Análisis de supervivencia específico del tumor
Un subtipo separado de cáncer de mama anémico definido por un microambiente inmunológico tumoral único.
Revista editorial: Nature Commune
Fecha de publicación: 3 de diciembre de 2065 438 09
Factor de impacto: 12,15438 0.
DOI: 10.1038/s 41467-019-13329-5
1. Antecedentes de la investigación
El microambiente tumoral afecta la aparición y el desarrollo del cáncer. En el cáncer de mama, las características clínico-patológicas, como la edad, el grado, el estadio y el subtipo molecular, se correlacionan con el pronóstico e impulsan las decisiones de tratamiento. Cinco subtipos moleculares clínicamente relevantes: luminol A, luminol B, enriquecido con Her2, de tipo basal y de tipo normal, tienen diferentes características de incidencia, supervivencia, pronóstico y biología tumoral.
Además de los factores biológicos de las células cancerosas, el microambiente inflamatorio también afecta a la aparición y progresión de los tumores. El microambiente inmunológico que rodea a las células cancerosas puede reconocer e inhibir el crecimiento del tumor o promover la progresión. En el cáncer de mama, una alta infiltración inmune se asocia con mejores resultados clínicos. Además, una alta infiltración inmune se asocia con una mayor respuesta a la quimioterapia neoadyuvante y adyuvante.
2.Materiales y métodos
? 1? Fuente de datos
1) Expresión genética: cohorte de MicMa recopilada mediante cirugía (un subconjunto de la cual se utilizó para el análisis, MicMa-nCounter (n = 96, FFPE), MicMa-Agilent (n = 104, fresco) tejido congelado)).
2) RNA-seq: cohorte oslo2-emit0 (GSE135298, datos sin procesar en EGAS00001003631)
3) Datos públicos: datos de expresión de GEO, Archivo Europeo de Nomenclatura del Genoma, ArrayExpress o TCGA obtenido; metacola
? 2? Proceso de análisis
1) Análisis de enriquecimiento del conjunto de genes
2) Agrupación no supervisada para obtener agrupación inmune: basado en 509 genes, utilice el mapa de calor del paquete R para analizar la matriz de correlaciones de los pacientes para jerárquica. agrupamiento.
3) Nanodisección: se utiliza para predecir la infiltración de linfocitos y células de la médula ósea. La fracción nanodiseccionada de linfocitos o células mieloides refleja la expresión promedio de sus respectivos genes en la muestra.
4) ciber sort (proporción absoluta de 22 tipos de células inmunes infiltrantes) y ssGSEA (conjunto de genes de transición epitelial a mesenquimatosa, células madre, proliferación y vías relacionadas con el ciclo celular).
5) Regresión logística binomial para predecir grupos inmunes: r-package glmnet (fórmula modelo)
6) Evaluación patológica de la infiltración inmune
7) Puntuación ROR : ¿Puntuación ROR = 0,05 × básico 0,12 × su 2 enriquecido? 0,34 x luminol A 0,23 x luminol B; donde el sustrato, el enriquecimiento de Her2, el lumen A y el lumen B son las correlaciones entre cada muestra y el centroide obtenido utilizando el paquete de software genefu en r.
8) Estadística, análisis de supervivencia y análisis de regresión de Cox multivariable.
En tercer lugar, los resultados muestran
01: los grupos inmunes en el cáncer de mama también reflejan una infiltración inmune progresiva
Midiendo 95 muestras de tumores de la cohorte MicMa. La matriz fue diseñada para Analizar la infiltración inmune en tumores sólidos. De estas 95 muestras, 79 muestras habían sido analizadas previamente mediante matrices de oligonucleótidos de 4 × 44K de genoma completo de Agilent. Primero, se utilizaron correlaciones de Pearson y Spearman para comparar las expresiones obtenidas de las dos plataformas, y se encontró que había una correlación positiva alta entre los valores de expresión de los genes (Figura 1A complementaria).
Para agrupar a los pacientes en función de las similitudes en la expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario, se realizó una agrupación jerárquica no supervisada de la matriz de correlación (Fig. 1a y Fig. 1B complementaria).
