Cultivo de células cancerosas de hígado
Bel-7402 se estableció en 1974 y se originó a partir de un paciente masculino de 53 años con cáncer de hígado, que pertenece a HCC. Las características biológicas son las siguientes: las células crecen rápida y continuamente, y pueden pasar una vez cada 6 a 7 días; la mayoría de las células son poligonales y de tipo epitelial; Crecimiento adhesivo; hay un cromosoma acrocéntrico grande y largo en el cromosoma celular, que aparece con frecuencia y es el cromosoma marcador de la célula. La reacción de inmunofluorescencia de AFP fue positiva; el metabolismo de LDH, G6PD y TAT y la ultraestructura de las células mantuvieron básicamente las características del cáncer de hígado humano clínico. La tasa de formación de tumores es alta después del xenoinjerto y los tumores pueden formarse en 3 a 4 días. La histopatología de los tumores es similar a la del CHC clínico.
Esta línea celular fue establecida por el Hospital Zhongshan de la Universidad Médica de Shanghai. Se inoculó a un paciente masculino de 39 años con CHC en el hígado de ratones desnudos para establecer un modelo de ratón desnudo de metástasis de carcinoma hepatocelular humano (LCI-D20). Se ha confirmado que las 33 líneas celulares obtenidas mediante reaislamiento, a saber, MHCC97H, MHCC97L y HCC LM, son heterogéneas, es decir, tienen diferente potencial metastásico según sus propiedades metastásicas.
La línea celular de cáncer de hígado humano MHCC97 se obtuvo in vitro a partir del modelo de ratón desnudo con metástasis de cáncer de hígado humano (LCI-D20) de 1998. Esta línea celular se ajusta a las características patológicas y genéticas de los tumores malignos humanos comunes. Las células son epitelioides, adherentes y expresan altamente HBsAg y AFP en el suero. El órgano diana con alta tasa de formación de tumores y metástasis preferencial es el pulmón, y la tasa de metástasis pulmonar es del 100%, lo que confirma esta línea celular.
En 2001, los investigadores descubrieron y aislaron dos líneas celulares, MHCC97-H y MHCC97-L, con diferente potencial metastásico del de la línea celular MHCC97. La tasa de metástasis pulmonar del primero fue del 65.438 ± 000% y la del segundo del 40%. Desde la perspectiva de la tasa de crecimiento, el tiempo de duplicación celular del primero es más corto que el del segundo, la capacidad del primero para penetrar la membrana basal artificial es mayor que la del segundo; El primero es más energético y se metaboliza más rápido que el segundo. Después de 20 generaciones, las dos características morfológicas y la tasa de crecimiento se mantuvieron estables. Posteriormente, se obtuvo con éxito la línea celular HCCLM3 con alto potencial metastásico tras la inoculación de ratones desnudos MHCC97-H.
En 1979, se aisló y estableció un hepatoblastoma primario en un niño caucásico de 15 años en Argentina. Esta línea celular parece epitelioide. Crece contra la pared; crece rápidamente, con un ciclo de paso de 1 a 2 días; baja tasa de formación de tumores en ratones desnudos; HBsAg negativo, pero no se ha detectado la presencia del genoma del virus de la hepatitis B (VHB). probado todavía. Sin embargo, los experimentos han confirmado que esta línea celular tiene un alto grado de diferenciación, características completas de biotransformación de enzimas metabólicas intracelulares y no requiere la adición de un sistema de activación exógeno. Las enzimas metabólicas permanecen estables en estudios relacionados con los efectos de los fármacos y no cambian al aumentar los tiempos de paso. Las enzimas metabólicas de biotransformación que contiene son homólogas a las células parenquimatosas del hígado humano normal, por lo que a menudo se utilizan como una línea celular ideal para el metabolismo de las células hepáticas in vitro o pruebas de genotoxicidad. Entre ellos, HepG2.2.15 es una línea celular ampliamente utilizada. Es un derivado de HepG2 y es un buen modelo para la detección in vitro de fármacos anti-VHB y se utiliza para la investigación in vitro sobre el desarrollo de nuevos fármacos anti-VHB.
