Propiedades físicas y químicas del colágeno
Referencia del espectro infrarrojo del colágeno.
El colágeno es un anfolito que depende de dos factores. En primer lugar, cada cadena peptídica de colágeno tiene muchos grupos laterales ácidos o básicos; en segundo lugar, cada cadena peptídica tiene grupos α-carboxilo y α-amino en ambos extremos, los cuales tienen la capacidad de aceptar o donar protones. Dentro de rangos de pH específicos, pueden disociarse para producir cargas positivas o negativas. Es decir, dependiendo del pH del medio, distintos colágenos se convierten en iones con muchas cargas positivas o negativas. El valor de pKa del grupo lateral de la cadena peptídica de colágeno es ligeramente diferente del grupo lateral de sus aminoácidos constituyentes, lo que se debe a la influencia de cargas adyacentes en la molécula de proteína. El punto isoeléctrico es 7,5 ~ 7,8, que es débilmente alcalino, porque la cadena peptídica del colágeno tiene más aminoácidos básicos que aminoácidos ácidos. Por ser un polímero, tiene propiedades coloidales y tiene cierta viscosidad en solución acuosa. La viscosidad es más baja en el punto isoeléctrico y cuanto menor es la temperatura, mayor es la viscosidad.
La viscosidad de las soluciones de colágeno con diferentes distribuciones de pesos moleculares está relacionada con la concentración de soluto, disolvente, pH, temperatura y electrolitos externos. La viscosidad de la solución de colágeno es mínima en el punto isoeléctrico. Cuando el pH es inferior o superior al punto isoeléctrico, tanto el colágeno como los péptidos se cargan y la viscosidad de la solución aumenta en consecuencia. Cuanto más lejos del punto isoeléctrico, mayor será la viscosidad de la solución. La viscosidad de las soluciones de colágeno y péptidos con diferentes distribuciones de pesos moleculares disminuye al aumentar la temperatura. Cuanto mayor sea el peso molecular y la concentración de colágeno, mayor será la viscosidad de la solución. La viscosidad de las soluciones de colágeno de alto peso molecular aumenta exponencialmente al aumentar la concentración, mientras que la viscosidad de las soluciones de colágeno de bajo peso molecular aumenta aproximadamente linealmente al aumentar la concentración. Agregar electrolitos a las soluciones de colágeno y péptidos aumenta significativamente su viscosidad.
El hidrolizado de colágeno contiene una variedad de aminoácidos, de los cuales la glicina es el más abundante. Seguido de alanina, ácido glutámico, arginina, cisteína, triptófano, tirosina, metionina y otros aminoácidos esenciales son bajos en contenido, por lo que el colágeno es una proteína incompleta. El producto peptídico obtenido al hidrolizar colágeno de piel de cerdo contiene 19 tipos de aminoácidos, incluidos 7 aminoácidos esenciales para adultos y 2 aminoácidos semiesenciales para niños. El contenido total de aminoácidos llega a más del 90%. Seis de los ocho aminoácidos esenciales son isoleucina (Ile) 1,21%, leucina (Leu) y fenilalanina (Phe) 4,89%, valina (Val) 2,95%, treonina (Thr) 1,95%, lisina (lisina).
El colágeno tiene un peso molecular relativo grande y hay tres bandas nadadoras en el patrón de electroforesis. Las dos bandas nadadoras de alrededor de 100 kD son la cadena α1 y la cadena α2 de moléculas de colágeno, y la primera banda nadadora de alrededor de 200 kD es la cadena β de moléculas de colágeno. Es decir, el peso molecular relativo de cada cadena polipeptídica de colágeno puede alcanzar 100 kD, y el peso molecular relativo de 1 molécula de colágeno es 300 kD. SDS-PAGE, cromatografía en gel y espectrometría de masas se utilizan comúnmente para determinar el peso molecular de los péptidos. La distribución del peso molecular del hidrolizado de colágeno en restos de cuero descromado medida mediante cromatografía de filtración en gel es de aproximadamente 16,1 KD. La distribución del peso molecular de los oligopéptidos de colágeno de la piel del lenguado medidos mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo se concentra principalmente en 0,6 ~ 1,8 KD. El peso molecular de los péptidos de colágeno hidrolizados por proteasas animales es de 2 ~ 7 KD, que es más amplio que el peso molecular de los péptidos de colágeno hidrolizados por proteasas vegetales.
