Introducción a la actividad de la telomerasa
2 Referencia en inglés Actividad de la telomerasa
Descripción general Los telómeros son una estructura especial al final de los cromosomas eucariotas, que son ricos en guanina y sus proteínas relacionadas. formado por secuencias repetitivas de ADN. Los telómeros son estructuras importantes que protegen la estabilidad de los extremos de los cromosomas. Se requiere actividad telomerasa para mantener la longitud de los telómeros. Las células inmortales y las células tumorales pueden sobrevivir durante mucho tiempo y la telomerasa juega un papel importante. La telomerasa es un complejo compuesto de ARN y proteoma y pertenece a una transcriptasa inversa dependiente de ARN específica. Puede utilizar su propio ARN como plantilla para sintetizar ADN telomérico en los extremos de los cromosomas desde cero, compensando la pérdida de ADN telomérico durante la división celular, manteniendo la longitud de los telómeros, manteniendo el equilibrio dinámico de los cromosomas y haciendo que las células sean inmortales. . La telomerasa ha atraído una amplia atención desde que Kim estableció un método basado en PCR altamente sensible para detectar la telomerasa en 1994. Los estudios han encontrado que la telomerasa está estrechamente relacionada con la proliferación, diferenciación e inmortalidad celular, y se ha convertido en uno de los puntos calientes en la investigación básica sobre tumores y envejecimiento.
Prueba médica de actividad telomerasa 4.1 Nombre de la prueba Actividad telomerasa
4.2 Clasificación prueba serológica>: Inmunoensayo tumoral
4.3 Actividad telomerasa Principio de determinación Tecnología de reacción en cadena de la polimerasa: Cadena de polimerasa La reacción es una reacción cíclica in vitro que consta de tres pasos básicos. El primer paso de la desnaturalización: calentar todos los fragmentos de genes amplificados para romper los enlaces de hidrógeno entre las dobles hebras y descomponerse en dos hebras de nucleótidos simples. El segundo paso de la hibridación: cuando la temperatura baja, los oligonucleótidos sintetizados químicamente. Los cebadores ácidos coincidirán con el ADN; en ambos lados del gen a amplificar; el tercer paso de extensión: en presencia de un tampón apropiado, es decir, iones de magnesio y cuatro desoxinucleótidos, la ADN polimerasa puede basarse fielmente en el molde. La secuencia sintetiza una hebra complementaria y se extiende; desde el extremo 3' del cebador en la dirección 5' → 3', sintetizando así 2 moléculas del fragmento del gen con la misma estructura que el original. Estos tres pasos forman un ciclo y el número de moléculas de ADN en cada ciclo aumenta exponencialmente.
4.4 Reactivos Las condiciones básicas para la reacción en cadena de la polimerasa incluyen genoma de ADN o ARN purificado, nucleótidos individuales utilizados para sintetizar ADN, cebador oligonucleotídico de ADN polimerasa, varios tampones, capacidades de cambios rápidos de temperatura y sistemas de detección especiales.
(2) Extracción y purificación de ADN/ARN: Igual que la extracción y purificación de ADN/ARN en la tecnología de sonda de ácido nucleico de esta sección.
(2) Selección del cebador: primero, es necesario conocer las secuencias de ADN en ambos lados del fragmento del gen que se va a amplificar y luego utilizar la síntesis química para sintetizar un par de oligonucleótidos complementarios a las secuencias de ADN en Ambos lados como cebadores, la longitud es generalmente de 20 a 30 nucleótidos. Se debe prestar atención a los siguientes puntos al seleccionar los cebadores: ① Su secuencia es específica del gen que se va a amplificar; 2 bases están distribuidas aleatoriamente para evitar la acumulación de purinas o pirimidinas ③ No formarán estructuras secundarias por sí solas; Un par de cebadores no pueden complementarse entre sí por sí solos.
(3)ADN polimerasa: utilice TaqDNA polimerasa, que es resistente a altas temperaturas y tiene un alto rendimiento. La longitud de amplificación puede alcanzar más de 10 kb y la enzima se puede agregar una vez para realizar un ciclo continuo.
4.5 Método de operación: el ADN genómico es de 0,1 μg; el tampón contiene 50 mmol/L de cloruro de potasio, 10 mmol/L de TrisHCl (pH 8,4), 1,5 mmol/L de cloruro de magnesio y 100 μg de gelatina cada uno; el cebador es de 0,25 μm ol/l; DATP, dCTP, dGTP y dTIP son cada uno de 200 μm ol/l; la ADN polimerasa es de 2,5 U y el volumen final es de 100 μl. Agregue unas gotas de parafina líquida para evitar la evaporación.
Ciclo de reacción: ① Desnaturalización: 90 ℃ durante 30 ~ 60 s; ② Temperatura de recocido del imprimador y plantilla: 40 ~ 60 ℃, 30 ~ 60 s ③ Extensión: 72 ℃ durante 1 ~ 2 minutos. Después de ciclos repetidos de 30 a 40 veces, los cebadores finalmente se extendieron a 72°C durante 7 minutos, una vez. Una vez eliminada la parafina líquida, se puede analizar el producto. Después de la electroforesis en gel de agarosa, se tiñó con bromuro de etidio y se irradió con luz ultravioleta para revelar la banda fluorescente de la longitud de amplificación esperada.
El producto también se puede hibridar mediante Southern o transferencia puntual con sondas oligonucleotídicas marcadas radiactivamente o no marcadas radiactivamente. Es más conveniente utilizar una máquina automática de PCR. Después de agregar los reactivos de reacción, la plantilla de ADN y la ADN polimerasa Taq en el tubo de ensayo, colóquelo en el instrumento automatizado con el programa ajustado, es decir, desnaturalización → recocido → extienda la temperatura, el tiempo y el ciclo respectivos, y luego reaccione para obtener un resultado satisfactorio. producto de amplificación.
4.6 El valor normal es negativo.
4.7 Importancia clínica de los resultados de la prueba (1) La tasa positiva de telomerasa en pacientes con cáncer de hígado es alta (85%), y el nivel de AFP de los pacientes con actividad de telomerasa positiva es significativamente mayor que el de los pacientes con actividad telomerasa negativa. La actividad de la telomerasa no estuvo relacionada con el tamaño del tumor, el grado histológico ni la metástasis del tumor. La telomerasa puede ser un marcador tumoral para el diagnóstico de cáncer de hígado.
(2) La telomerasa se expresa altamente en la mayoría de los tejidos tumorales malignos, como el neuroblastoma (94 %), el cáncer de mama (93 %), el cáncer colorrectal (93 %), el cáncer gástrico (85 %), el cáncer de próstata. cáncer (84%), cáncer de pulmón (80%), etc. La actividad de la telomerasa está estrechamente relacionada con el estadio clínico y el pronóstico de los tumores. Por tanto, la telomerasa es actualmente el marcador tumoral más específico y versátil.
(3) La actividad de la telomerasa puede ser débil en algunas lesiones benignas (como hepatitis, cirrosis, meningiomas benignos, etc.). ).
4.8 Tenga en cuenta que en los últimos años, la "hipótesis de los telómeros y la telomerasa" ha sido confirmada por cada vez más estudios, y los niveles de actividad de la telomerasa se han utilizado como biomarcadores e indicadores de pronóstico para el diagnóstico de tumores.
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