Se aisló Hep3B del tejido de cáncer de hígado de un niño afroamericano de 8 años. La morfología celular es similar a la de HepG2 y muestra células epiteliales. Bajo el microscopio electrónico se encuentran en el citoplasma muchas partículas gruesas y negras, a las que también les gusta crecer en grupos y adherirse a la pared. Puede causar tumores en ratones desnudos, pero básicamente no hace metástasis. El VHB es positivo, a diferencia del HepG2. Esta línea celular integra el genoma completo del VHB y puede utilizarse para estudiar la carcinogénesis de la infección por VHB.
Esta línea celular se cultivó a partir de muestras de tejido de cáncer de hígado de un hombre japonés de 57 años en 1982. Las células son AFP positivas, altamente diferenciadas, epitelioides y adherentes. Tiene las características de negatividad al VHB y susceptibilidad al virus de la hepatitis C (VHC), por lo que puede usarse para estudiar la relación entre el VHC y el cáncer de hígado.
Además de la carcinogenicidad, también se puede utilizar para estudiar los mecanismos reguladores de la expresión genética, el metabolismo y la secreción de VLDL. Las características de esta línea celular son las siguientes: puede usarse para producir proteínas recombinantes como la eritropoyetina; en biología de proteínas, se usa para estudiar la replicación del virus del dengue en células hepáticas y es ampliamente utilizada en modelos animales de xenoinjerto;
Las células de Alexander de cáncer de hígado humano PLC/PRF/5 se establecieron en 1976. Las células procedían de una muestra de un paciente masculino con CHC primario en Mozambique. Las células epiteliales crecen de forma adherente; son AFP positivas y no producen albúmina; subtipo HBsAg sin producir HBcAg o HBeAg y partículas de Dane, que pueden mantener la reproducción del VHA. Esta célula puede contener todos los genomas del VHB y su espectro de isoenzimas y cariotipo son homólogos a los humanos. Los xenoinjertos en ratones desnudos pueden provocar tumores. Dado que las propiedades físicas y químicas del HBsAg producido por esta línea celular son similares a las del suero de los portadores del VHB, se puede utilizar para estudiar el VHB y su asociación con el cáncer primario de hígado in vitro y preparar las partículas de HBsAg necesarias para las vacunas anti-VHB. y preparar medicamentos antivirales.
En primer lugar, en comparación con las células hepáticas primarias humanas, las líneas celulares de cáncer de hígado humano superan las limitaciones de las fuentes difíciles de células hepáticas primarias humanas, el difícil control experimental y el corto tiempo de supervivencia. Las líneas celulares de cáncer de hígado son células de paso estable con las ventajas de fuentes convenientes, operación simple, condiciones controlables y reproducibilidad. Son objetivos ideales para la investigación relacionada con las enfermedades del cáncer de hígado.
En segundo lugar, las líneas celulares de cáncer de hígado se seleccionan a partir de tejidos patológicos de pacientes con cáncer de hígado confirmado. Tienen genomas genéticos similares a los de los pacientes con cáncer de hígado, incluido su mecanismo de desarrollo, expresión de proteínas funcionales, capacidad de replicación del virus, invasión y control. función de metástasis y resistencia a los medicamentos. El sexo es muy similar al del padre humano, lo que lo hace más adecuado para la investigación del cáncer de hígado en diversos campos.
La línea celular de cáncer de hígado humano HepG2 se usa ampliamente en la investigación de toxicología genética y en el cultivo de virus, y es de gran importancia para estudiar la patogénesis y la aplicación clínica de las enfermedades hepáticas. Debido a que tiene la misma actividad biológica que las células del hígado, también se utiliza en el estudio de la resistencia a la insulina. Este artículo revisa brevemente las condiciones óptimas para cultivar células cancerosas de hígado.
1 condiciones de recuperación. Células HepG2
Elija que la temperatura de recuperación sea 1,1
Tang et al. utilizaron el siguiente método para recuperar las células: agite las células congeladas rápidamente a 60 rpm en un baño de agua a 40 °C. hasta que se disuelva, e inmediatamente después de la disolución transferir a un baño de agua a 37 °C y agitar manualmente lentamente durante 2 a 3 minutos para la recuperación. Después de la recuperación, centrifugar a 800 rpm durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante, agregar 10 ml de medio que contenga 15 %. suero fetal bovino y mezclar. Tang et al. compararon el método anterior con el método descrito en la monografía celular. La tasa de supervivencia celular después de la recuperación tradicional en baño de agua a 37 °C fue del 68,4 %, y la tasa de supervivencia celular después de una disolución a 40 °C y una recuperación a temperatura constante de 37 °C. fue del 85,7%. La práctica ha demostrado que este método es superior a los métodos tradicionales.
