¿Cómo detectar la apoptosis neuronal?
CLONTECH e Invitrogen, reconocidas empresas estadounidenses de reactivos bioquímicos, han desarrollado varios productos etiquetados con Anexina V, que son simples y rápidos, y la detección se puede completar en 10 minutos. Entre ellos, la anexina V-EGFP (proteína fluorescente verde mejorada) marcada con fluorescencia y la anexina V-FITC tienen una alta sensibilidad y pueden usarse como base para la detección de células apoptóticas mediante el método FACS (citometría de flujo). Dado que la proteína de fusión Anexina V-EGFP tiene una relación de unión de EGFP a PS de 1:1, también se puede detectar cuantitativamente. Además, también se proporciona anexina V conjugada con biotina, que puede detectarse mediante reacciones cromogénicas ligadas a enzimas ordinarias. Además, MACS utiliza perlas magnéticas recubiertas con anexina V y se puede utilizar la separación magnética para detectar células apoptóticas.
2) Detección de cambios en el estado redox intracelular:
Esto refleja una tendencia relativamente nueva en la investigación de la apoptosis, que consiste en estudiar qué entorno redox causa eventos posteriores. El kit de detección de glutatión Apoalertm de CLONTECH utiliza el colorante fluorescente monoclorodiamina (MCB) para detectar la disminución de glutatión en el citoplasma de células apoptóticas in vitro para detectar cambios en el estado redox intracelular en las primeras etapas de la apoptosis. En circunstancias normales, el glutatión (GSH) es un importante tampón redox para las células. Los óxidos tóxicos en las células se eliminan regularmente mediante la reducción de GSH, y el GSH oxidado puede reducirse rápidamente mediante la GSH reductasa. Esta reacción es particularmente importante en las mitocondrias, de donde se eliminan muchos de los subproductos del daño oxidativo de la respiración. En Jurcat y algunos otros tipos de células, existe un sistema de transferencia de GSH dependiente de ATP en la membrana celular que puede iniciarse mediante señales apoptóticas. Cuando la eliminación de GSH intracelular es muy activa, el citosol cambia de un ambiente reductor a un ambiente oxidante, lo que puede conducir a una disminución del potencial de membrana mitocondrial en las primeras etapas de la apoptosis, transfiriendo así el citocromo C (un componente importante en el sistema tricarboxílico). ciclo ácido) desde la mitocondria al citosol, iniciando la reacción en cascada de la caspasa efectora apoptótica.
Debido a que el GSH está estrechamente relacionado con la función redox y mitocondrial, esta prueba es útil no solo para estudiar el inicio de la apoptosis, sino también para el tratamiento de enfermedades cardíacas, accidentes cerebrovasculares y otras enfermedades. Sin embargo, algunas células, como las células HeLa y 3T3, no presentan cambios significativos en los niveles de GSH durante el proceso de apoptosis, por lo que no pueden detectarse con este método.
3) Detección de localización del citocromo c
El citocromo C, como sustancia señalizadora, juega un papel importante en la apoptosis celular. Normalmente, existe en la cavidad entre las membranas mitocondriales interna y externa y se libera de las mitocondrias al citosol bajo la estimulación de señales apoptóticas. Cuando se une a APAF-1 (factor 1 activador de proteína apoptótica), inicia la cascada de caspasas: el complejo citocromo C/Apaf-1 activa la caspasa-9, que a su vez activa la caspasa-3, etc. La subunidad IV del citocromo c oxidasa (co x4) es una proteína de membrana ubicada en la membrana mitocondrial interna. Se retiene en las mitocondrias cuando se produce la apoptosis, por lo que es un marcador muy útil de enriquecimiento mitocondrial.
El kit de fraccionamiento celular ApoAlertTM puede aislar de manera rápida y eficiente mitocondrias altamente enriquecidas de células apoptóticas y no apoptóticas sin necesidad de ultracentrifugación, y luego etiquetarlas mediante hibridación Western con anticuerpos contra el citocromo c y COX4. el citocromo c y la COX4 determinan la aparición de apoptosis.
