la superficie de los ácidos nucleicos para maximizar la penetración de la sonda.