Receptores de la superficie de las células tumorales
Principios del cultivo
1. Citocinas para cultivo de DC:
NGM-CSF (Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos):
GM -El LCR es un factor de crecimiento hematopoyético que puede estimular la formación de colonias de neutrófilos y macrófagos in vitro, y tiene el efecto de promover la proliferación y el desarrollo de eritromegacariocitos y eosinófilos tempranos. GM-CSF es una de las primeras citocinas identificadas por tener un efecto sobre las países en desarrollo.
El papel del GM-CSF en el cultivo de DC es promover la diferenciación de monocitos en células similares a macrófagos y aumentar la expresión de moléculas MHC de clase II en la superficie celular, mejorando así la función presentadora de antígenos de la célula. . Además, GM-CSF también puede promover la supervivencia de las CD.
Interleucina 4
La función de la IL-4 en la inducción de que los monocitos entren en CD es inhibir el crecimiento excesivo de macrófagos, guiando así a los monocitos a diferenciarse en CD. Si no se añade IL-4 al sistema de cultivo, los monocitos se diferenciarán en macrófagos. Al mismo tiempo, la IL-4 también puede reducir la expresión de las moléculas CD14 en la superficie celular. La disminución del nivel de expresión de CD14 es un marcador importante para la diferenciación de monocitos en CD.
GM-CSF e IL-4*** pueden diferenciar los monocitos en CD (CD inmaduras). En este momento, las CD tienen fuertes capacidades de absorción y procesamiento de antígenos, pero capacidades de presentación de antígenos débiles. Las moléculas II y las moléculas de la familia B7 (CD80, CD86, etc.) se expresan moderadamente en la superficie celular, pero no se expresa CD14
Factor de necrosis tumoral-α
TNF -. a puede regular negativamente la macropinocitosis de las CD inmaduras y la expresión de los receptores Fc de superficie, provocando la desaparición del compartimento MHC clase II. Sin embargo, el TNF-α puede regular positivamente las moléculas MHC clase y clase II, así como las moléculas de la familia B7 (CD80, CD86, ). etc.). expresión) en la superficie celular y diferenciar las CD inmaduras en CD maduras. En este momento, la capacidad de absorción y procesamiento de antígenos de las CD está significativamente debilitada, mientras que la capacidad de presentación de antígenos es significativa.
2. Citoquinas y anticuerpos. Cultivo CIK:
Anticuerpo monoclonal estimulado por NCD3:
La primera señal para la activación de las células T proviene del receptor en la superficie de las células T, el receptor de antígeno de las células T (TCR) Unión específica al antígeno presentado por APC, es decir, reconocimiento específico del antígeno por parte de las células T. TCR es un heterodímero compuesto por dos cadenas peptídicas diferentes. En la superficie de las células T, las moléculas de TCR y CD3 se combinan mediante enlaces no valentes para formar un complejo TCR/CD3. Una vez que el TCR reconoce el antígeno específico, provocará la acumulación de la cola citoplasmática de las moléculas CD3, CD4 o CD8 en la superficie de las células T, activando así las tirosina quinasas (Lck, Fyn, ZAP-70, etc.) para conectarse al antígeno citoplasmático. cola y promover CD3 Fosforilación de tirosina (Y) en el motivo de activación basado en tirosina del inmunorreceptor (ITAM) en la región citoplasmática de la molécula. La tirosina fosforilada (pY) fosforila aún más las proteínas que contienen tirosina, provocando así una cascada de activación de quinasas (vía del fosfatidilinositol o vía de la MAP quinasa, etc.). Finalmente, al activar factores de transcripción, ingresa al núcleo. Proliferación y activación de células T (como IL-2, IFN-g), que da como resultado la expresión y transcripción génica, lo que hace que las células T cambien de un estado inactivo a un estado proliferativo y activado.
Como se puede observar en lo anterior, la molécula CD3 desempeña un papel extremadamente crítico en la transducción de señales de activación de células T. Cuando un anticuerpo monoclonal activador de CD3 se une específicamente a la molécula CD3 en la superficie de las células T, la tirosina en el motivo ITAM en la región citoplasmática de la molécula CD3 puede fosforilarse, lo que lleva a la activación de señales posteriores para la proliferación de células T y activación, por lo tanto proliferan y activan las células T. En otras palabras, los anticuerpos monoclonales activados por CD3 pueden simular el proceso de reconocimiento y activación de antígenos y complejos TCR/CD3, provocando así la proliferación y activación de células T y, por lo tanto, son factores estimuladores indispensables en el cultivo de células CIK.