4) Detección de cambios en el potencial de membrana mitocondrial:
En las primeras etapas de la investigación de la apoptosis, no hubo cambios obvios en las mitocondrias a partir de observaciones morfológicas. Con una investigación en profundidad sobre el mecanismo de la apoptosis, se ha descubierto que la apoptosis mitocondrial también es un componente importante de la apoptosis celular y se han producido muchos cambios fisiológicos y bioquímicos. Por ejemplo, el potencial transmembrana mitocondrial cambiará después de ser inducido por apoptosis, lo que provocará cambios en la permeabilidad de la membrana.
El colorante catiónico MitoSensorTM es muy sensible a este cambio y presenta diferentes colorantes fluorescentes. En las células normales, forma agregados en las mitocondrias y emite una fuerte fluorescencia roja. En las células apoptóticas, debido a cambios en el potencial transmembrana mitocondrial, existe como monómero en el líquido celular y emite fluorescencia verde. Estas dos señales fluorescentes diferentes se pueden distinguir claramente mediante microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. El kit de sensor de membrana mitocondrial Apo Alert de CLONTECH utiliza este principio para detectar cambios en el potencial de la membrana mitocondrial. Sin embargo, este método no puede distinguir cambios en el potencial de membrana mitocondrial causados por apoptosis u otras causas. En las últimas etapas de la apoptosis, las endonucleasas (sustratos de ciertas caspasas) escinden el ADN nuclear entre nucleosomas, produciendo una gran cantidad de fragmentos de ADN con una longitud de 180 a 200 pb. Generalmente existen dos métodos para detectar este fenómeno:
1) TUNEL (etiquetado de extremo de muesca de dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal)
Los dNTP etiquetados (principalmente dUTP) se conectan al extremo 3'. -OH del fragmento de ADN indirectamente (a través de digoxigenina) o directamente mediante la transferasa terminal del ADN, y luego los resultados se analizan cuantitativamente mediante detección cromogénica ligada a enzimas o fluorescencia. La empresa estadounidense Intergen ofrece una variedad de métodos de marcaje, como el marcaje fluorescente directo, el marcaje fluorescente mediado por digoxigenina o la cromatografía ligada a peroxidasa, que pueden usarse para suspensiones celulares, tejidos fijados con formalina o tratados con parafina y cultivos celulares. muestras como materiales. Entre ellos, hay pocos pasos para el etiquetado directo y la operación es sencilla. El etiquetado indirecto tiene un efecto de amplificación de señal y una alta sensibilidad de detección.
2) Escalera LM-PCR (detección por PCR mediada por ligadura)
Cuando la proporción de células apoptóticas es pequeña y el tamaño de la muestra es pequeño (como una biopsia), se pueden realizar cambios directos en agarosa. en el ADN nuclear puede no observarse mediante electroforesis. ¿Alarma de la empresa Clonetech? El kit de detección en escalera LM-PCR amplifica específicamente fragmentos de gradiente de nucleosomas a través de LM-PCR (PCR mediada por ligación) y los liga con adaptadores específicos para detectar con sensibilidad los nucleosomas producidos durante la apoptosis. Además, el ensayo LM-PCR es semicuantitativo y, por tanto, permite comparar diferentes muestras con el mismo grado de apoptosis.
Los dos métodos anteriores están dirigidos a las características de la fragmentación del ADN nuclear en la última etapa de la apoptosis, pero este fenómeno también ocurrirá cuando las células sean dañadas por otros factores (como daño mecánico, luz ultravioleta, etc.) .). ), por lo que su detección de apoptosis se verá interferida por otros motivos.
3) Detección de telomerasa (detección de telomerasa)
Este es un método que se introdujo anteriormente y se usa con más frecuencia. La telomerasa es una proteína nuclear compuesta de ARN y proteínas. Puede transcribir inversamente su propio ARN como plantilla para sintetizar secuencias repetidas teloméricas, haciendo que las células sean "inmortales". Las células somáticas normales no tienen actividad telomerasa. Los telómeros de los cromosomas se acortan con cada división, posiblemente actuando como un reloj mitótico que indica la edad celular, la senescencia replicativa o la apoptosis. Se encontró que más del 90% de las células cancerosas o apoptóticas tenían actividad telomerasa. El kit de prueba TRAP-eze Telemerase de Invitrogen se lanzó por primera vez en 1996. Proporciona un sustrato oligonucleotídico específico y cebadores que se emparejan con el sustrato y las repeticiones teloméricas, respectivamente. Si la muestra a analizar contiene actividad de telomerasa, se pueden unir al sustrato diferentes números de secuencias de repetición telomérica de 6 bases (GGTTAG). Mediante la reacción de PCR y la detección de electroforesis del producto, se puede observar un fenómeno de escalera de ADN con una diferencia de 6 bases. (Ver Figura 4). Además, Intergen también proporciona kits de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
Del mismo modo, este método de detección no es específico de la apoptosis y los resultados de la detección no reflejan puramente la aparición de apoptosis. Sobre la base de las características morfológicas inherentes de las células apoptóticas, se han diseñado muchos métodos diferentes de detección de la morfología de la apoptosis.