El análisis de contorno de 3 a 10 grupos mostró que 3 grupos capturaron mejor la segmentación de los conjuntos de datos nCounter y Agilent (Figura complementaria 1C,d). Se compararon los resultados de agrupación de los dos conjuntos de datos MicMa-nCounter y MicMa-Agilent. En estos dos conjuntos de datos, se superponen 79 muestras. La agrupación no supervisada que utiliza diferentes plataformas para medir la expresión genética y la superposición incompleta entre listas de genes y muestras aún encontró que las asignaciones de grupos de 79 muestras superpuestas eran significativamente similares.
Para confirmar que las colonias están relacionadas con el microambiente inmunológico del tumor (Figura 1b), se utilizó el algoritmo Nanodissect para calificar la infiltración de linfocitos totales y células mieloides. Patólogos experimentados validaron por primera vez la puntuación de Nanodissect en la cohorte MicMa mediante la evaluación de la infiltración inmune en secciones de hematoxilina y eosina (Fig. 1c y Fig. 1E complementaria). Se encontró que estos tres grupos estaban significativamente correlacionados con las puntuaciones de linfocitos nanodiseccionados (Fig. 1b) y células mieloides (Fig. 1F complementaria). Se concluye que los grupos A-C reflejan una infiltración inmune gradual, por lo que se denominan grupos inmunes.
La asociación entre estos grupos y la infiltración de linfocitos/células mieloides se validó utilizando datos de expresión de 9 cohortes adicionales. Se encontraron 509 genes en todos los conjuntos de datos estudiados para la agrupación no supervisada (Fig. 1d y Fig. 2A complementaria, para la agrupación de grupos metabólicos y TCGA, respectivamente). En cada cohorte, los tres grupos obtenidos se correlacionaron significativamente con las fracciones nanoanatómicas de linfa y médula ósea (Fig. 1e; Fig. complementaria 2B). La infiltración linfocítica del grupo A (azul; infiltración baja; tumor frío) aumenta gradualmente al grupo B (azul claro; infiltración moderada) y al grupo C (rosa; infiltración alta; tumor caliente).
Para otra capa de validación, se utilizó la evaluación patológica de la infiltración inmune en la cohorte metabólica, que se correlacionó significativamente con la puntuación de Nanodissect (Figura 1f y Figura 2C complementaria) y los grupos inmunes. La agrupación jerárquica no supervisada de genes en una matriz de inmunoensayo pan-cáncer se puede utilizar para agrupar tumores de cáncer de mama según el nivel de infiltración inmune progresiva.
02 - Los clusters inmunes se asocian con el pronóstico.
Para las dos cohortes más grandes, el grupo metabólico (n = 1904) y el grupo TCGA (n = 981), se encontró que el grupo B (con niveles intermedios de infiltración inmune) se asociaba con un peor pronóstico ( Figura complementaria 3A, B). Este peor resultado también se observó entre los casos del grupo B cuando los casos con receptores de estrógeno negativos (Figuras complementarias 3C yd) y con receptores de estrógeno positivos (Figuras complementarias 3E yf) se estratificaron por separado. Para mejorar los resultados de la observación, se elaboraron tablas de supervivencia de los pacientes según el grupo B (azul claro), el grupo A y el grupo C (púrpura), y se confirmó que el pronóstico de los pacientes del grupo B era evidente y significativamente peor (Figura 2). Este resultado se confirmó aún más en otras cuatro cohortes con datos de supervivencia relevantes. Conclusión Los grupos inmunes están asociados con el pronóstico en el cáncer de mama con receptores de estrógeno negativos y positivos.
03-Predicción de agrupaciones inmunes mediante regresión logística binomial
Basado en la relevancia clínica de la agrupación inmune, este artículo tiene como objetivo desarrollar un enfoque que no dependa de la agrupación no supervisada y pueda con precisión , Un enfoque general para predecir con sensibilidad la clasificación de pacientes con mal pronóstico. El autor utilizó regresión logística binomial y penalización de lazo para obtener un conjunto de genes que pueden predecir de manera sensible y específica si una muestra pertenece a la clase B, y se evaluó mediante el análisis de la curva característica operativa del receptor y el área bajo la curva (AUC) (Figura 3a). El modelo predijo 96,3 muestras en el grupo A y el grupo C, mientras que 68,8 muestras se clasificaron en el grupo B (Figura 3b).