Además, al seleccionar anticuerpos monoclonales activados por CD3, asegúrese de prestar atención al número de clon. Los estudios han demostrado que sólo el anticuerpo monoclonal activado por CD3 clonado como OKT-3 puede estimular la proliferación de todas las células T humanas, mientras que otros anticuerpos monoclonales activados por CD3 sólo pueden estimular algunas células T humanas. Por lo tanto, en el cultivo CIK, es mejor seleccionar clones de OKT-3 para garantizar que las células T de cada paciente puedan activarse.
Interleucina-2
Cuando se descubrió por primera vez la IL-2, se la llamó factor de crecimiento de células T (TCGF) y es el factor más importante que provoca la proliferación de células T. citocinas. La IL-2 no es sólo una citocina autocrina sino también una citocina paracrina. La IL-2 se une específicamente al receptor de IL-2 (IL-2R) en la superficie de las células T, activando las células T y entrando en un estado de división celular. Además, la IL-2 también puede estimular el crecimiento de las células NK y mejorar su capacidad de destrucción. Por lo tanto, se debe agregar IL-2 al cultivo de células CIK para promover la proliferación y activación de las células T.
El interferón-g
El IFN-g puede regular positivamente la expresión de IL-2R en la superficie de los linfocitos de sangre periférica, mejorando así la sensibilidad y la intensidad de las células T a la IL-2. 2 proliferación inducida. Agregar IFN-g durante la inducción de la formación de células CIK puede reducir la dosis de IL-2. Se encontró que el orden de adición de IFN-g estaba estrechamente relacionado con la citotoxicidad de CIK. Agregar primero IFN-g y luego agregar IL-2 después de 24 horas de cultivo puede mejorar significativamente la citotoxicidad de CIK.
La interleucina-1a
La IL-1a también puede mediar en la regulación positiva de la expresión de IL-2R en la superficie de los linfocitos de sangre periférica. Cuando la IL-1a se combina con IFN-g y el anticuerpo monoclonal CD3 activado, la citotoxicidad de CIK puede aumentar significativamente.
Preparación celular
1. Recoger células mononucleares de sangre periférica.
1.1 Recoger 80-100 ml. Utilice un separador de células sanguíneas para separar las células mononucleares de sangre periférica del propio paciente. ;
Utilice la solución de separación de linfocitos 1.2 para purificar aún más las células mononucleares (PBMC) mediante centrifugación en gradiente de densidad.
Lavar el medio libre de suero dos veces con 1,3 para obtener PBMC con una pureza superior al 90%, y el número de células debe alcanzar 1-3×108.
2. (Paso opcional) Preparación de antígenos tumorales
El antígeno tumoral utilizado para cargar DC puede ser un antígeno específico de tumor (TSA) o un antígeno asociado a tumor (TAA), o Puede ser un antígeno de célula entera tumoral.
Las CD cargadas con TSA o TAA tienen buenas propiedades de focalización, pero este método tiene algunas desventajas, como una pequeña cantidad de antígenos o péptidos antigénicos específicos del tumor, y un ataque inmunológico con un solo antígeno a menudo no puede matar. células tumorales. La carga de CD con antígenos de células tumorales completas puede superar estas deficiencias, porque no es necesario saber qué antígenos son TSA o TAA de las células tumorales. Múltiples antígenos tumorales diferentes en el antígeno completo pueden inducir linfocitos T citotóxicos dirigidos a diferentes determinantes antigénicos (CTL). ) clonación para lograr la destrucción eficaz de células tumorales.
Existen muchos métodos para cargar DC con antígenos de células tumorales, incluida la carga de DC con lisado de células tumorales, la carga de DC con células tumorales apoptóticas, la carga de DC con células tumorales necróticas o muertas, la carga de DC con células tumorales vivas, y cargar DC con células tumorales y DC Fusion, etc. Actualmente, el lisado de células tumorales se usa comúnmente para cargar DC en la práctica clínica porque este método es simple, rápido y efectivo.
La congelación y descongelación repetidas es un método común para obtener lisado de células tumorales. Los pasos específicos son los siguientes:
2.1 Extirpación quirúrgica de muestras tumorales y extirpación de tejido necrótico y tejido paracanceroso. en condiciones estériles Tejido tumoral;
2.2 Enjuague 3 veces con solución salina estéril;
2.3 Corte el tejido tumoral con tijeras para tejidos estériles, agregue medio de cultivo RPMI 1640 y muela bien;
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2. Recoger la suspensión de células individuales filtrándolas a través de una malla estéril de malla 4200.
2.5 Utilice RPMI 1640 para resuspender las células y cultivarlas a 1-2×107/ml, y colocarlas. en un tubo de criopreservación estéril de 5 ml;
2.6 Sumerja el tubo criogénico en nitrógeno líquido para congelarlo rápidamente, sáquelo después de 10 minutos y luego colóquelo rápidamente en un baño de agua a 37 °C para descongelarlo. 10 minutos. Repita de 3 a 5 veces;
Nota: La congelación y descongelación también se puede repetir de 3 a 5 veces a -80 ℃/37 ℃.