1. Microscopio óptico y microscopio invertido
1. Células no teñidas: Las células apoptóticas se vuelven más pequeñas y se deforman, pero la membrana celular está intacta pero con espuma, y se pueden observar cuerpos apoptóticos. la última etapa de la apoptosis.
Las células adherentes se encogen, se redondean y se caen.
2. Tinción de células: Se utilizan habitualmente la tinción de Giemsa y la tinción de Wright. Condensación de cromatina, marginación, ruptura de la membrana nuclear y fragmentación de la cromatina en células apoptóticas.
Formas típicas de apoptosis, como masas y cuerpos apoptóticos.
2. Microscopio de fluorescencia y microscopio de barrido láser focalizado.
El progreso de la apoptosis celular generalmente se juzga por los cambios morfológicos en la cromatina del núcleo celular.
Los colorantes específicos de ADN de uso común incluyen: HO 33342 (Hoechst 33342), HO 33258 (Hoechst 33258) y DAPI. La unión de los tres colorantes al ADN no se intercala, principalmente en la región de la base A-T del ADN. Cuando se excita con la luz ultravioleta, emite una fluorescencia azul brillante.
Hoechst es un tinte reactivo que se une específicamente al ADN. Prepare la solución madre con agua destilada hasta una concentración de 65438 ± 0 mg/ml y diluya con PBS hasta una concentración final de 2 ~ 5 mg/ml.
DAPI es semipermeable y se utiliza para la tinción rutinaria de células fijadas. La solución de almacenamiento se prepara con agua destilada hasta una concentración de 1 mg/ml, y la concentración final en uso es generalmente de 0,5 ~ 1 mg/ml.
Resultados: Los cambios morfológicos de la cromatina nuclear durante la apoptosis se pueden dividir en tres etapas: la primera etapa, el núcleo se encoge o se contrae, y algo de cromatina se condensa; la etapa ⅱa, la cromatina nuclear está altamente condensada; , Marginación; los núcleos de las células de fase IIb se fragmentan en fragmentos, formando cuerpos apoptóticos.
3. Observación con microscopio electrónico de transmisión
Evaluación del resultado: El tamaño de las células apoptóticas se hizo más pequeño y se concentró en el citoplasma. La cromatina en el núcleo de las células proapoptóticas de tipo I está muy curvada y aparecen muchas estructuras de vacuolas llamadas vacuolas. En la etapa ⅱa, la cromatina nuclear está muy condensada y marginada; en las últimas etapas de la apoptosis, el núcleo se rompe en fragmentos y se forman cuerpos apoptóticos. La apoptosis juega un papel importante en el desarrollo embrionario, la hematopoyesis, la maduración del sistema inmunológico, el mantenimiento de la estabilidad celular y el equilibrio del crecimiento de los tejidos y órganos normales, e incluso el envejecimiento corporal. Por lo tanto, la investigación sobre la apoptosis celular se ha llevado a cabo ampliamente en campos clínicos y básicos, y el método de detección de células apoptóticas es muy importante. La citometría de flujo (FCM) integra tecnología de inyección de fluidos, tecnología óptica láser, tecnología electrónica y tecnología informática, y tiene ventajas que otros métodos no pueden igualar. Se puede utilizar cualitativa y cuantitativamente, es simple, rápido y altamente sensible, y se puede utilizar para análisis multiparamétricos y de células vivas. Esta investigación ha sido ampliamente utilizada en APO y abrió un nuevo enfoque.
