El potencial de aplicación de la tecnología del transcriptoma espacial en la inmunoterapia tumoral
La hibridación in situ (ISH) es una técnica molecular que visualiza moléculas específicas de ADN o ARN en células o tejidos. La ISH se basa en la complementariedad de las dobles hebras de ADN/ADN o ADN/ARN y la hibridación in situ de sondas de ácido nucleico marcadas con la diana. De esta forma podemos obtener información espacial útil.
FISH es una herramienta clínica eficaz para detectar microorganismos, diagnosticar tumores sólidos y hematológicos y guiar el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, FISH se usa comúnmente para detectar la translocación BCR-ABL lt(9;22) y muchos genes de fusión en varios cánceres. FISH también se utiliza para confirmar la amplificación del gen HER2 en el cáncer de mama, identificando así a los pacientes con mayor probabilidad de beneficiarse del anticuerpo monoclonal anti-HER2 trastuzumab. Otro ejemplo importante es la detección del gen de fusión EML4-ALK en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. A medida que se desarrollan y aprueban más inmunoterapias, los investigadores buscan utilizar FISH para predecir la capacidad de respuesta de la inmunoterapia contra el cáncer. Para ampliar la eficacia de FISH, podemos combinar FISH con IHC o IF para detectar simultáneamente ARN y proteínas en diferentes tipos de células para caracterizar mejor el microambiente tumoral (TME).
Para abordar las limitaciones del FISH tradicional, los investigadores pasaron del estudio del ADN al estudio de moléculas individuales de ARN y adoptaron métodos de paso alto, lo que dio como resultado la tecnología smFISH, que puede visualizar y cuantificar moléculas individuales de ARNm y caracterizar patrones espaciales. de expresión genética endógena. Al apuntar al ARNm celular en lugar de a las moléculas de ADN, SmFISH se ha convertido en una poderosa herramienta para evaluar la heterogeneidad transcripcional de los tumores.
RNAscope es una tecnología comercial basada en ISH que puede detectar hasta 12 objetivos de ARN diferentes y se puede combinar fácilmente con IHC y/o IF para estudiar ARN y proteínas simultáneamente de forma automatizada. En comparación con otras tecnologías FISH basadas en peces, RNAscope ha diseñado más de 13.000 sondas de ARN y las ha validado mediante procesos comerciales. Por lo tanto, es un método fácil de usar y que ahorra tiempo para la investigación básica y los experimentos clínicos. RNAscope se ha utilizado ampliamente en diversas disciplinas, incluidas enfermedades infecciosas, cáncer, inmunoterapia, inflamación y neurociencia. En particular, es una potente alternativa a la IHC para evaluar la expresión de puntos de control inmunitarios, como PD-L1, en diversos tumores sólidos. Al detectar ARN específicos, RNAscope aclara el TME, los mecanismos de evasión inmune y nuevos biomarcadores que predicen y predicen el cáncer.
En el contexto de la inmunoterapia, RNAscope ha desempeñado un papel valioso en la comprensión de la terapia con células CAR-T. RNAscope se ha utilizado para evaluar la especificidad de la expresión del gen diana y rastrear la distribución de células CAR-T en modelos de ratón con xenoinjerto. Ampliando a muestras humanas, los estudios han confirmado que la expresión de BCMA es un objetivo para la inmunoterapia con células CAR-T en el mieloma múltiple.
Si bien RNAscope y otras tecnologías pueden lograr una mayor sensibilidad y especificidad, se necesitan tecnologías basadas en fFISHh para permitir que el análisis del transcriptoma de paso alto caracterice mejor poblaciones de células raras y tipos de células que muestran perfiles de expresión genética únicos. MERFISH y seqFISH no solo proporcionan una cuantificación de ARN, amplificación y detección de señales mejoradas, sino también un análisis del transcriptoma basado en imágenes.
MERFISH es una mejora de smFISH mediante el uso de un método de etiquetado combinado basado en códigos de barras, seguido de múltiples rondas de hibridación para garantizar un alto brillo de la señal de fluorescencia y una gran cantidad de ARN que se puede detectar al mismo tiempo.
