Factores que afectan el crecimiento celular
. Las células cultivadas a 39 ~ 40 ℃ durante 1 hora pueden dañarse, pero aún pueden recuperarse, pero no pueden soportar un aumento de temperatura de 2 ℃ durante varias horas. Es decir, las células cultivadas a 41 ~ 42 ℃ durante 1 hora estarán seriamente dañadas. dañado, y las células se dañarán gravemente por encima de 43 ℃ Parcialmente muertas. La alta temperatura provoca principalmente la inactivación de enzimas, la destrucción de lípidos, la destrucción de la fisión nuclear, la producción de coagulasa para coagular las células y la desnaturalización de proteínas. Por lo tanto, se deben evitar las altas temperaturas al cultivar células in vitro. Las células pueden encogerse, hincharse y romperse inmediatamente en soluciones hipertónicas o hipotónicas. Por tanto, la presión osmótica es una de las condiciones importantes para el cultivo celular in vitro. El mantenimiento de la presión osmótica en cultivos in vitro de células de tejidos de mamíferos y otros animales está relacionado principalmente con el NaCl, pero no se puede ignorar la relación entre la presión osmótica de otros dieléctricos. La presión osmótica es proporcional al número de moléculas de soluto e iones por unidad de volumen de disolvente. Por tanto, es muy importante controlar el equilibrio iónico en el medio de cultivo según una determinada proporción y mantener la presión osmótica normal. Esto no sólo sirve para mantener la tensión celular, sino también para regular el metabolismo celular. Porque el transporte de iones extracelular y la concentración de iones cambian el transporte de otros nutrientes (como aminoácidos, sacarosa, etc.). ), que afecta directamente a los sistemas sintéticos celulares básicos.
La osmolalidad ideal varía según el tipo celular y la raza. La presión osmótica del plasma humano es de 290 mmol/L, que se considera la presión osmótica ideal de las células humanas fuera del cuerpo. La presión osmótica de las células de mamíferos es generalmente de 290 ~ 300 mmol/L, la de los fibroblastos de pulmón embrionario humano es de 250 ~ 325 mmol/L y la de los fibroblastos de ratón es de aproximadamente 365, 438±00 mmol/L. En aplicaciones prácticas Media , la presión osmótica de 260 ~ 320 mmol/L es adecuada para la mayoría de las células. El cultivo in vitro de células requiere un ambiente gaseoso ideal. El oxígeno y el dióxido de carbono son una de las condiciones necesarias para la supervivencia celular. El oxígeno participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos de las células para producir energía para el crecimiento celular, la proliferación y la síntesis de diversos componentes necesarios. Algunas células pueden obtener energía mediante glucólisis en condiciones anóxicas, pero la mayoría de las células no pueden sobrevivir en condiciones anóxicas. La presión parcial de oxígeno generalmente se mantiene a un nivel ligeramente inferior al de la atmósfera. Si la presión parcial de oxígeno excede el contenido de oxígeno en la atmósfera, puede ser perjudicial para algunas células. Cuando se utiliza cultivo abierto (cultivo en placas de Petri o botellas o placas de cultivo con tapas sueltas), las células generalmente se colocan en un ambiente de gases mixtos de 95% de aire y 5% de dióxido de carbono.
El CO2 no es sólo un producto metabólico de las células, sino también un componente esencial para el crecimiento celular, y está relacionado con el mantenimiento del valor del pH del medio de cultivo. Cuando la concentración de CO2 en la botella cerrada es baja, las células crecen fácilmente. Generalmente no puede ser inferior al 1%, de lo contrario dañará las células. El aumento de CO2 reduce el pH. La mayoría de las células son adecuadas para el crecimiento a un pH de 7,2 ~ pH 7,4. Un pH inferior a 6,8 o superior a 7,6 es perjudicial para las células e incluso puede causar desnaturalización o muerte. Diferentes células tienen diferentes requisitos de pH. Generalmente, las células cultivadas primarias tienen poca tolerancia a los cambios de pH, mientras que las líneas celulares inmortalizadas y las células malignas tienen una alta tolerancia a los cambios de pH. Pero, en general, las células son menos tolerantes a los cambios alcalinos que a los ácidos, y las condiciones ácidas son más propicias para el crecimiento celular que los ambientes alcalinos. Durante el crecimiento celular, a medida que aumenta el número de células y se intensifica la actividad metabólica, se libera continuamente CO2, lo que hace que el medio de cultivo se vuelva ácido y el valor del pH cambie. Por lo tanto, para mantener un pH constante del entorno de cultivo, normalmente se añade a la solución de cultivo una solución tampón como fosfato.
NaHCO3 en tampón fosfato puede suministrar CO2, pero el CO2 se escapa fácilmente y sólo es adecuado para cultivos cerrados. Si es un cultivo abierto, lo mejor es colocarlo en un ambiente gaseoso que contenga un 5% de CO2. Para superar el problema de ajustar el NaHCO3_3, también se puede utilizar ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-etanosulfónico (Hepes), que no es tóxico para las células y no tiene efecto tampón. Su función principal es evitar cambios drásticos en el valor del pH y mantener un valor de pH relativamente constante al abrir botellas para cultivo de aireación u observar células vivas. (1) Luz visible
La longitud de onda de la luz visible está entre 3900 ~ 7800. Las energías luminosas de varios colores de la luz visible pueden provocar la degeneración celular, prolongar el intervalo entre divisiones nucleares y reducir significativamente la capacidad de las células para adherirse a la pared. Por lo tanto, las células cultivadas in vitro deben mantenerse alejadas de la luz solar directa y es mejor cultivarlas en un lugar oscuro o almacenarlas durante un corto período de tiempo.