1 Método de dispersión de luz
En el sistema FCM, cuando las células bajo prueba pasan a través del área de medición del instrumento en el flujo de fluido, dispersan la luz en todas direcciones en un ángulo sólido de 360°. La intensidad de la luz dispersada hacia adelante (FSC) está relacionada con el tamaño de la célula, mientras que la intensidad de la luz dispersada lateral (SSC) está relacionada con el índice de refracción de la membrana plasmática y las células. Durante la apoptosis, las células se encogen, se vuelven más pequeñas, forman fragmentos nucleares y los gránulos intracelulares a menudo aumentan, por lo que el FSC de las células apoptóticas disminuye y el SSC aumenta. La necrosis celular es causada por la hinchazón del cuerpo celular y la fragmentación y desmontaje del núcleo celular, aumentando así tanto el FSC como el SCC. Las células normales tienen FSC alto y SSC bajo. La principal ventaja de detectar células apoptóticas basándose en las propiedades de dispersión de la luz es que se puede combinar con el análisis de inmunofluorescencia de la superficie celular. Estos tratamientos especiales se pueden utilizar para distinguir e identificar subtipos de linfocitos que sufren apoptosis selectiva y también se pueden utilizar para la clasificación de células vivas. . Vale la pena señalar que la confiabilidad de juzgar las células apoptóticas basándose en FSC y SSC se ve muy afectada por la uniformidad morfológica y la proporción nuclear-citoplasmática de las células analizadas. Por lo tanto, la confiabilidad de las propiedades de dispersión de la luz en la detección de la apoptosis es mejor en la apoptosis de ciertos linfocitos, pero menos confiable en la apoptosis de las células tumorales.
2 Determinación del contenido de ADN celular
Durante el proceso de apoptosis, se activa la endonucleasa, lo que produce la fragmentación del ADN. Esta es una manifestación característica de la apoptosis y proporciona a FCM la capacidad de identificar. apoptosis. Las células sientan las bases. Entre los métodos para detectar la fragmentación del ADN apoptótico, el más utilizado y el más sencillo es el análisis del contenido del ADN celular. Cuando las células se tratan con etanol y TRTIONX-100, aparecen agujeros en la membrana celular y se liberan pequeños fragmentos de ADN de las células, lo que hace que su contenido de ADN sea menor que el de las células normales. Después de teñir con yoduro de propidio (PI), se encontró que el diploide C0/G1 tenía un pico "subdiploide", es decir, el pico APO. Según el pico de APO, se puede medir el porcentaje de células apoptóticas. Este método es simple y fácil de implementar y puede usarse para detectar cuantitativamente una gran cantidad de muestras apoptóticas mientras se analiza la posición del ciclo celular. Además, la detección combinada de ADN y ARN mediante el método FCM puede identificar células en la fase G0, por lo que se puede analizar la relación entre la apoptosis y las mamas delgadas G1 o G0. El grado de degradación del ADN depende de la etapa de la apoptosis, el tipo de célula y las características de los factores inductores de la apoptosis. Los cambios en el escape del ADN durante el proceso de tinción también afectarán los resultados de la detección de FCM.
Según la investigación, agregar una alta concentración de tampón de fosfato y citrato a la solución de enjuague puede aumentar el escape de ADN degradado, mejorando así la capacidad de distinguir las células apoptóticas de las células normales.
La limitación de la medición del contenido de ADN en la detección de apoptosis es su baja especificidad y sensibilidad. La especificidad no es alta porque el pico de APO representa un grupo de poblaciones celulares, incluidas células apoptóticas, células dañadas mecánicamente, células con bajo contenido de ADN o células con diferentes estructuras cromosómicas. En estos casos, la cantidad de ADN y tinte fluorescente unidos es pequeña. Además, cuando las células no fijadas se lisan en soluciones hipotónicas, pueden producirse grandes cantidades de fragmentación nuclear. En este momento, el número de células en el pico de APO solo representa el número de fragmentos nucleares, no el número de células apoptóticas. La razón de la baja sensibilidad es que solo aparecen puntos de ruptura del ADN en la etapa temprana de la apoptosis, pero una gran cantidad de fragmentos de ADN no se pierden, por lo que este método no puede detectar células apoptóticas tempranas ni células apoptóticas que ocurren en la fase S o G2/. Fase M debido a su El contenido real no es inferior al ADN contenido en las células diploides, por lo que este método debe combinarse con otros métodos morfológicos o bioquímicos para analizar con mayor precisión el estado apoptótico de las células.