La estabilidad térmica del colágeno se refiere a medir la temperatura de contracción térmica (Ts) de sus fibras en un sistema de agua o la temperatura de desnaturalización térmica (Td) de sus moléculas en solución. La diferencia entre Ts y Td es generalmente de 20 ~ 25 ℃ y el valor de Ts es más fácil de determinar que el valor de Td. Td también puede indicar la temperatura a la que se destruyen las hélices de colágeno, y también está relacionada con el contenido de sus iminoácidos (prolina e hidroxiprolina), especialmente el contenido de hidroxiprolina, que se correlaciona positivamente. Los peces de agua fría tienen el contenido más bajo de hidroxiprolina, por lo que el valor de colágeno Td de los peces de agua fría es significativamente más bajo que el de los peces de agua cálida, y ambos son más bajos que los de los animales terrestres.
Sin embargo, en comparación con el colágeno de piel de pescado, la Td dérmica del colágeno de piel de pescado es aproximadamente 65438 ± 0 °C menor que la del colágeno muscular, lo que está relacionado con el hecho de que la tasa de hidroxilación de la prolina en el colágeno muscular es mayor que la del colágeno dérmico. colágeno. Se determinó la composición de aminoácidos de diversos colágenos solubles en la piel de pescado y se comparó con la de la piel de bovino. Se descubrió que el contenido de hidroxiprolina, prolina y otras iminas en el colágeno de la piel de pescado es menor que el del colágeno de la piel bovina. Además, la gelatina de piel de pescado tiene una viscosidad intrínseca y una temperatura de desnaturalización térmica más bajas en comparación con la gelatina de piel de vaca.
La temperatura de desnaturalización térmica del colágeno se puede determinar midiendo el cambio en la viscosidad específica de la solución de colágeno. El método consiste en disolver la muestra de colágeno en una determinada cantidad de solución tampón, preparar una solución con una determinada concentración y luego utilizar un viscosímetro Ubbelohde para mantenerla en un determinado rango de temperatura, medir la viscosidad específica de la solución y trazar la Curva de viscosidad específica versus temperatura. Cuando la viscosidad específica cambia en un 50%, la temperatura correspondiente es la temperatura de desnaturalización térmica. La temperatura de desnaturalización térmica también se puede determinar mediante espectroscopia Raman y calorimetría diferencial de barrido. Se determinó que las temperaturas de desnaturalización térmica del colágeno de la piel de lubina, carpa cruciana y carpa cabezona fueron de 25°C, 27°C y 30°C respectivamente, las temperaturas de su hábitat fueron de 26~27°C, 29°C y 32°C respectivamente, y su contenido de iminoácidos fue del 17,2%, 18,1% y 18,6% respectivamente. Las temperaturas de desnaturalización térmica de los tres tipos de colágeno de piel de pescado son consistentes. El colágeno tipo ⅱ y el colágeno tipo ⅶ están compuestos por tres cadenas peptídicas α1, a saber, [α1(ⅱ)]3. Son ricos en hidroxilisina, tienen una alta tasa de glicación y un contenido de azúcar de hasta el 4%. Son el principal colágeno del cartílago. Además, las temperaturas de deformación térmica del colágeno en la piel y en los huesos pueden diferir incluso dentro del mismo organismo. Por ejemplo, la temperatura de desnaturalización del colágeno de la lubina japonesa, la caballa, la carpa cabezona y el pez globo es de 25,0 a 26,5 ℃, mientras que la temperatura de desnaturalización del colágeno óseo es de 29,5 a 30,0 ℃. Una conclusión incidental es que el rango de temperatura de desnaturalización del colágeno óseo es en general más alto que el del colágeno de la piel. Además, la solubilidad del colágeno en el hueso y la solubilidad del colágeno en la piel son diferentes a diferentes valores de pH, lo que muestra que existen diferencias en las características moleculares y la configuración del colágeno en la piel y el hueso.
Como biopolímero, el colágeno no es muy fuerte. Los estudios han demostrado que la fuerza del gel de colágeno es casi proporcional al cuadrado de su concentración, y la fuerza se puede medir con un medidor de fuerza del gel.