1.2 Selección del medio de recuperación
Zhong Zhihong et al. utilizaron RPMI-1640 y DMEM para cultivar células HepG2. Los resultados mostraron que cuando la densidad de siembra era de 1×104/cm2 y el contenido de suero era del 15%, las células comenzaron a adherirse a la pared después de 6 horas de cultivo, alcanzando 65438+.
Sin embargo, cuando se inocularon células cultivadas en medio RPMI-1640 a una densidad de 1×104/cm2 y un contenido de suero del 20%, la adhesión celular no fue evidente después de 6 horas de cultivo, pero sí una adhesión parcial. La adhesión celular se produjo después de 12 horas, la mayoría de las células se adhirieron después de 24 horas y la tasa de crecimiento fue relativamente lenta después de 5 días. Los resultados anteriores muestran que el uso del medio de cultivo DMEM no solo puede ahorrar suero, sino que también tiene un tiempo de unión corto y una rápida proliferación. Además, el medio DMEM se utiliza para el subcultivo y la recuperación, lo que evita la molestia de preparar diferentes medios de cultivo. Por lo tanto, se recomienda utilizar medio DMEM para la recuperación de células HepG2.
La densidad de inoculación durante la recuperación fue de 1,3
Ganchini et al encontraron que cuando la densidad de inoculación era de 1×104/cm2 y el contenido de suero era del 20%, la mayoría de las células se adherían. a la pared y proliferan más rápido. Después de 5 días, se pueden pasar en una proporción de 1:3. Cuando la densidad de siembra es superior a 1 x 104 células/cm2 y/o el contenido de suero es inferior al 20 %, las células tendrán dificultades para adherirse y se degenerarán gradualmente. Cuando la densidad de inoculación era inferior a 1 × 104 células/cm2 y el contenido de suero era del 20%, la mayoría de las células se adhirieron a la pared después de 24 horas, pero la tasa de proliferación se ralentizó significativamente y pudieron pasarse en una proporción de 1: 3 después de unos 7 días.
2. Selección de enzimas digestivas y tiempo de digestión
Tang et al. descubrieron que la capacidad de digestión de EDTA + tripsina es demasiado fuerte, el tiempo de digestión es difícil de controlar y más. Las células mueren después del subcultivo y la digestión. La capacidad de digestión del EDTA es demasiado débil y el tiempo de digestión demasiado largo, lo que dificulta la digestión completa de las células. Lavar las células tres veces con PBS, luego agregar tripsina al 0,25%. Después de cubrir las células durante unos 30 segundos, retire la tripsina y mantenga las células a 37°C durante 2 a 3 minutos. Bajo el microscopio, se observó que las células estaban moderadamente digeridas. Zhong Zhihong et al. utilizaron una solución de tripsina al 0,25 % y EDTA de tripsina al 0,05 %-0,53 mmol/l para digerir las células que se iban a pasar. Se realizaron soluciones de Na sin PBS y que contenían PBS pH 7,2 1, 2 y 3 veces respectivamente (la cantidad de líquido de digestión se basó en el fondo de la botella) y el tiempo de observación fue de 30 segundos, 1, 2, 3, 4. , y 4. Los resultados mostraron que las células que no habían sido lavadas con PBS fueron digeridas por las dos enzimas anteriores y las células no se digirieron completamente después de 10 minutos.
