Aplicaciones proteicas de la proteína verde fluorescente

Laboratorio de Kevin Sullivan

Dinámica de SPB y microtúbulos en levadura

Actina motora en levadura

Proteína MEI-S332 en Drosophila

Mitosis y transporte de ARNm en Drosophila

Citoesqueleto de termitas

Cizallamiento de ARN Transporte nuclear de factores

Quimiotaxis de termitas .

Dinámica citoesquelética y motilidad celular en Dictylobacter sp.

Energía nuclear

Dinámica celular de bacterias en red

Dinámica citoesquelética y transporte intracelular

Dinámica y transporte vesicular

Mostrando el transporte de vesículas con proteína fluorescente verde

Observando el transporte de TGN con GFP

Dinámica citoesquelética y transporte intracelular

Biología de ocurrencia

Usando verde proteína fluorescente para observar el desarrollo neuronal en C. elegans

Análisis de la división celular asimétrica en el desarrollo neuronal de Drosophila

Nematodo Lin-14

Laboratorio Fischbach

Observación de la proteína verde fluorescente en la morfogénesis de los reticulados

Métodos para marcar la proteína verde fluorescente durante el desarrollo del ratón

Investigación de aplicaciones biotecnológicas

Marcadores moleculares

La proteína verde fluorescente, como nuevo gen informador, se ha utilizado en muchos campos de investigación de la biología. Utilizando el mecanismo de luminiscencia único de la proteína verde fluorescente, la GFP se puede utilizar como etiqueta proteica. Es decir, se utiliza tecnología de ADN recombinante para formar un gen de fusión entre el gen diana y el gen GFP, que se transfecta en células apropiadas para su expresión. y luego se observa la etiqueta in vivo usando un microscopio de fluorescencia de proteínas. Debido a que la GFP es relativamente pequeña, con sólo 238 aminoácidos, su función luminiscente no se verá afectada después de fusionarse con otras proteínas. Aprovechando esta propiedad de la proteína verde fluorescente, hemos profundizado nuestra comprensión de los procesos en las células, como la división celular, la replicación y división de los cromosomas, el desarrollo y la transducción de señales. En 1996, Ehrdardt et al. informaron por primera vez sobre el uso de las propiedades de GFP para estudiar la localización de la proteína de diferenciación celular FtsZ. Las investigaciones muestran que FtsZ forma un anillo en el lugar de la división celular y que al menos nueve proteínas desempeñan funciones importantes en la división celular. Aunque las funciones de estas proteínas no están claras, algunas características de su orden de polimerización y localización de proteínas se han dilucidado mediante el uso de proteínas de fusión GFP. El uso de proteína verde fluorescente para detectar la localización de proteínas diana nos proporciona un nuevo método para observar con más detalle algunos procesos fisiológicos básicos en las células.

Además de marcar proteínas específicas, la GFP también se utiliza ampliamente para marcar diversos orgánulos, como el citoesqueleto, la membrana plasmática, el núcleo, etc. Shi et al. informaron que la GFP se fusionó con la superficie de la membrana celular de E. coli como proteína marcadora. Esta tecnología ayudará a mejorar la eficiencia del cribado de bibliotecas de péptidos, el desarrollo de vacunas, la construcción de biosensores celulares para la detección ambiental y la detección de procesos de transducción de señales. Estos han proporcionado nuevas ideas y métodos para la investigación biológica tradicional y se han convertido en un punto caliente para la investigación interdisciplinaria.

2. Detección de drogas

Muchos métodos de análisis óptico recientemente desarrollados han comenzado a utilizar células vivas para detectar drogas. Esta tecnología puede detectar rápidamente fármacos de interés entre una gran cantidad de compuestos. El análisis de fluorescencia celular se puede dividir en tres categorías: a saber, estudiar los cambios de estado de las proteínas objetivo, como receptores, canales iónicos o enzimas, en función de cambios en la densidad de fluorescencia, la transferencia de energía o la distribución de sondas fluorescentes. La distribución de sondas fluorescentes utiliza la migración de moléculas de señalización en la transducción de señales para acoplar una proteína fluorescente con moléculas de señalización. A partir de la distribución de las proteínas fluorescentes, se puede inferir el estado de migración de las moléculas de señalización y, por tanto, el papel de las moléculas en la migración. Debido a su pequeño peso molecular, la GFP es soluble en células vivas y tiene baja citotoxicidad, por lo que a menudo se utiliza como sonda fluorescente.

