Hacer preparaciones patológicas
(1) Materiales frescos: Cuanto más frescas sean las toallas de papel, mejor. Generalmente, los tejidos humanos se fijan rápidamente después de la separación y los tejidos animales se matan para asegurar la estructura morfológica original.
(2) Tamaño del bloque de tejido: el volumen ideal del bloque de tejido es de 2,0 cm × 2,0 cm × 0,3 cm, para que el fijador pueda penetrar en el tejido de forma rápida y uniforme. Sin embargo, el volumen ideal de bloques de tejido varía según los diferentes materiales y propósitos de producción. Por ejemplo, en las secciones de examen externo patológico y de investigación científica, el bloque de tejido se puede adelgazar a 0,1 ~ 0,2 cm, lo que puede acortar la transparencia de la deshidratación fija.
(3) No apriete el bloque de tejido: los cuchillos y tijeras utilizados para cortar el bloque de tejido deben estar afilados y no se permite limar hacia adelante y hacia atrás durante el corte. No sujete el tejido con demasiada fuerza para evitar la deformación del tejido y las células debido a la compresión.
(4) Estandarizar la ubicación de muestreo: las muestras deben recolectarse con precisión de acuerdo con la ubicación anatómica. Las muestras patológicas deben recolectarse de acuerdo con diferentes ubicaciones y propiedades patológicas, y estandarizarse según sea necesario.
(5) Seleccionar cortes de bloques de tejido: Determine la dirección de los cortes según la estructura del tejido de cada órgano. Las secciones longitudinales o transversales suelen ser la clave para mostrar la morfología y estructura del tejido. Por ejemplo, las secciones transversales son más adecuadas para órganos tubulares largos.
(6) Mantener limpias las sustancias: si hay sangre, suciedad, mocos, comida, heces, etc. El bloque de tejido se puede enjuagar con agua y colocar en fijador.
(7) Mantener la forma original del tejido: Una vez fijado el tejido fresco, se encogerá más o menos y, en ocasiones, incluso se deformará por completo. Para ello, se puede aplanar el tejido para mantener su forma original tanto como sea posible.
Reparación
(1) Método de fijación de tejido pequeño: este es el método más utilizado. Los pequeños trozos de tejido extraídos del cuerpo humano o animal deben fijarse inmediatamente con un fijador líquido. Por lo general, la proporción entre la muestra y el fijador es de 1: 4 ~ 20, pero el bloque de tejido no debe ser demasiado grande ni grueso, de lo contrario el fijador no podrá penetrar rápidamente. Por lo tanto, el tamaño del bloque de tejido es generalmente de 2,0 cm × 2,0 cm × 0,3 cm
(2) Fijación por perfusión por inyección: algunos bloques de tejido son demasiado grandes o el fijador es extremadamente difícil de penetrar en el interior, o el Todo el órgano o todo el animal necesita ser reparado. En este momento, se debe utilizar fijación por inyección o fijación por perfusión. El fijador se inyecta en los vasos sanguíneos y viaja a través de las ramas de los vasos sanguíneos hasta todo el tejido y el cuerpo, donde queda completamente fijado.
(3) Método de fijación con vapor: para muestras relativamente pequeñas y gruesas, se puede utilizar la fijación con vapor de ácido ósmico o formaldehído. Por ejemplo, el frotis de sangre debe fijarse con ácido ósmico o vapor de formaldehído antes de secarlo.
Los fijadores más utilizados son el fijador de formaldehído 10 y el fijador de etanol 95.
3. La deshidratación es transparente
Después de fijar y limpiar la muestra, el tejido contiene más agua y se debe reemplazar el agua en el bloque de tejido. Este proceso se llama deshidratación. Ya sea que se trate de un corte con parafina o colodión, se debe eliminar la humedad contenida en el tejido. Dado que los tejidos hidratados son incompatibles con materiales de inclusión como la parafina y el colodión, comúnmente se utilizan una serie de etanoles de diferentes concentraciones como agentes deshidratantes.