Al comparar los valores de P de la prueba de rango logarítmico del tiempo de supervivencia, se descubrió que la clasificación de lazo generalmente mejoraba la correlación significativa entre los grupos inmunes y el tiempo de supervivencia. El modelo Lasso ha sido validado en otras cinco cohortes. La Figura 3c-e muestra STAM (n = 856), Mainz (n = 200) y UPSA (n = 289), y la Figura complementaria 5A yb muestra CAL (n = 118) y PNC (n = 92).
Dado que la regresión logística binomial predijo solo dos grupos (grupo B, grupo A y grupo C), se realizó otra ronda de regresión logística binomial para diferenciar con alta precisión el grupo A y el grupo C (Figura complementaria 5C, d).
04 -?El grupo inmunológico, un factor pronóstico independiente
Los autores estudiaron más a fondo la relación entre el grupo inmunológico y las características clínico-patológicas famosas del cáncer de mama (tamaño, edad, grado, estadio, linfa afectación ganglionar y subtipo molecular (PAM50)). El grupo A (baja infiltración inmune) es rico en casos luminales y ER positivos, y el grupo C (infiltración inmune alta) tiene una mayor proporción de casos ER negativos y de tipo basal. Las muestras ER negativas y ER positivas, así como el subtipo PAM50, también representaron una cierta proporción en el grupo B con mal pronóstico (Fig. 4a, B).
Se utilizó el análisis de regresión de Cox multivariable para probar el impacto pronóstico de los grupos inmunes, teniendo en cuenta otros factores pronósticos. Se descubrió que los grupos inmunes son un factor importante en la supervivencia del modelo, como lo demuestran los valores significativos de P asociados con los grupos inmunes en cada modelo de Cox de cohorte. Para probar más a fondo la superioridad de los grupos inmunes como biomarcadores de pronóstico importantes, se empleó un enfoque de selección retrospectiva por pasos. Para todas las cohortes, la agrupación inmune se mantuvo en el modelo mínimo que mejor se ajusta y fue una variable de pronóstico significativa en 9 de 11 cohortes.
05 - Validación de un nuevo conjunto de datos RNA-seq con puntuación de riesgo de recaída (ROR)
EMIT0 es un subconjunto del estudio de cohorte OSLO2 con Prosigna aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos. Se evaluó la puntuación de recurrencia (ROR). La puntuación ROR añade información pronóstica importante a las características clínico-patológicas estándar. Se encontró que las muestras compuestas por el grupo B tenían puntuaciones ROR moderadas en comparación con los grupos A y C (Fig. 4c), lo que indica que las malas predicciones asociadas con el grupo B no pueden explicarse por la información contenida en las puntuaciones ROR. Se obtuvieron los mismos resultados cuando los casos ER negativos (Figura 7A complementaria) y ER positivos (Figura 7B complementaria) se evaluaron por separado. Las puntuaciones de ROR se calcularon para todas las cohortes mediante métodos existentes relacionados con los subtipos de PAM50, y se confirmó que el grupo B constaba de puntuaciones de ROR intermedias (Fig. 4d y Fig. 7C yd complementarias).
El análisis de regresión múltiple confirmó que el agrupamiento inmunológico aporta un valor de pronóstico adicional a la puntuación ROR, lo que se refleja en el valor P significativo del agrupamiento inmunológico cuando se construye un modelo de supervivencia utilizando la puntuación ROR y el agrupamiento inmunológico. El valor agregado del agrupamiento inmunológico en la clasificación de los pacientes según la supervivencia cuando se utiliza con puntuaciones ROR se destaca al calcular las mejoras en la clasificación del peso neto (NRI) y el índice de mejora discriminante integrada (IDI), como lo muestran los coeficientes NRI e IDI en todas las cohortes. Se muestra el valor positivo. El arranque basado en intervalos de confianza (IC) de NRI e IDI mostró que para varias cohortes, la clasificación de los pacientes según el pronóstico mejoró significativamente cuando se agregó la agrupación inmune a la puntuación ROR.