Las interacciones entre moléculas intracelulares son muy complejas y muchas implican la migración de moléculas de señalización entre orgánulos.

Por ejemplo, cuando una molécula de señalización se une a un receptor específico, el complejo ligando-receptor tiende a migrar de una región celular a otra, un proceso de migración que a menudo media en una función fisiológica importante. Por lo tanto, estos receptores se utilizan a menudo como objetivos para la detección de fármacos. Si un fármaco tiene una función similar a una molécula de señalización, tiene valor médico potencial. Usando la sonda fluorescente GFP, será fácil determinar a partir de una gran cantidad de compuestos qué compuestos tienen la función de provocar la migración de complejos ligando-receptor y mediar respuestas fisiológicas similares a las moléculas de señalización, y este proceso de detección es simple y conveniente. entonces el costo requerido es muy bajo. Utilizando este principio, se ha establecido con éxito un modelo de detección para estudiar la migración del receptor de glucocorticoides (hGR) mediada por fármacos. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos y se transfectaron con plásmido que codifica la proteína hGR GFP. Cuando las células se tratan con fármacos para su detección, la migración de hGR-GFP desde el citoplasma al núcleo de las células humanas se puede confirmar en tiempo real o dentro de un período de tiempo determinado. Según la distribución de fluorescencia, se puede inferir qué fármacos tienen funciones similares a los ligandos de hGR. Dado que la GFP debe acoplarse a una molécula de señalización migratoria, su capacidad de detección es relativamente baja. Sin embargo, debido a su fuerte penetración en las células y su mecanismo de luminiscencia único, la GFP tiene un potencial de aplicación considerable en la detección de fármacos.

3. Anticuerpos de fusión

En las últimas dos décadas, la tecnología de generación de anticuerpos se ha desarrollado rápidamente, desde anticuerpos diseñados con células (tecnología de hibridoma-anticuerpos monoclonales) hasta anticuerpos de tercera generación: los genes. Los anticuerpos diseñados, especialmente la tecnología de bibliotecas de anticuerpos de fagos, han resuelto el problema del desarrollo de anticuerpos humanos y promovido el desarrollo de varios anticuerpos con excelente rendimiento y proteínas de fusión de anticuerpos multifuncionales. El fragmento variable de cadena única (ScFv) es un anticuerpo de molécula pequeña bien estudiado. Sus ventajas son que puede expresarse en grandes cantidades en las células huésped y es fácil de operar en ingeniería genética, especialmente en la construcción de proteínas de fusión de anticuerpos. Hay muchos informes sobre la fusión de anticuerpos monocatenarios y proteínas verdes fluorescentes, y también hay informes relevantes en China. Por ejemplo, Cheng Hong et al. informaron sobre el éxito de la fusión de un anticuerpo bifuncional monocatenario contra el cáncer de hígado en un vector de expresión eucariota GFP y la expresión de NIH3T3 en fibroblastos humanos y de ratón. Dado que el anticuerpo de fusión tiene las características de unirse al antígeno y emitir fluorescencia, esta molécula artificial puede usarse como reactivo de detección para inmunotinción y aplicarse directamente a la citometría de flujo, el marcaje por inmunofluorescencia y la detección de tumores.