Los pasos de la deshidratación son: 80, 90, 95 y 100 etanol en varias concentraciones durante 2 horas. Este proceso lo puede completar automáticamente el deshidratador.
La acetona también es un agente deshidratante y tiene una fuerte capacidad deshidratante. Sin embargo, debido a su fuerte capacidad de deshidratación y su severa contracción del tejido, este reactivo generalmente no se usa cuando se realiza seccionamiento para investigación y enseñanza científica. Debido a que el etanol, la acetona, etc. son insolubles en parafina, deben pasar por un proceso de reemplazo de solventes que sean solubles en parafina. Esto se llama transparencia. Los agentes transparentes de uso común incluyen xileno, cloroformo, salicilato de metilo, etc.
4. Inclusión por inmersión en cera
(1) Sumerja parafina en el tejido para reemplazar el agente limpiador contenido en el tejido.
(2) Incrustación: coloque el tejido empapado en cera en parafina sólida derretida. Después de que la parafina se solidifique, el tejido se envuelve en ella, lo que se llama bloque de cera. Este proceso se llama incrustación.
Cortar y reparar
(1) Recorte del bloque de cera: Dependiendo del tamaño del tejido, corte la cera restante a aproximadamente 0,1 ~ 0,2 cm del borde del tejido. De lo contrario, el tejido se encogerá fácilmente y será desigual.
(2) Prepare las herramientas para cortar: cuchillo para cortar, cepillo, pinzas oftálmicas (curvas), termostato de horneado.
(3) Instalación de bloques de cera: Instale los bloques de cera reparados en rejillas de cera de metal o madera.
(4) Instalación de la cuchilla para cortar: instale la cuchilla para cortar en la mesa de corte del microtomo y apriete los tornillos de fijación en la mesa de corte para evitar vibraciones durante el corte y mantener un cierto grosor de corte.
(5) Espesor del corte: el regulador de espesor del microtomo está grabado con 0 ~ 50 μm o 0 ~ 25 μm, y el espesor se puede seleccionar arbitrariamente. El espesor de las secciones de parafina es generalmente de 4 ~ 6μ m.
(6) Seccionamiento
(7) Colocación: use pinzas oftálmicas para colocar suavemente la cera sobre el agua a 40 ~ 45 ℃ La cinta utiliza la tensión y la temperatura del agua para aplanar naturalmente la cinta de cera ligeramente arrugada.
(8) Horneado de rebanadas: después de aplanar completamente las rebanadas en agua a temperatura constante, retire la rebanada de cera hasta el centro del portaobjetos, vierta el agua restante en el portaobjetos y coloque las rebanadas en Hornee en un horno a temperatura constante a 60-65°C o en un horno con un controlador de temperatura de horneado y blanqueo de rebanadas durante 15-30 minutos para eliminar la parafina disuelta en los huecos del tejido.
6. Tinción y sellado
El método de tinción comúnmente utilizado es la tinción con hematoxilina-eosina, conocida como tinción H.E. Este método se puede utilizar para tejidos fijados con cualquier fijador y para secciones con varios métodos de inclusión. La hematoxilina es un tinte básico que tiñe de azul los materiales basófilos de los tejidos, como la cromatina de los núcleos celulares. La eosina es un tinte ácido que enrojece los eosinófilos de los tejidos. Por ejemplo, en secciones teñidas con HE, el citoplasma y los nucléolos de la mayoría de las células son rojos.
Los procedimientos de teñido son los siguientes: desparafinado, eliminación de debenceno, rehidratación, teñido, deshidratación, transparencia y sellado.
En la tinción convencional con hematoxilina se utiliza eosina como tinción de contraste. En los últimos años, algunos laboratorios de Reino Unido y Estados Unidos también han utilizado floroglucinol. Además, también se utilizaron como tintes de contraste Orange G (OrangeG), Biberich Scarlet y Bordeaux Red. La eosina es un tinte de uso común para teñir el citoplasma, fibras de colágeno, fibras musculares, gránulos eosinófilos, etc.