SeqFISH es otra tecnología multiplex de smFISH basada en una serie de hibridaciones de códigos de barras. Por ejemplo, seqFISH se utiliza para detectar células madre embrionarias de ratón y tejido cerebral: imágenes con 10.000 ARNm con alta precisión y resolución.
Estudios relevantes han demostrado que seqFISH es una poderosa herramienta para estudiar y obtener la expresión dinámica de genes regulados durante la maduración de las células T. Otro estudio combinó la tecnología de microfluidos con la tecnología de multiplicación de Smfish para estudiar la heterogeneidad del tumor en el cáncer de mama, lo que demuestra que la multiplicación de Smfish se puede optimizar aún más desde diferentes ángulos.
Aunque la tecnología smFISH es muy prometedora, la tecnología compuesta basada en smFISH no se ha utilizado ampliamente en la investigación traslacional o en aplicaciones clínicas debido a la complejidad del diseño, la verificación, el análisis de imágenes y la decodificación de las sondas. A menudo es más conveniente estudiar la expresión de genes individuales a nivel de ARNm o proteína utilizando FISH no multiplex, PCR cuantitativa, IHC e IF, especialmente cuando el número de genes estudiados es pequeño, como un panel de marcadores de pronóstico. Otra limitación es que, debido a la naturaleza de la hibridación de secuencias, el tiempo total de obtención de imágenes es de al menos 18 horas, excluyendo el tiempo de hibridación inicial de la sonda de 36 a 48 horas, por lo que el rendimiento general es menor que el de otras tecnologías (como DSP y Visium). . ¿Qué pasa con la reutilización? La tecnología SmFISH solo puede evaluar un analito, como el ARN, en tejido fresco congelado. Las tecnologías emergentes como el DSP pueden evaluar proteínas y ARN tanto en tejido fresco congelado como en tejido estándar fijado con formalina e incluido en parafina (FFPE) comúnmente utilizado en patología.
DSP es un método de análisis espacial de alta complejidad que supera las principales limitaciones de la tecnología smFISH multicanal. DSP utiliza tecnología de detección de oligonucleótidos para cuantificar proteínas o ARN en muestras de tejido FFPE.
A diferencia de las tecnologías de hibridación de secuencias (como MERFISH), DSP proporciona un flujo de trabajo más eficiente y puede producir resultados de 10 a 20 secciones de tejido o hasta 384 áreas objetivo en 48 horas. Además, en comparación con el smFISH multiplex que solo analiza el ARN, el DSP puede detectar 96 proteínas o 1400 ARNm simultáneamente. Esta característica es particularmente relevante para la inmunoterapia del cáncer, ya que las diferencias en los patrones de expresión de proteínas y ARNm se pueden utilizar para dilucidar la regulación postranscripcional y las modificaciones postraduccionales, que conducen a la inestabilidad de las proteínas e influyen en el pronóstico y la respuesta al tratamiento. Al mismo tiempo, DSP también preserva la integridad de las muestras de tejido, lo que permite almacenar muestras preciosas para su posterior análisis en el futuro.
El DSP es ampliamente utilizado en el campo de la inmunoterapia. Por ejemplo, el DSP se ha utilizado para evaluar el microambiente inmunológico en pacientes con linfoma difuso de células B grandes que reciben quimioterapia. DSP también realiza investigaciones sobre terapias de bloqueo de puntos de control inmunológico, incluidas las terapias anti-PD-L1 y anti-PD-1. DSP se puede utilizar como herramienta de diagnóstico auxiliar para estandarizar, evaluar cuantitativa y objetivamente la expresión de la proteína PD-L1 en regiones espacialmente definidas del TME. En otro estudio, DSP identificó con éxito más de 20 biomarcadores que podrían predecir la respuesta a la inmunoterapia en pacientes con melanoma.
Durante la secuenciación del ARN unicelular, se pierde información espacial porque los tejidos normalmente se homogeneizan para obtener un perfil promedio del transcriptoma. Recientemente se ha desarrollado tecnología de transcriptómica espacial para permitir la visualización y el análisis cuantitativos del transcriptoma en secciones de tejido intacto utilizando micromatrices de oligodesoxitimidina con códigos de barras espaciales.