Por motivos técnicos, los anticuerpos de fusión suelen expresarse en sistemas de expresión procarióticos como E. coli. Para facilitar el aislamiento y la purificación de las proteínas expresadas, generalmente se inserta una secuencia 6xHis en el terminal N o C-terminal del anticuerpo monocatenario para facilitar la purificación de la proteína diana utilizando una cromatografía de afinidad de níquel-NTA. columna. Pero hay algunos problemas con esta tecnología. Debido a la presencia de enlaces disulfuro en la molécula de anticuerpo y debido a que el anticuerpo no puede plegarse correctamente en el sistema de expresión procariótico, es fácil formar cuerpos de inclusión. La proteína diana expresada está inactiva y necesita renaturalizarse en un sistema redox. Sin embargo, también hay informes de que los anticuerpos monocatenarios con actividad de unión a antígenos se han expresado con éxito en el citoplasma de células animales. Si la expresión de anticuerpos de fusión se puede resolver con éxito, desempeñará un papel extremadamente importante en los campos de la inmunotinción y la detección de tumores.

4. Biosensores

La tecnología de ingeniería de proteínas ha comenzado a diseñar biosensores combinando una molécula con un sitio de reconocimiento molecular para la función de transducción de señales a otra molécula. La proteína verde fluorescente es muy adecuada como fotorreceptor en células vivas debido a su mecanismo único de transducción de señales luminosas y su capacidad de verse fácilmente afectada por el entorno químico circundante y las interacciones proteína-proteína después de la expresión. El primer biosensor basado en GFP fue el receptor de Ca2, propuesto casi simultáneamente por Romoser y Miyawaki. El principio de este receptor es que el cambio conformacional espacial causado por la unión de la calmodulina a los iones de calcio conduce a la transferencia de energía vibratoria de fluorescencia entre dos mutantes de GFP. Sin embargo, dado que la mayoría de las proteínas no pueden soportar grandes cambios conformacionales espaciales como la calmodulina, para superar esta deficiencia, la gente ha comenzado a proponer el uso de tecnología de fusión genética para combinar un nuevo sitio de reconocimiento molecular con GFP para construir un nuevo receptor molecular. Basándose en este principio, Doi y Yanagawa fusionaron la β-lactamasa TEM1 (Bla) con GFP. Cuando la molécula objetivo no está presente, la GFP no emite fluorescencia cuando está estacionaria.

Sin embargo, cuando la molécula objetivo de la proteína inhibidora de la β-lactamasa (BLIP) se une a Bla, incluso si la GFP se activa para producir fluorescencia, este cambio se detecta fácilmente. La inserción de proteínas receptoras en la superficie de GFP se ha convertido en una poderosa herramienta para construir receptores moleculares. Este receptor de GFP se puede utilizar para detectar una variedad de moléculas, como proteínas, ácidos nucleicos, hormonas, fármacos, metales y otros compuestos de moléculas pequeñas, y sus perspectivas de aplicación potencial son extremadamente amplias.

Aplicaciones en la patogénesis de tumores

La GFP es una proteína de pequeño peso molecular que puede formarse fácilmente con otros genes diana sin afectar la conformación espacial y la función de sus propios productos genéticos de fusión. Cuando GFP se fusiona con el gen diana y el gen diana está marcado en verde, el nivel de expresión del gen diana se puede analizar cuantitativamente para mostrar cambios en su posición de expresión y cantidad en las células tumorales, con el fin de explorar el papel de este gen en el desarrollo del tumor y sus moléculas. El mecanismo proporciona condiciones convenientes.

En el proceso de formación de tumores, la proliferación y la apoptosis son una unidad contradictoria. Si domina la apoptosis de las células tumorales, el tejido tumoral permanecerá inactivo durante mucho tiempo o morirá por sí solo. La apoptosis de las células tumorales está regulada por genes relacionados con la apoptosis. Al transfectar GFP en genes relacionados con la apoptosis de células tumorales y compararlo con tejido normal, se puede determinar aproximadamente que el gen inhibe la apoptosis de células tumorales. Por el contrario, genes que promueven la apoptosis de las células tumorales.

La infiltración de células tumorales es la manifestación de una serie de procesos como la adhesión de células tumorales, la degradación enzimática, la migración y la proliferación de la matriz. La razón fundamental radica en la expresión anormal de ciertos genes en las células tumorales. El uso de las propiedades de rastreo de la proteína verde fluorescente para estudiar la relación entre la expresión anormal de ciertos genes en las células tumorales y la infiltración de células tumorales puede revelar algunos mecanismos de infiltración de células tumorales.