Nota especial: La gelatina, el colágeno y el colágeno hidrolizado son diferentes. La gelatina es un producto desnaturalizado del colágeno a altas temperaturas, con componentes complejos y una amplia distribución de pesos moleculares relativos. Dado que el colágeno se desnaturaliza a altas temperaturas, la estructura de triple hélice de la molécula de colágeno se destruye, pero aún puede haber algunas cadenas helicoidales de cadena alfa, por lo que se puede gelificar una solución de gelatina de una cierta concentración. Ampliamente utilizado en la industria alimentaria, la fotografía y la industria farmacéutica. Se informa que de los productos de gelatina que se producen a nivel mundial cada año, el 65% se utiliza en la industria alimentaria, el 20% en la industria fotográfica y el 65.438+00% se utiliza en la industria farmacéutica. El colágeno hidrolizado se obtiene hidrolizando colágeno o gelatina con proteasas a altas temperaturas. Debido al doble efecto de la temperatura y las enzimas, el peso molecular relativo del colágeno hidrolizado es menor que el de la gelatina. Dado que la hidrólisis de los enlaces peptídicos de colágeno mediante proteasa a altas temperaturas es aleatoria, la composición de la solución de proteína hidrolizada también es muy compleja y es una mezcla de péptidos proteicos con pesos moleculares relativos que varían desde varios miles hasta decenas de miles. El colágeno hidrolizado tiene cierto mercado en el desarrollo de complementos nutricionales y químicos diarios debido a su pequeño peso molecular y fácil degradación. El colágeno hidrolizado se puede utilizar en medios de cultivo de fermentación biológica y también se puede utilizar como aditivo nutricional alimentario rico en proteínas para reemplazar la harina de pescado importada para la producción de piensos mixtos y compuestos. El colágeno, la gelatina y el colágeno hidrolizado son homólogos pero tienen estructuras y propiedades muy diferentes. El colágeno conserva su estructura helicoidal natural única y es significativamente superior a la gelatina y al colágeno hidrolizado en algunos aspectos. Por ejemplo, el rendimiento hemostático de la esponja hemostática de colágeno es mejor que el de la esponja de gelatina. Sin embargo, si el colágeno de pescado utilizado como clarificador se desnaturaliza, su capacidad de sedimentación se reducirá significativamente. Sin embargo, la comprensión que las personas tienen sobre estas tres sustancias suele ser confusa, pensando que tienen las mismas propiedades, o incluso pensando que son la misma sustancia.
El colágeno hidrolizado y los péptidos de colágeno también son diferentes y, a grandes rasgos, pueden considerarse una relación macroscópica y microscópica. Las moléculas de colágeno se hidrolizan principalmente para formar péptidos de colágeno con pesos moleculares relativamente pequeños. Debido a la estructura única de triple hélice del colágeno, sus propiedades son muy estables y no pueden descomponerse mediante temperaturas de procesamiento ordinarias o calentamiento a corto plazo, lo que dificulta su digestión, absorción y utilización total por el cuerpo humano. Después de la hidrólisis, su tasa de absorción y utilización se puede mejorar enormemente y puede promover la absorción de otras proteínas en los alimentos.
Los péptidos de colágeno no solo contienen grupos carboxilo y amino terminales no condensados en ambos extremos de la cadena peptídica, sino que también contienen ε-NH2 de Lys y -COOH de Asp y Glu en la cadena lateral. Los péptidos de colágeno son completamente solubles en agua (también se pueden disolver en agua fría). La solución acuosa tiene baja viscosidad y es fluida en una alta concentración del 60%. Tiene buena resistencia a ácidos y álcalis y no precipita en presencia de ácido. y álcali Tiene buena resistencia a altas temperaturas, 200 No precipita cuando se calienta a ℃ y tiene buena absorción de aceite, formación de espuma y absorción de agua. La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos conectados por enlaces peptídicos en una molécula de proteína. Cada molécula de proteína tiene su composición y disposición de aminoácidos específica, lo que determina su diferente estructura espacial y función. Los cambios en los aminoácidos en partes clave de la estructura primaria de una molécula de proteína afectarán directamente su función, y esta parte clave es el centro activo de la molécula de proteína. Se han descubierto y probado más de 30 tipos de colágeno.