Esta nueva tecnología se demostró por primera vez en bulbos olfativos de ratón y sigue el siguiente flujo de trabajo estándar: corte de tejido, fijación, tinción con hematoxilina y eosina (H&E) e imágenes de campo claro, infiltración de tejido, síntesis de ADNc, resección de tejido, liberación de sondas, preparación de bibliotecas, secuenciación, procesamiento de datos, visualización y análisis de datos.
El análisis de datos de biopsias de cáncer de mama, próstata y melanoma maligno cutáneo mediante ST demuestra niveles sin precedentes de heterogeneidad dentro y entre tumores, según lo analizado mediante secuenciación de ARN y/o estándar. Anotado morfológicamente, hubo claras diferencias en la expresión genética. perfiles entre la región tumoral y la periferia. Además, los experimentos in vivo que utilizan esta tecnología encontraron que la señalización de IL-6 es inducida por la regeneración de la microglía, lo que puede ser valioso en la terapia.
Para aprovechar el potencial de la ST, los investigadores desarrollaron recientemente un método de análisis llamado MIA, que integra conjuntos de datos generados mediante secuenciación de ARN unicelular y tecnología ST para localizar células en regiones específicas del tejido. Como prueba de concepto, la MIA se realizó en un conjunto de datos de adenocarcinoma ductal pancreático y reveló el enriquecimiento de subpoblaciones y tipos de células específicas en regiones espacialmente restringidas que antes eran desconocidas o indetectables.
Basado en el concepto de transcripción espacial, 10× Genomics lanzó la solución de expresión génica espacial Visum.
Mayor resolución y mayor sensibilidad que la primera versión de la tecnología ST. Puede utilizarse para investigaciones en profundidad sobre enfermedades relacionadas con la estructura y función de los tejidos, no sólo para la inmunoterapia del cáncer, sino también para enfermedades neurológicas.
Aunque la tecnología de análisis del espacio transcripcional es relativamente nueva, ha sido ampliamente explorada en inmunoterapia tumoral. FISH y RNAscope son herramientas clínicas eficaces para el diagnóstico y predicción de tumores sólidos y hematológicos. Las tecnologías más nuevas, como MERFISH y Visium, permiten el análisis del transcriptoma en masa con una resolución y sensibilidad sin precedentes. A medida que esta tecnología esté cada vez más disponible, se podrán descubrir nuevos biomarcadores para predecir la respuesta a la inmunoterapia y personalizar los tratamientos en función de la heterogeneidad de su TME único. Estas técnicas de análisis espacial también se pueden combinar con técnicas de reducción de dimensionalidad; por ejemplo, UMAP se utiliza para visualizar el paisaje inmunológico del TME.
De cara al futuro, DSP proporciona análisis espacial y caracterización digital de la expresión del ARNm, pero todavía está limitado por la cantidad de objetivos genéticos que se pueden estudiar simultáneamente. Aunque Visium es relativamente nuevo en el mercado, se ha mejorado continuamente en un corto período de tiempo y tiene un gran potencial en la investigación de patología de enfermedades y la traducción clínica.
Los investigadores pueden aprovechar una variedad de tecnologías transcriptómicas espaciales en desarrollo. Es importante considerar no sólo las características técnicas, incluida la resolución espacial, la sensibilidad, la especificidad y el tipo de tejido, sino también factores prácticos como el costo, la compatibilidad con los recursos existentes y el tiempo de respuesta. Los investigadores deben considerar cuidadosamente sus preguntas de investigación y seleccionar técnicas apropiadas que estén estrechamente relacionadas con sus objetivos clínicos y de investigación.
Primera cuenta pública: Plataforma Big Data del Banco Nacional de Genes
Referencia
Zhang Chunlin, et al. Aplicación del análisis del perfil de expresión génica del tejido tumoral en la inmunoterapia tumoral. [J]. China Oncology Press, 2002. Cáncer, 2020, 12(9): 2572.