Aplicación en transducción de señales

Estudios recientes han descubierto que algunas GFP mutantes pueden sufrir transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FRET es un fenómeno en el que la energía mecánica cuántica se transfiere desde el estado excitado de una molécula fluorescente a una molécula aceptora cerca del estado fundamental. La premisa de FRET es que la molécula aceptora fluorescente debe aceptar energía dentro del rango de longitud de onda del estado liberado de la molécula donante fluorescente. Si la distancia entre las moléculas donadoras y aceptoras es de unos pocos nanómetros, es muy propicio para la generación de FRET. Porque FRET es muy sensible al posicionamiento y la distancia entre dos moléculas fluorescentes (en el rango nanométrico). La interrupción de pequeñas relaciones de posicionamiento lineal o espacial entre dos moléculas puede alterar fuertemente la eficiencia de la transferencia de energía. Dado que la eficiencia de la transferencia de energía FRET no es 65,438 0,000, el método práctico y efectivo para detectar FRET es excitar solo la molécula donante fluorescente y luego calcular la relación de liberación de fluorescencia de la molécula donante a la molécula aceptora. Los cambios en la proporción son indicadores ideales para observar cambios dinámicos en las células. Porque elimina la influencia de las moléculas de GFP sobre la concentración absoluta, el espesor celular, la energía de la fuente de excitación y la eficiencia de detección absoluta. Se pueden preparar sondas biológicas dependientes de GFP utilizando FRET. Actualmente, los investigadores han diseñado macromoléculas o chaperonas moleculares para cambiar el FRET de la respuesta de señalización fisiológica original entre GFP.

Se descubrió que FRET se puede cambiar regulando GFP. Una GFP azul fluorescente se fusiona con un mutante de GFP verde fluorescente, insertando un espaciador sensible a proteasa entre ellos, lo que solo causa FRET. Después de agregar proteasa, se elimina la región espaciadora, la distancia entre las dos GFP cambia de manera difusa y FRET se bloquea por completo. Este experimento demuestra que podemos observar dinámicamente las funciones fisiológicas de las células vivas acoplando GFP a factores de transcripción, receptores transmembrana e indicadores de señalización intercelular apropiados.

Basándose en los experimentos anteriores, los investigadores comenzaron a diseñar indicadores sensibles al Ca 2 dependientes de FRET. El principio de diseño es que la calmodulina (CaM) se une a la CaM a través de una combinación de quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK). La proteína fluorescente azul y la proteína fluorescente verde se fusionan a través de los dominios CaM y MLCK. A medida que aumenta el Ca 2, se forman más complejos Ca 2 -CaM y estos complejos se unen desde MLCK a la zona de unión de CaM. Los experimentos encontraron que FRET podría aumentarse cambiando la distancia entre dos GFP.

En lugar de fusionar dos GFP en una construcción, otros investigadores fusionaron una GFP con CaM y otra GFP con la región de unión de CaM. Se descubrió que cuando Ca 2 se une a CaM, aparece un heterodímero intermolecular y las dos GFP están lo suficientemente cerca como para producir FRET. Este experimento reveló un fenómeno muy importante: FRET no sólo puede ocurrir dentro de las moléculas, sino también entre moléculas.

Recientemente, algunos académicos han utilizado biosensores dependientes de GFP para medir la dinámica bioquímica en células vivas y observaron cambios dinámicos de fluorescencia en AMPc transfectando células con proteína quinasa A marcada con GFP. Los sensores de AMPc se diseñaron fusionando GFP fluorescente azul con la subunidad reguladora de PKA o GFP fluorescente verde con la subunidad catalítica de PKA. Cuando la concentración de AMPc es muy baja, la distancia entre las dos moléculas fluorescentes es muy cercana y se produce FRET. Si aumenta la concentración de AMPc, la posibilidad de FRET disminuye drásticamente. Este método se puede utilizar para detectar cambios dinámicos en AMPc, creando un nuevo método para estudiar las vías de transducción de señales reguladas por AMPc en condiciones generales.