06-Clústeres inmunes y su respuesta a la quimioterapia neoadyuvante
Evaluar más a fondo la relación entre los clusters inmunes y la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante. Utilizando datos de expresión genética de 8 estudios (1377 muestras), cada muestra se asignó a su propio grupo inmunológico mediante un lazo. Como se muestra en la Figura 4e, se encontró que el grupo C tenía el porcentaje más alto de respondedores, seguido por el grupo A, y el grupo B tenía el porcentaje más bajo de respondedores. También se calculó el porcentaje de respondedores en cada grupo: la cohorte C tuvo un promedio de 42 respondedores y 58 pacientes con enfermedad residual, mientras que la cohorte B tuvo un promedio de 18/82 respondedores y 13/87 pacientes con enfermedad residual. Debido a que las tasas de pCR difieren en función del estado de ER, la proporción de respondedores en casos ER positivos y ER negativos se calculó de forma independiente y se encontró que la proporción de respondedores fue más baja en la cohorte B, independientemente del estado de ER (respectivamente, Figura complementaria 8A y B).
Para cada cohorte que respondió a la quimioterapia neoadyuvante, se evaluó la distribución de casos de pCR y no pCR dentro de cada grupo inmune. Al considerar toda la cohorte, se encontraron diferencias significativas en la distribución de los respondedores dentro de cada grupo inmune, con menos respondedores en el grupo B y más respondedores en el grupo C, cuando se dividieron por estado de ER, aunque no siempre fue significativo, pero se observó la misma tendencia. .
Estos resultados indican que los pacientes del grupo C tienen una mayor probabilidad de ser respondedores. Los resultados también destacan la baja tasa de respuesta en el grupo B, lo que sugiere que estos pacientes pueden ser candidatos para probar opciones de tratamiento neoadyuvante.
07-Análisis informático de clusters inmunes
Para evaluar si la infiltración inmune progresiva dentro del cluster puede explicar la correlación con el pronóstico, se utilizó el análisis de regresión multivariada de Cox para probar el sistema inmune. ¿La puntuación de infiltración inmune es mejor para predecir la supervivencia? Los autores plantearon la hipótesis de que una combinación específica de tipos de células inmunitarias, en lugar del número total de células inmunitarias en el microambiente del tumor, puede ser responsable del mal pronóstico del grupo B.
Las proporciones de 22 tipos diferentes de células inmunes se estimaron utilizando el algoritmo CIBERSORT y se realizó una agrupación no supervisada de fracciones de infiltración mediana específicas de estos tipos de células (Figura 5a). En el caso del grupo C, se enriquecieron los macrófagos M1, las células T activadas por memoria y las células T auxiliares foliculares (Fig. 5a), lo que también quedó ilustrado por la distribución de las puntuaciones CIBERSORT en los grupos de metaboloma y TCGA (Fig. 5b). Como se esperaba, los niveles de células inmunes en el grupo A eran muy bajos. En el grupo B, que tuvo mala respuesta y pronóstico, se encontraron niveles más altos de macrófagos M2, mastocitos en reposo y células T de memoria en reposo (Figuras 5a y 5b).
Usando un modelo lineal generalizado, se asignaron tipos de células inmunes que distinguen el grupo B y los grupos A-C (Fig. 5c). También probamos qué tipos de células inmunes podrían explicar las diferencias entre los grupos A y B, y entre los grupos B y C.
08 - Análisis fenotípico de grupos inmunes
Aprobado Análisis de expresión genética diferencial identificó genes que estaban significativamente sobreexpresados en el grupo B. En comparación con el grupo A y el grupo C, 909 genes del grupo B estaban regulados positivamente. Estos genes están relacionados con la biología de las células madre y la EMT, como lo muestra el análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes (GSEA) utilizando los conjuntos H y C2 de MsigDB31 (Fig. 6a).
Para caracterizar mejor la relación entre los grupos inmunes y los fenotipos de las células cancerosas, se utilizaron conjuntos de genes relacionados con la EMT, las células madre, la hipoxia y la proliferación. La puntuación promedio de enriquecimiento del conjunto de genes para cada grupo y cohorte se calculó mediante el método GSVA, que refleja la actividad de cada vía/conjunto de genes en el grupo inmunológico. La agrupación no supervisada de las puntuaciones medias del conjunto de genes separó los grupos inmunes A y C, mientras que el grupo B se dividió en dos subgrupos (Fig. 6b). Estos resultados indican una correlación entre los grupos inmunes y las firmas genéticas relacionadas con células madre/EMT.