(2) Luz ultravioleta
Bajo una luz ultravioleta débil, las células con fuerte tolerancia no cambiarán mucho, pero será perjudicial para las células sensibles. Cuando los rayos ultravioleta son fuertes, las células recién aisladas no pueden sufrir una mitosis completa; la sinéresis aumenta durante la mitosis y la espuma citoplasmática disminuye durante la mitosis; Después de que las células cancerosas de la ascitis de Elrlich fueran irradiadas con luz ultravioleta y observadas con un microscopio ultravioleta de punto volador, se formaron ampollas en la superficie irradiada, y luego las células se expandieron y el daño se volvió cada vez más grave.
(3) Radiación
Los rayos X causan daños evidentes en las células. Los rayos beta afectan la división de los núcleos celulares. Los rayos gamma reducen el número de mitosis, lo que provoca mitosis anormales y, por tanto, muerte celular.
(4) Ultrasonido y vibración
Bajo la vibración ultrasónica, las células pronto se romperán. Al principio, el citoplasma fluirá desordenadamente y los nódulos de procolágeno también sufrirán cambios obvios. la vibración ultrasónica se reanude. La causa de la muerte celular se debe a la cavitación. Cuando la onda ultrasónica es de 2,5 W/cm2, las células se dañan, los cromosomas se distorsionan y los cromosomas nucleares son los primeros en distorsionarse. En el cultivo celular in vitro, el número de siembras celulares afecta el crecimiento celular. Una densidad de siembra adecuada puede promover la proliferación celular, mientras que una densidad de siembra demasiado baja o demasiado alta no favorece el crecimiento y la proliferación celular. Si la proporción de volumen de medio de cultivo a células es superior a 2000:1, la proporción de sustancias de crecimiento dispersadas fuera de las células será menor que la concentración mínima. En este momento, las células ya no podrán proliferar y el pH en el medio de cultivo. se vuelve alcalino, inhibiendo el crecimiento celular. Las células se vuelven redondas y no pueden adherirse a la pared, pudiendo incluso provocar la muerte celular. Si la densidad de inoculación es demasiado alta, el volumen de líquido de cultivo alrededor de cada célula caerá por debajo de 0,007 mm3 y la concentración de sustancias endógenas en las células aumentará debido a la reducción de la tasa de dispersión, que puede saturar fácilmente contaminantes u otros productos metabólicos. , y la fuente de energía se agota rápidamente y por tanto inhibe la proliferación celular.
La forma de elegir la concentración de inóculo adecuada debe determinarse en función del metabolismo celular, la velocidad de crecimiento y reproducción y las necesidades de trabajo. En términos generales, la concentración de inoculación de células con un fuerte metabolismo celular y una tasa de crecimiento rápida, como las células tumorales, debe ser baja; mientras que las células del tejido normal crecen lentamente y tienen un metabolismo insuficiente, la concentración de inoculación puede ser alta si es para la conservación de especies; o uso de emergencia, la concentración de inoculación puede ser menor. A veces, para observar la estructura morfológica de las células, la concentración de inoculación se puede reducir adecuadamente.
7. Velocidad de rotación del contenedor y velocidad de agitación de la suspensión
A veces, por necesidades de investigación, las células cultivadas se rotan o se agitan en el contenedor, como las células adherentes cultivadas en tubos giratorios. lo que aumenta la velocidad de rotación del tambor y la tasa de proliferación celular. La razón puede ser que la rotación de cultivos permite un mayor flujo y oxidación de nutrientes adecuados.
Cuando las células se cultivan con agitación en suspensión, la velocidad de agitación no debe ser ni demasiado rápida ni demasiado lenta. Si es demasiado lento, las células se agruparán, se hundirán y se adherirán fácilmente a la pared, lo que no favorece la proliferación de células suspendidas. Si es demasiado rápido, burbujeará fácilmente y las células se asfixiarán y morirán fácilmente. Al mismo tiempo, una fuerte agitación puede provocar fácilmente que las células se rompan debido a daños mecánicos. Por tanto, es muy importante elegir la velocidad de mezclado adecuada. Por ejemplo, la velocidad de agitación de BHK21 es de 460 ~ 330 rpm; la cepa de linfocitos (Raji) no aumenta ni disminuye a 200 rpm y 400 rpm, pero crece cuando la velocidad de agitación aumenta a 600 rpm. Los linfocitos (Namalva) crecen rápidamente, no se agrupan a 80 ~ 100 r/min y aún así crecen rápidamente. La velocidad de agitación adecuada para varias celdas es diferente, lo que generalmente está relacionado con las características y la calidad de las celdas, así que preste atención.