Naranja de acridina, AO)
El AO puede teñir el ADN bicatenario y el ADN desnaturalizado en células o núcleos con diferentes colores de fluorescencia. Cuando el AO se inserta en el ADN bicatenario, emite fluorescencia verde; el AO también puede interactuar con el ADN monocatenario o con el ADN monocatenario producido por desnaturalización, momento en el que emite fluorescencia roja. Por lo tanto, la aparición de apoptosis se puede determinar detectando diferentes fluorescencias mediante FCM. Después de la estandarización de las mediciones, la magnitud de la intensidad de la fluorescencia verde y roja es proporcional al contenido total de ADN, y la relación entre la fluorescencia roja y la fluorescencia celular total (rojo más verde) representa la proporción de ADN desnaturalizado en la célula. Por tanto, este método puede utilizarse para evaluar la sensibilidad del ADN a la desnaturalización in situ. A veces, la degradación del ADN de las células apoptóticas no es obvia y es difícil detectar cambios apoptóticos basándose en métodos de degradación del ADN, como la medición del contenido de ADN celular y el etiquetado de los extremos del ADN. El principio de detección de apoptosis mediante el método AO no depende de la generación de fragmentos de ADN, por lo que su principal ventaja es que puede aplicarse a situaciones en las que los fragmentos de oligonucleosomas y la apoptosis están desequilibrados, pero la tinción con AO no puede distinguir eficazmente las células mitóticas y las células apoptóticas. .
4 Método de tinción con rodamina (Rh123)
En el estado de supervivencia de las células, la bomba de sodio-potasio y la bomba de calcio en la membrana celular mantienen el gradiente de concentración de diferentes iones dentro y fuera la membrana celular, incluyendo Na+, K+, Cl-, Ca2+, etc. , y forman el potencial de membrana celular. FCM puede detectar la distribución de tintes fluorescentes iónicos lipófilos dentro y fuera de la membrana celular para medir el potencial de membrana y evaluar la viabilidad celular. Rh123 es un tinte fluorescente catiónico lipófilo que puede penetrar las membranas celulares, especialmente las membranas mitocondriales. Cuando la célula está viva, la rodamina 123 atraviesa la membrana celular, se acumula en las mitocondrias y emite fluorescencia verde. Durante el proceso de apoptosis celular, la capacidad de transporte de la membrana mitocondrial disminuye, la electronegatividad disminuye, también se pierde la capacidad de las mitocondrias celulares para acumular Rh123 y disminuye la intensidad de la fluorescencia, detectándose así cambios en la apoptosis celular. Sin embargo, cabe señalar que en la etapa inicial de la apoptosis, debido a que la membrana celular aún está intacta y la mayoría de los orgánulos y funciones celulares son relativamente buenos, es difícil distinguir las células apoptóticas tempranas de las células vivas utilizando el método Rh123.
5 Tecnología de etiquetado de extremos in situ
En la apoptosis celular, la fragmentación del ADN precede a los cambios morfológicos y el contenido de ADN disminuye. El etiquetado final in situ (ISEL) es la penetración de nucleótidos exógenos en células apoptóticas. Bajo la catálisis de enzimas y ADN, las nucleasas endógenas se activan para producir roturas de una o dos cadenas, que es más sensible que los aspectos anteriores. Por lo general, existen dos métodos: ① ADN polimerasa I o traducción de espacio de unidad mediada por fragmentos grandes de Klenow (INST); ② etiquetado de extremo de mella dUTP mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL).
INST utiliza la ADN polimerasa para integrar nucleótidos en el extremo 3' del ADN roto en células apoptóticas e hidrolizar el extremo 5' para reparar el ADN. Si se utilizan nucleótidos marcados, se pueden mostrar células con ADN roto. En 1993, Gorczyca et al. propusieron un método de marcado con desoxirribonucleotidil transferasa terminal (TdT) para detectar roturas del ADN en células apoptóticas, y ha sido ampliamente utilizado. Debido a la activación de endonucleasas endógenas, la cromatina o el ADN de la propia célula se escinde y se genera la misma cantidad de puntos de ruptura del ADN en el extremo 3'2 hidroxilo.