Cuando las células se lavaron una, dos y tres veces con PBS a pH 7,2 y se digirieron con una solución de tripsina al 0,25 %, las células se pudieron digerir completamente después de 3 minutos, 65 ± 0 minutos y 0,5 minutos respectivamente. Digerir las células con 0,05% de tripsina-0,53 mmol/L EDTA. En solución de Na, se necesitan aproximadamente 3 minutos para digerir completamente las células, 65438 ± 0,5 minutos y 65438 ± 0 minutos. Los resultados de ambos son consistentes. Según los resultados anteriores, al digerir células HepG2, es mejor lavarlas tres veces con PBS a pH 7,2 y luego digerirlas con una solución de tripsina al 0,25% durante 0,5 minutos. Fei Hongxin [5] y otros recomendaron el siguiente método de digestión: la fruta es obvia y tiene poco impacto en las células. Un método de digestión generalmente adecuado es: lavar las células dos veces con 1xPBS, luego añadir una cantidad adecuada de tripsina al 0,15% (que contiene EDTA al 0,02%, mezclada en una proporción de volumen de 7:3) para cubrir las células durante aproximadamente 20 segundos, y luego aspire la tripsina (que contiene 0,02% de EDTA, mezclada en una proporción de volumen de 7:3).
3. Selección de la concentración sérica en el medio de cultivo
Debido a que las líneas celulares de cáncer de hígado humano crecen lentamente, son altamente malignas y tienen requisitos estrictos sobre el suero, la concentración de suero bovino fetal requerida para su cultivo es mayor que la de células tumorales ordinarias. Fei et al. tienen cierta experiencia en que las células de cáncer de hígado humano HepG2 crecen rápidamente en un medio que contiene un 15% de suero de ternera fetal. Los resultados experimentales de Zhong Zhihong y Wang Shuang también respaldan los resultados anteriores. Ganchini cree que cuando el contenido de suero es del 20%, las células HepG2 proliferan más rápidamente después de la adhesión. Cuando las células HepG2 proliferan durante varias generaciones y su estado se estabiliza, el contenido de suero puede descender gradualmente hasta el 10%. Tang [1] y otros creen que una concentración sérica del 12% es suficiente para el crecimiento de las células HepG2.
4. Selección de la concentración de anticuerpo doble
Wang Shuang et al. descubrieron mediante optimización experimental ortogonal que cuando la concentración de anticuerpo doble es del 0,5%, el efecto de paso es mejor y las condiciones son mejores. Fácil de controlar y las células pueden crecer sin problemas.
5. Selección de las condiciones de pH medio
Zhong Zhihong et al descubrieron que cuando las células de recuperación y las células pasadas se cultivaban a un pH de 6,8 a 7,4 y un 5 % de CO2, la tasa de adhesión y proliferación La tasa no ha cambiado significativamente.
Sin embargo, cuando se cultivaron sin CO2, las células recuperadas mostraron que el medio de cultivo se volvió gradualmente alcalino a diferentes valores de pH, y las células no pudieron adherirse a la pared y gradualmente se encogieron y degeneraron. Las células subcultivadas se cultivan a diferentes valores de pH y el medio de cultivo se vuelve ácido gradualmente. Cuando el valor del pH es < 7,0, después de 24 horas de cultivo, las células son básicamente adherentes, pero el valor aumenta lentamente. Después de 48 horas de cultivo, la mayoría de las células tenían pseudópodos extendidos y el número de células aumentó significativamente. Cuando el valor del pH es < 7,0, las células tienen dificultades para adherirse a la pared. Después de 72 horas de cultivo, las células se redujeron y degeneraron. Wang Shuang et al. descubrieron mediante experimentos ortogonales que el efecto de paso es mejor a pH 7,2, las condiciones son fáciles de controlar y las células pueden crecer sin problemas, lo que concuerda con los resultados anteriores.
6. Selección de las condiciones de paso celular
Wang Shuang y otros optimizaron las condiciones de paso de las células HepG2 mediante experimentos ortogonales. Recomendaron el paso cuando la confluencia celular alcanza el 95%-1000%. .
Los resultados de la investigación de Tang et al. muestran que las células HepG2 crecen hasta una confluencia del 50% al 95%, que es la fase de crecimiento logarítmico, y hay relativamente pocas células muertas. Cuando la confluencia alcanza el 100%, el crecimiento se acerca a una meseta y el número de células muertas comienza a aumentar. Especialmente después de que la confluencia alcanzó el 100%, el número de células muertas aumentó significativamente y el número de células viables disminuyó.
En base a esto, se puede determinar que el período de paso óptimo para el cultivo de células HepG2 está entre el 95% y el 100%. Los resultados experimentales de los dos métodos son consistentes y se recomienda realizar el paso de células cuando la confluencia sea del 95% al 100%.