Aunque la estructura de GFP tiene un alto grado de integridad, en experimentos se descubrió que se insertaban genes extraños en ciertas posiciones de GFP sin perder su fluorescencia en absoluto. Cuando se insertó CaM en un mutante GFP fluorescente amarillo, se obtuvo un sensor de Ca 2. Cuando Ca 2 se une a CaM, el cromóforo se desprotona y la intensidad de la fluorescencia aumenta 7 veces. Cuando la estructura de dedos de zinc Zif268 se inserta en GFP fluorescente amarilla, se puede obtener GFP conductora de Zn 2. Se encontró que la fluorescencia aumentó ligeramente, que fue 65438 ± 0,7 veces antes del cambio, y el valor de K d fue de aproximadamente 0,4 mmol. El fenómeno de mejorar la sensibilidad a la fluorescencia de GFP mediante la inserción de genes exógenos proporciona un nuevo método para obtener sensores codificados permanentemente para monitorear la transducción de señales celulares.

Generación de energía fotovoltaica

Los investigadores suecos ya no consideran las plantas como modelos, sino que están centrando su atención en las medusas con capacidades de conversión súper fotoeléctrica para desarrollar tecnología que mejore la recolección de energía solar. Utilizando proteína verde fluorescente (GFP) extraída de medusas, el equipo creó un dispositivo que puede utilizar estos "verdes pegajosos" para convertir la luz ultravioleta en electrones libres. La batería producida por este grupo consta de dos electrodos de aluminio simples separados por un pequeño espacio sobre un sustrato de dióxido de silicio que se coloca entre los dos electrodos para que sirva como conexión. Cuando se aplica luz ultravioleta, GFP continuamente quita fotones y genera electrones que ingresan al circuito para generar corriente. Al mismo tiempo, la GFP es muy barata y no requiere aditivos costosos ni procesamiento costoso. Además, se puede empaquetar como una pila de combustible independiente sin necesidad de una fuente de luz externa. Los científicos creen que este dispositivo de energía se puede reducir y utilizar para impulsar pequeños nanodispositivos.

Neurobiología

Desarrollo del polo neuronal

Seguimiento del transporte intracelular de neurotransmisores peptídicos utilizando GFP Allen Lab

Uso de tau -Enhancer captura de GFP como un reportero localizado en el axón

Otras aplicaciones

Organización de la superficie celular en células negras nativas

Calmodulina en la localización de GFP en Schizosaccharomyces pombe

GFP -plako globina y plásmido de expresión Laboratorio Klymkowsky

Laboratorio de movimiento molecular de la Universidad de Yale

Utilizando GFP- Determinación in vivo de diacilglicerol utilizando la quimera PKC Tobias Meyer

Usos de Bentley Labs GFP para el seguimiento de procesos biológicos en línea.

Controles

Seguimiento de proteínas virales con fusiones de proteínas fluorescentes verdes

Vectores y tecnología GFP

Clontech Inc. Proveedor estructural para la fabricación de fusiones GFP

Plataforma de microscopía 3D DeltaVision optimizada para obtener imágenes en tiempo real de GFP en células vivas

Sitio web increíble sobre la tecnología GFP

Universal Imaging, fabricante de la plataforma de procesamiento de imágenes MetaGFP

Quantum Biotechnology añade proveedor de construcciones GFP y BFP

Proteína verde fluorescente de Arabidopsis

Anticuerpo BabCo/Covance a GFP

Sistema de iluminación plana Lightools GFP

Proteína verde fluorescente en Chlamydomonas

Otros enlaces interesantes sobre GFP

Recursos para profesores de GFP

Fuente de proteína verde fluorescente: imagen de Aequorea victoria

Estructura de la proteína verde fluorescente Texto completo del artículo de biología estructural natural de Yang et al.