La TdT puede marcar dUTP biotinilado en el extremo 3'2 hidroxilo y utilizar el sistema de ovoalbúmina 2FITC para hacer que el punto de ruptura del ADN emita fluorescencia específica, identificando así células apoptóticas. El etiquetado terminal TdT es un método más específico para identificar células apoptóticas. Hay menos células apoptóticas en el tejido cerebral, por lo que se necesitan técnicas de detección más sensibles para fragmentos de ADN genómico. TUNEL combinado con FCM puede mejorar la sensibilidad de detección de fragmentos de ADN de células apoptóticas. Después de que las células fueron tratadas con factores inductores de apoptosis durante un cierto período de tiempo, el marcaje final in situ mostró más apoptosis que la tinción Hoechst33342, lo que sugiere que TUNEL puede detectar núcleos sin características morfológicas apoptóticas obvias, pero sí fragmentación del ADN, mejorando así la sensibilidad de detección. Los estudios comparativos han demostrado que la sensibilidad de TUNEL es mucho mayor que la de ISNT. Especialmente en la etapa inicial de APO, la tasa positiva del método TUNEL es mayor. Esta puede ser la razón por la cual el ADN es principalmente bicatenario y monocatenario. Es raro cuando ocurre APO. Esta última es una reacción de reparación mediada por la ADN polimerasa, por lo que la tasa positiva de ISNT es relativamente baja. TUNEL también se puede combinar con el análisis de sincronización celular para comprender simultáneamente la relación entre la fragmentación del ADN y la distribución del ciclo celular de las células apoptóticas. Recientemente se ha convertido en uno de los métodos más utilizados para identificar y cuantificar células apoptóticas. Sin embargo, debido a que el proceso de etiquetado del ADN roto es complejo e involucra muchos factores, el resultado negativo del etiquetado final no necesariamente representa la integridad de la cadena de ADN, y es necesario descartar muchos factores que influyen, como la pérdida de actividad de la enzima TdT. . Por lo tanto, es necesario configurar grupos de control positivo y negativo al mismo tiempo y utilizar el método de etiquetado terminal TdT para identificar células apoptóticas y obtener resultados confiables.
Método 6Anexina V/PI
1992 Fadok informó que la fosfatidilserina (PS) ubicada dentro de la membrana celular en la etapa temprana de APO migra al exterior de la célula y aparece en la cromatina nuclear. degeneración y volumen nuclear antes de alejarse. La anexinaV es una proteína vascular con fuertes propiedades anticoagulantes y alta afinidad por los fosfolípidos, especialmente los fosfolípidos cargados negativamente como la PS. Sus propiedades se pueden utilizar para detectar la apoptosis celular. Sin embargo, las células necróticas también están expuestas al PS en la superficie, lo que las hace positivas para la unión de Anexina V. Por lo tanto, el parámetro Anexina V no puede distinguir necrosis o apoptosis, y el parámetro PI debe usarse para distinguir la bilis necrótica. El PS marcado con FCM combinado con PI se expone a la membrana celular a través de Anexina V-FITC y ingresa a la membrana celular dañada, lo que marca la degradación del ADN para el análisis de células apoptóticas y necróticas. Dividido en cuatro subgrupos, que incluyen células lesionadas mecánicamente (Anexina-/P1+), células normales (Anexina-/PI-), células apoptóticas (Anexina+/PI-) y células necróticas secundarias (Anexina+/PI+). Boersma et al. utilizaron la tinción con Ampexin V2FITE para detectar cambios apoptóticos en células de hámster chino después del tratamiento con fármacos citotóxicos y descubrieron que las señales de fluorescencia de las dos subpoblaciones de células eran diferentes. Además, se confirmó morfológicamente que la subpoblación de células débilmente fluorescentes representa células apoptóticas tempranas, y la subpoblación de células fuertemente fluorescentes representa células apoptóticas tardías, lo que indica que este es un método confiable para detectar y cuantificar células apoptóticas. Cuando se produce la apoptosis, la PS en la membrana queda expuesta antes que la fragmentación del ADN, por lo que este método es más sensible para detectar la apoptosis temprana y no requiere reparar las células. Evita el exceso de restos celulares causados por el método PI y la pérdida de fragmentos de ADN causada por. El método TUNEL, por lo tanto, más rápido y más confiable, es actualmente el método de detección cuantitativa más ideal para la apoptosis.
