Introducción al método de prueba de endotoxinas bacterianas
Contenido 1 Pinyin 1.1 Preparación de la prueba 1.2 Revisión de la sensibilidad del reactivo de Limulus 1.3 Prueba de interferencia del artículo de prueba 1.4 Método de inspección 1.5 Juicio del resultado 1 Pinyin
xì jun1 nèi dú sù jiǎn chá fǎ
Este método es un método que utiliza el mecanismo de reacción de aglutinación entre el reactivo de Limulus y la endotoxina bacteriana para determinar si la concentración de endotoxina bacteriana en la muestra de prueba cumple con las regulaciones. La cantidad de endotoxina se expresa en unidades de endotoxina (UE).
La cepa estándar nacional de endotoxina bacteriana es la endotoxina extraída y refinada de Escherichia coli. Basado en el estándar internacional de endotoxina bacteriana, el significado de la unidad es consistente con el del estándar internacional mediante calibración colaborativa. El estándar nacional de endotoxina bacteriana se utiliza para calibrar el estándar de trabajo de endotoxina bacteriana y calibrar y arbitrar la sensibilidad del reactivo de Limulus.
La cepa estándar de trabajo de endotoxina bacteriana se calibra basándose en el estándar nacional de endotoxina bacteriana para determinar su potencia equivalente en peso. La potencia de cada estándar de trabajo de 1ng debe ser no inferior a 2 EU ni superior a 50 EU, y debe tener datos experimentales de uniformidad y estabilidad. El estándar de trabajo de endotoxina bacteriana se utiliza en la determinación de la sensibilidad del reactivo de Limulus y como control positivo en la prueba.
1.1 Preparación de la prueba
Los utensilios utilizados en la prueba deben procesarse para eliminar posibles endotoxinas exógenas. El método comúnmente utilizado es el horneado en seco a 250 ℃ o 180 ℃ durante un tiempo adecuado. También se pueden utilizar otros métodos adecuados. El proceso de operación de la prueba debe evitar la contaminación microbiana. 1.2 Revisión de la sensibilidad del reactivo de Limulus
De acuerdo con el valor indicado de la sensibilidad del reactivo de Limulus (λ<[b]>), disolver el estándar nacional de endotoxina bacteriana o el estándar de trabajo con la prueba de endotoxina bacteriana agua ① y colóquela en un vórtice. Mezcle en la mezcladora durante 15 minutos y luego prepare una concentración de dilución adecuada de 2 veces, es decir, 2λ<[b]>, λ<[b]>, 0,5λ<[b] ]> y 0,25λ<[b]> para uso posterior. Cada paso de dilución debe mezclarse en un mezclador vórtex durante 30 segundos y probarse según el elemento "Verificar método". Para cada dilución, se deben realizar 4 tubos en paralelo. Si los 4 tubos con la concentración más alta son todos positivos y los 4 tubos con la concentración más baja son todos negativos, presione La siguiente fórmula calcula el valor de medición de sensibilidad del reactivo de Limulus (λ<[c]>).
ΣX λ<[c]>＝log<1>───
4
La endotoxina bacteriana solo se puede utilizar cuando λ<[c]> está entre 0,5 y 2,0λ<[b]> (incluidos 0,5λ<[b]> y 2,0λ<[b]>) Verificar y utilice λ<[b]> como sensibilidad de este lote de reactivo de lisado. Se debe verificar la sensibilidad de cada nuevo lote de reactivo LAL antes de usarlo en las pruebas. 1.3 Prueba de interferencia del producto de prueba
De acuerdo con la prueba en "Revisión de sensibilidad del reactivo Lulu", use la dilución efectiva máxima del producto de prueba para elaborar el estándar nacional o el estándar de trabajo de endotoxina bacteriana 2.0λ<[ b] >, λ<[b]>, 0,5λ<[b]>, 0,25 λ<[b]> dilución de concentración. El factor de dilución efectivo máximo (D) del producto de prueba se calcula según la siguiente fórmula:
D＝L/λ<[b]> L es el límite de endotoxinas bacterianas del producto de prueba, UE/ ml.
Si la sensibilidad del reactivo LAL (λ<[c]>) medida con y sin el producto de prueba está entre 0,5 y 2,0λ<[b]> (incluidos 0,5λ<[b]> y 2,0λ<[b]>), se considera que la muestra de prueba no interfiere con la prueba a esta concentración; de lo contrario, la prueba debe repetirse después del tratamiento adecuado. Usar un reactivo de lisado más sensible y diluir la muestra de prueba en un múltiplo mayor es un método simple y eficaz para eliminar los factores que interfieren.
1.4 Método de inspección
Tome 4 tubos de ensayo de 10 × 75 mm que contengan 0,1 ml de solución de reactivo de Limulus (o ampollas originales de reactivo de Limulus de 0,1 ml por tubo) y agregue 0,1 ml de muestra de prueba a 2 de ellos como suministro. tubos de ensayo, agregue 0,1 ml de solución estándar de trabajo de endotoxina 2λ<[b]> a un tubo como tubo de control positivo y agregue 0,1 ml de agua de prueba de endotoxina bacteriana ① a un tubo como tubo de control negativo. Después de mezclar suavemente la solución en el tubo de ensayo, selle la boca del tubo, colóquelo verticalmente en un baño de agua a 37 ± 1 °C y manténgalo caliente durante 60 ± 2 minutos. Durante el aislamiento y manipulación de los tubos de ensayo se deben evitar vibraciones que puedan provocar resultados falsos negativos. 1.5 Juicio de los resultados
Saque con cuidado el tubo de ensayo del baño de agua e inviértalo lentamente 180°. Si el gel del tubo no se deforma ni se desliza de la pared del tubo, se considera positivo y se registra. como (+); si el gel no se deforma, se registrará como (+); los que quedan intactos y se desprenden de la pared del tubo son negativos y se registran como (). Si ambos tubos de la muestra de prueba son (), se debe considerar que cumplen con la normativa; si ambos tubos son (+), se debe considerar que no cumplen con la normativa si uno de los dos tubos es (+); y el otro es (), siga el método anterior Tome otros 4 tubos de producto de prueba para volver a realizar la prueba. Si 1 de los 4 tubos es (+), se considera que no cumple. Si el control positivo es () o el control negativo es (+), la prueba no es válida.