¿Cuáles son los pasos en el proceso de elaboración de secciones de parafina?
Los pasos de toma de materiales, fijación, deshidratación, transparencia, encerado, incrustación, corte, pegado, teñido, transparencia, sellado y otros pasos.
En concreto:
1. Materiales de dibujo
La calidad del material afecta directamente a la calidad de los cortes. Independientemente del material animal o vegetal que se elija, se debe prestar atención a los siguientes puntos.
(1) Los materiales vegetales deben seleccionarse de manera que no dañen las plantas o las partes requeridas tanto como sea posible; los animales a menudo se anestesian cuando toman materiales animales. Los anestésicos más utilizados son el cloroformo y el éter, o se mata al animal y se extrae rápidamente el tejido necesario.
(2) Las materias primas deben ser frescas, lo cual es especialmente importante para la investigación en biología celular. Debemos recortar la mayor cantidad de trozos de tejido vivo posible y luego poner el fijador en su interior.
(3) Al cortar materiales, el cuchillo debe estar afilado para evitar aplastar y dañar las células.
(4) El material cortado debe ser pequeño y fino para que el fijador pueda penetrar rápidamente en el interior. Generalmente, el espesor no supera los 2 mm y el tamaño no supera los 5×5 mm2.
Reparación
Después de abandonar el cuerpo, los tejidos y las células continúan con sus actividades vitales durante un cierto período de tiempo, provocando cambios patológicos hasta la muerte. Para que la muestra refleje el estado normal antes de la muerte, se deben utilizar algunas sustancias químicas lo antes posible para matar rápidamente tejidos y células, inhibir los cambios anteriores, convertir componentes estructurales en sustancias insolubles y evitar que ciertas estructuras se derritan y desaparezcan. Este tratamiento es fijo. Además de las funciones anteriores, el fijador también endurecerá el tejido de manera adecuada para su procesamiento posterior y también cambiará el índice de refracción dentro de las células, lo que hará que ciertas partes sean fáciles de teñir.
El principal objetivo de los fijadores son las proteínas. En cuanto a otros ingredientes, como la grasa y el azúcar, generalmente no se consideran en la producción. Si desea observar estas sustancias, puede utilizar métodos especiales para repararlas.
Deshidratación
Los tejidos biológicos contienen una gran cantidad de agua, que es incompatible con la parafina, imposibilitando que la parafina penetre en el tejido durante el proceso de inclusión. Por lo tanto, se debe eliminar toda la humedad con un agente deshidratante, que es lo que hace la deshidratación.
Los agentes deshidratantes deben mezclarse con agua en cualquier proporción. Hay dos tipos de agentes deshidratantes: uno es un disolvente sin parafina, como etanol, acetona, etc., que debe ser transparente después de la deshidratación antes de poder incorporarse en cera; el otro es un disolvente de parafina, como n-; butanol, que puede penetrar directamente en la cera después de la deshidratación.
Un agente deshidratante comúnmente utilizado es el etanol porque es barato y fácilmente disponible.
Transparente
Los bloques de tejido deben quedar transparentes después de la deshidratación en disolventes sin parafina. El agente clarificante se puede mezclar con agente deshidratante y cera de parafina al mismo tiempo. Una vez que la parafina reemplaza al agente deshidratante, puede penetrar suavemente en el tejido.
Existen muchos tipos de agentes transparentes, los más utilizados son xileno, tolueno, benceno, cloroformo, asfalto aromático, aceite de anilina, etc.
5. La penetración e incrustación de la cera
La penetración de la cera debe realizarse en una incubadora. La temperatura de la incubadora debe ajustarse a 3 grados por encima del punto de fusión de la parafina. que el bloque de tejido transparente se pueda tratar con una mezcla igual de parafina y xileno y luego con parafina pura. La parafina pura debe procesarse de 2 a 3 veces. El tiempo de penetración de la cera depende de la naturaleza del material. Generalmente toma de 15 a 30 minutos cada vez.
La clave de la transparencia es controlar la temperatura constante y evitar altas y bajas temperaturas. Si la temperatura es demasiado baja, la parafina se solidificará y no podrá penetrar; si la temperatura es demasiado alta, el tejido se encogerá y se volverá quebradizo.
La incrustación consiste en envolver el bloque de tejido empapado en cera en parafina. El método específico es: primero prepare la caja (consulte la Figura 1-3 y las instrucciones para el método de plegado específico), vierta la cera derretida en la caja, use pinzas precalentadas para sacar rápidamente el bloque de tejido y colóquelo plano en el fondo de la caja, con la sección transversal hacia abajo, luego levante suavemente la caja y colóquela en agua fría. Después de que la parafina en la superficie se solidifique, presione inmediatamente la caja en el agua para permitir que se enfríe y solidifique rápidamente, y sáquela después de 30 minutos.
La temperatura de la cera de inclusión debe ser ligeramente superior a la temperatura de la cera transparente para garantizar la integración completa del bloque de tejido con la parafina circundante. También es importante un enfriamiento rápido de la parafina, de lo contrario se producirá una cristalización en el bloque incrustado. Causará fragmentos al cortar más tarde.
Rebanar
Antes de cortar, observe el filo del cuchillo con una lupa y seleccione la parte plana del filo para cortar. Fije el bloque de inclusión que se va a cortar en la mesa de muestras de modo que la sección exterior del bloque de inclusión quede paralela a la sección del clip de muestra y el bloque de inclusión quede ligeramente expuesto. Después de empujar la mesa del cuchillo hacia el borde exterior, afloje el tornillo de la abrazadera de la hoja y fije la hoja de modo que el plano de la cortadora y los bordes superior e inferior del inserto queden paralelos al borde del cuchillo para formar un ángulo de aproximadamente 15 °. Ajuste el grosor deseado de las rodajas en el dispositivo de micromovimiento.
Al ajustar, tenga cuidado de que el puntero no pueda estar entre las dos escalas, de lo contrario la cortadora se dañará fácilmente. Acerque la mesa de operaciones a la mesa de muestras para que el borde del cuchillo esté en ligero contacto con las rodajas de tejido y pueda comenzar a cortar. El método es el siguiente: gire la rueda con la mano derecha, use el cepillo con la mano izquierda para recoger la película de corte en el extremo inferior de la cuchilla y sostenga la cinta de cera cortada. Cuando la cinta encerada tenga una cierta longitud, deja de girar con la mano derecha, usa otro cepillo para levantar suavemente la cinta encerada y colócala plana en una caja forrada con papel negro. Preste atención a la velocidad de corte, agite la muela de manera uniforme para evitar que la cortadora vibre violentamente y cause un grosor desigual del corte, y preste atención a la dirección de rotación. Después del corte, las partes relevantes del microtomo deben limpiarse rápidamente con cloroformo.