7 Otros
7.1 Método del anticuerpo monoclonal ssDNA El uso de anticuerpos monoclonales anti-ADN monocatenario (ssDNA) para detectar la apoptosis celular fue un descubrimiento accidental, porque en la aplicación del ssDNA Anticuerpos monoclonales (método de fluorescencia) Al detectar daños en el ADN inducidos por fármacos citotóxicos, se observó que las células de leucemia apoptótica (MOL T24) tenían una fuerte fluorescencia. Posteriormente se demostró que los anticuerpos monoclonales de ADN ss pueden reconocer específicamente las células apoptóticas después de las mejoras adecuadas. En comparación con el método TUNEL, el ssDNA es más sensible. Las células apoptóticas detectadas mediante el método TUNEL pueden ser sólo un subtipo de células apoptóticas detectadas mediante el método de anticuerpos monoclonales. La detección de APO por inmunofluorescencia generalmente utiliza el método SsDNA. Pero también se puede utilizar junto con FCM. El método del anticuerpo monoclonal es fácil de usar, de bajo costo y ampliamente utilizado. Los anticuerpos monoclonales SsDNA pueden distinguir entre necrosis y apoptosis, e incluso pueden detectar muertes indeseables preapoptóticas y postapoptóticas y algunas formas especiales de apoptosis (como la apoptosis no fragmentada).
Por lo tanto, se espera que el método del anticuerpo monoclonal ssDNA se convierta en un nuevo método específico y sensible para detectar la apoptosis celular.
7.2 El análisis de las proteínas relacionadas con la apoptosis encontró que muchos genes están involucrados en la regulación de la apoptosis, y estos productos genéticos pueden promover o inhibir la aparición y el desarrollo de APO. Por lo tanto, la detección de proteínas genéticas reguladoras de la apoptosis es de gran importancia para estudiar la APO y su regulación. Hasta el momento se han analizado los productos proteicos de un gran número de genes reguladores de la apoptosis, como la proteína P53, caspasas, C2myc, antígeno Fas, TNF, proteínas de la familia bcl-22, ciclina, ras, etc. FCM tiñe con anticuerpos monoclonales marcados con fluorescencia contra varias proteínas reguladoras, recopila señales de fluorescencia de diferentes longitudes de onda y detecta la cantidad de moléculas fluorescentes en la superficie de la membrana celular o dentro de las células. Puede conocer los cambios en cada célula, requiere pocas muestras y. el método es simple, rápido y preciso.
8 Wang Zhan
En los últimos años, con el desarrollo continuo de la tecnología FCM y la profundización gradual de la investigación de APO, FCM se ha utilizado ampliamente en el estudio de la apoptosis celular. La detección cuantitativa de células apoptóticas mediante citometría de flujo es sencilla, rápida y objetiva, y puede utilizarse para la detección multiparamétrica. Esto permite un análisis de correlación simultáneo de APO y su expresión oncogénica relacionada, la distribución del ciclo celular y muchos otros factores para obtener una comprensión profunda del mecanismo regulador de la apoptosis. Aunque existen muchos métodos para estudiar la apoptosis mediante citometría de flujo, los métodos para detectar células apoptóticas mediante citometría de flujo se basan generalmente en aspectos morfológicos, bioquímicos y otros del proceso de apoptosis, lo que dificulta comprender el proceso de apoptosis. en el método también hace que dichos métodos carezcan de especificidad. Por tanto, es un método más eficaz combinar varios métodos de detección de FCM con diferentes características para identificar células apoptóticas. Al mismo tiempo, los resultados de los estudios de FCM deben combinarse con observaciones morfológicas o métodos bioquímicos para obtener una comprensión más profunda de las características biológicas de las células apoptóticas. Con el desarrollo de la biotecnología y la comprensión profunda de la naturaleza de la APO por parte de la gente, creo que en un futuro próximo habrá métodos más específicos y sensibles que ayudarán a lograr avances en la apoptosis.