La agrupación no supervisada de puntuaciones de enriquecimiento de GSVA identificó dos firmas genéticas mutuamente excluyentes en el cáncer de mama: (i) una asociada con la proliferación y fenotipos similares a las células madre embrionarias, y (ii) la otra está relacionada con la EMT y Fenotipos de células madre mamarias. El fenotipo proliferativo fue dominante en el grupo C (Figura 11A complementaria), y lo mismo se observó al calcular la puntuación del conjunto de genes para cada muestra metabólica (Figura 11B complementaria). En el grupo B, la puntuación promedio del conjunto de genes para EMT o rasgos relacionados con la proliferación fue mayor (Figura 11C complementaria). A nivel de muestra de metabolómica, observamos un patrón similar para muestras en las que se activó uno u otro estado (Figura complementaria 11D). El grupo A tuvo puntuaciones más bajas en EMT y estado de proliferación (Figura complementaria 11E, f).
Para determinar formalmente qué fracción del conjunto de genes explica el grupo B, se utilizó un modelo lineal generalizado para probar la contribución de cada conjunto de genes. Los marcadores EMT tuvieron una contribución positiva al grupo b, mientras que la proliferación y la motilidad celular se asociaron con los grupos a y c (Fig. 6c). También se probó qué puntuación del conjunto de genes podría explicar el grupo B en comparación con el grupo A o el grupo C solo.
09? Correlación entre el fenotipo tumoral y la infiltración inmune
Debido a que los grupos inmunes están asociados con (i) tipos de células inmunes y (ii) características genómicas, se evaluó la infiltración inmune (CIBERSORT). y características de las células cancerosas (puntuación genómica). La Figura 6d muestra que las puntuaciones de proliferación y EMT se correlacionaron significativamente con diferentes tipos de células inmunes. Las puntuaciones altas de EMT se asocian con macrófagos M2, mastocitos en reposo y células T de memoria en reposo, y la alta proliferación se asocia con un microambiente tumoral adaptativo más activo. Estos datos sugieren que existe una continuidad entre el fenotipo de las células cancerosas y la composición del microambiente tumoral.
El grupo B participa principalmente en la infiltración inmune tumoral y tiene una alta señal EMT, pero alrededor del 35% del grupo B también muestra un fenotipo de proliferación. Para explorar esta heterogeneidad en el grupo B, las muestras se dividieron de manera no supervisada en B1 con el fenotipo EMT como factor dominante y B2 con proliferación como factor dominante (Fig. 6e).
En metabólico y TCGA, los casos B2 con fenotipo proliferativo tuvieron un peor pronóstico (Fig. 6f, G). Para evaluar más a fondo si la heterogeneidad en las puntuaciones genómicas va acompañada de heterogeneidad en el entorno inmunológico, los autores buscaron diferencias en tipos de células inmunitarias específicas entre las subpoblaciones B1 y B2. La agrupación no supervisada en la Figura 14 complementaria muestra que ambos subgrupos B1 y B2 tienen un microambiente inmunológico inactivo o promotor de tumores. En resumen, dos estados mutuamente excluyentes en el grupo B pueden ser relevantes para el pronóstico. Pero un factor unificador en el grupo B es la presencia de un microambiente inmunológico promotor de tumores/en reposo.
Cuatro. Conclusión
En este estudio se identificaron grupos inmunitarios clínicamente relevantes e infiltrados inmunitarios progresivos. En una cohorte de 15 cánceres de mama, que abarcaban 6101 muestras de cáncer de mama, los pacientes con infiltración inmune tumoral moderada tuvieron un mal pronóstico, independientemente de las características moleculares y clínico-patológicas pronósticas conocidas. La caracterización del componente inmunológico de la población reveló que los infiltrados inmunes afines al tumor se asociaron con poblaciones de mal pronóstico. Un análisis fenotípico adicional reveló la existencia de dos fenotipos tumorales agresivos mutuamente excluyentes en el cáncer de mama, uno asociado con la EMT y el otro asociado con la proliferación. Estos dos fenotipos son grupos de mal pronóstico que se encuentran en un microambiente inmunológico inactivo/promotor de tumores.