En general, las proteínas tienen una estructura de doble hélice, y el colágeno, como proteína estructural de la matriz extracelular (MEC), está compuesto por tres cadenas polipeptídicas con una estructura de triple hélice, o dominios de colágeno, es decir , tres Cada cadena polipeptídica es zurda, formando una estructura helicoidal zurda, y luego forma una fuerte estructura superhélice diestra a través de enlaces de hidrógeno. Las exclusivas cadenas A de colágeno de mano izquierda se entrelazan para formar una estructura helicoidal compuesta de colágeno de mano derecha, que se denomina segmento helicoidal. La característica más importante del segmento de hélice es que los aminoácidos se organizan periódicamente en (Gly-X-Y)n, en el que las posiciones X e Y son prolina (PrO) e hidroxiprolina (Hyp), que son aminoácidos únicos del colágeno, que representan alrededor del 25%, el contenido más alto entre todos los tipos de proteínas. La hidroxilisina (Hyl) del colágeno no se encuentra en otras proteínas. No participa en la biosíntesis de colágeno en forma preparada, sino que se convierte de prolina (Pro) en la cadena peptídica de colágeno sintetizada por la hidroxilasa. El contenido de hidroxiprolina y ácido piroglutámico en las proteínas de los mamíferos terrestres es muy pequeño. En comparación con los animales terrestres, el colágeno de los animales acuáticos contiene menos prolina e hidroxiprolina, y la metionina que contiene azufre (Met) es mucho más que la de los animales terrestres.
La estructura primaria es la secuencia de aminoácidos que constituye la cadena polipeptídica de colágeno; la molécula de colágeno está compuesta por tres cadenas polipeptídicas de hélice izquierda (estructura secundaria), que se entrelazan entre sí para formar una hélice derecha alrededor del eje molecular central (estructura terciaria); la molécula de colágeno completa mide aproximadamente 280 nm de largo y 65438 ± 0,5 nm de diámetro; En la estructura bidimensional de las fibras de colágeno tipo I (patrón de difracción de rayos X de ángulo pequeño y micrografía electrónica de transmisión), las moléculas de colágeno se cruzan con otra molécula de colágeno a una o más distancias 4 D, D representada en el ángulo pequeño X- patrón de difracción de rayos La distancia de repetición fundamental vista o la distancia de repetición vista en micrografías electrónicas. Debido a que la longitud de las moléculas de colágeno es de aproximadamente 4,4 D, el entrelazado de las moléculas de colágeno da como resultado un área de plegado de aproximadamente 0,4 D y un área de defecto de aproximadamente 0,6 D.
Los contenidos de glicina (Gly), alanina (Ala), prolina (Pro) y ácido glutámico (Glu) en el colágeno son relativamente elevados, especialmente la glicina, que representa aproximadamente la cantidad total de aminoácidos. 27% de , también se ha reportado que representa 65,438+0/3, es decir, hay una glicina por cada dos residuos de aminoácidos (x, y), por lo que está disponible su cadena peptídica (Gly-). Cada molécula de procolágeno consta de tres cadenas peptídicas α. La propia cadena peptídica α tiene una estructura helicoidal α. Uno de cada tres residuos de aminoácidos de la cadena peptídica pasa por el área central de las tres hélices. El espacio aquí es muy estrecho. Sólo la glicina es adecuada para esta posición, lo que explica la aparición de cada dos residuos de aminoácidos en su composición de aminoácidos. Tenga en cuenta en particular que tanto X como Y representan cualquier aminoácido, excepto que X suele ser. La prolina y la Y suelen ser hidroxiprolina. También contiene una pequeña cantidad de residuos de 3-hidroxiprolina y 5-hidroxilisina (Hyl) que pueden estabilizar las moléculas de colágeno formando enlaces de hidrógeno intramoleculares, entrecruzando tres cadenas α mediante fuerzas de van der Waals, enlaces de hidrógeno. y enlaces de valencia. -Las cadenas peptídicas están enrolladas en una estructura de triple hélice de "cuerda de paja" en forma de hélices paralelas y derechas, lo que le da al colágeno una alta resistencia a la tracción.