2.7 Añadir el lisado tumoral al tubo de centrífuga a 3000 rpm y centrifugar durante 65.438±00 minutos.
2.8 Recoger el sobrenadante, filtrar y esterilizar con membrana filtrante de 0,22 mm; y recoger la muestra Detectar contenido de proteínas y bacterias, hongos y micoplasmas
2,9-80 grados centígrados para su uso posterior;
3.Cultivo e identificación3.
Células CIK
3.1 Utilizar medio de cultivo libre de suero para ajustar las PBMC obtenidas en el paso 1 a 2×106 células/ml y colocarlo en un frasco de cultivo;
5% a 3,237°C Incubar en una incubadora de CO2 durante 2 horas para permitir que los monocitos se adhieran;
3.3 Recoger las células suspendidas y ajustar la concentración celular a 1-2x 106/ml con medio sin suero;
3.4 Añadir 1 000 U/ml de IFN-g humano recombinante para cultivo.
3.5 Después de 24 horas, añadir 50 ng/ml de anticuerpo monoclonal CD3 y 300 U/ml de IL-2 humana recombinante para estimular; el crecimiento y la proliferación de células CIK.
Nota: En este momento también se pueden añadir 100 U/ml de IL-1a humana recombinante.
3.6 Cambiar el medio o ampliar el frasco cada tres días y medio, y añadir IL-2 humana recombinante 300 u/ml
3.7 Al 7º día de cultivo, el El número de celdas CIK debe alcanzar 1x 109 arriba.
3.8Control de calidad celular CIK:
3.8.1 Tinción con azul tripán para detectar la viabilidad celular: las células viables deben estar por encima del 80%;
3.8.2 Uso Se utilizó citometría de flujo para detectar la expresión de CD3, CD8, CD56 y otras moléculas en la superficie celular y observar si la proporción de células CD3+CD56+ aumentaba significativamente.
4.4.Cultura e identificación. Células DC
4.1 Añadir GM-CSF humano recombinante 500-1 000 U/ml e IL-4 humana recombinante 500 U a las células adherentes restantes (principalmente monocitos CD14+) en el paso 3.2/ml de medio libre de suero, cultivo monocitos inducidos en una incubadora con 5% de CO2 a 37°C.
4.2 Cambiar el líquido cada 3 días y suplementar con citocinas
4.3 (Paso opcional) Al 5º día de cultivo, añadir 50 mg/ml de la solución obtenida en el paso 2 Tumor; antígeno, cargue DC con antígeno;
Nota: si DC no está cargado con antígeno, este paso se omite.
4.4 El sexto día de cultivo, añadir TNF-a humano recombinante (500 U/ml) para inducir la maduración de las células DC.
4.5 En el séptimo u octavo día de cultivo, el número de células DC debe alcanzar más de 1×106.
4.6Inspección de calidad de DC:
4.6; .1 Tripano Detectar la viabilidad celular mediante tinción azul: las células viables deben estar por encima del 80%;
4.6.2 Usar citometría de flujo para detectar la expresión de HLA-DR, CD83 y CD86 en la superficie de las células DC para determinar si los países en desarrollo están maduros.
5. Preparación y detección de calidad de las células DC CIK
5.1 Recoger las células DC y las células CIK obtenidas en los pasos 4 y 3, y cultivarlas en una proporción de 1:10 ( proporción numérica), agregue IL-2 humana recombinante (300 U/ml) al medio libre de suero;
5.2 Cambie el líquido cada tres días y medio y agregue IL-2 humana recombinante (300 U /ml).
5.3 Recolecte las células el séptimo día y el número de células debe llegar a más de 1×1010.
5.4 Inspección de calidad de las células DC-cik:
5.4.1 Prueba de tinción unitaria con azul Pan: las células viables deben estar por encima del 80%;
5.4.2 Citometría de flujo para detectar la expresión de CD3, CD8, CD56 y otras moléculas en la superficie celular: la proporción de Las células CD3+CD56+ deben estar por encima del 20%.
5.4.3 Experimento de destrucción celular: se utilizan células DC-CIK como células efectoras y células tumorales (pueden ser células tumorales primarias o líneas celulares tumorales) como células diana. La proporción de células efectoras a células diana es de 10:1 (proporción numérica) y cada pocillo contiene 1x 65438+ células diana. Después de 4 horas de cultivo, se recogió el sobrenadante y se usó un kit de lactato deshidrogenasa para detectar la tasa de destrucción de las células diana por parte de las células efectoras.
5.4.4 Antes de recolectar las células, tomar una pequeña cantidad de cultivo para cultivo de bacterias y hongos, y detectar micoplasmas, clamidia y endotoxinas (estándar: prueba de patógenos negativa, endotoxinas