Tabla de mutantes de la proteína verde fluorescente

Óptica en biología celular

Perspectivas de aplicación

Después de sintetizar la GFP de tipo salvaje, requiere un cierto proceso de plegado para formar la conformación correcta para funcionar, y la intensidad de fluorescencia a 470 nm es relativamente baja. Para mejorar las propiedades de fluorescencia de GFP (como el valor de absorbancia molar y el espectro de liberación), se realizaron experimentos de mutación y recombinación en GFP. Al medir el espectro de fluorescencia de GFP recombinante en E. coli y C. elegans, Chalfie et al encontraron que era completamente consistente con el espectro de GFP nativo purificado. Los experimentos de mutación muestran que la mayoría de las mutaciones causan una pérdida parcial o completa de la actividad de fluorescencia de GFP, pero algunas mutaciones cambian significativamente los espectros de excitación y liberación de GFP. Por ejemplo, si se reemplaza Ser 65, aparece un único pico de excitación a 490 nm. La intensidad de fluorescencia después de la excitación es 6 veces mayor que la del tipo salvaje. Tiene una mayor resistencia a la extinción de la luz y al fenómeno de desplazamiento al rojo. Las propiedades de la proteína mutante son similares a las de FITC. De manera similar, Leu reemplazó a Phe 64, que aumentó la solubilidad de GFP y mejoró la intensidad de la fluorescencia 35 veces. Cuando se mutan tres aminoácidos al mismo tiempo, el pico de excitación máximo aparece entre 360 ​​nm y 400 nm, la probabilidad de formación de cromóforos aumenta, la solubilidad es más fuerte y la intensidad de fluorescencia es 18 veces mayor que la de la GFP de tipo salvaje. Actualmente, se cree que la baja concentración de GC es una de las razones de la baja expresión de GFP. Por lo tanto, los investigadores sintetizaron una GFP especial con alto contenido de GC y descubrieron que esta GFP tenía una mayor intensidad de fluorescencia. Además, la eficacia de la expresión de GFP en mamíferos se puede mejorar reemplazando codones en GFP de tipo salvaje con codones preferidos en la proteína humana. Muchas proteínas mutantes GFP no solo cambian los espectros de excitación y liberación, sino que también mejoran la eficiencia de la formación de cromóforos, la solubilidad y la expresión de proteínas.

Los diferentes mutantes ofrecen perspectivas de aplicación más amplias, pero también se ha descubierto que algunos mutantes exhiben una mayor sensibilidad dentro de rangos de pH fisiológicamente variables. Los investigadores utilizaron un mutante de GFP sensible al pH para detectar el pH en el citoplasma, el núcleo, el aparato de Golgi y la matriz mitocondrial y descubrieron que las mediciones en estas regiones concordaban con los valores informados anteriormente. A diferencia de los tintes de moléculas pequeñas, los detectores de pH que dependen de GFP no necesitan considerar una serie de cuestiones como la penetración del tinte y la hidrólisis ambiental. Además, GFP tiene una alta selectividad y localización y es adecuado para todas las células que son sensibles a la transfección de genes. Más importante aún, este experimento muestra que el promotor específico de tejido GFP se puede utilizar para detectar tejidos específicos mediante la fusión con una proteína diana, se puede detectar el valor de pH de un tipo específico de célula, orgánulo o región intracelular específica. Esto permite detectar el pH de piezas que antes eran inaccesibles.

Las proteínas fluorescentes han sido ampliamente utilizadas. La GFP se puede utilizar para determinar células transfectadas, determinar la expresión genética in vivo, localizar moléculas de proteínas, monitorear dinámicamente la comunicación molecular entre células, inmunoensayos, análisis de sondas de bases de ácidos nucleicos y determinar iones de calcio de segundo mensajero intercelular y niveles de AMPc. cambios de pH intercelular.

Además, la GFP puede formar proteínas de fusión con otras proteínas y puede utilizarse como indicador de detección para terapia génica. Sin embargo, todavía quedan muchos problemas por resolver en la aplicación de la proteína fluorescente verde: (1) La no linealidad de la intensidad de la señal de fluorescencia hace que la cuantificación sea muy difícil (2) La autofluorescencia de la mayoría de los organismos es débil y la excitación y emisión; las longitudes de onda son similares. El fondo de fluorescencia afectará la detección de algunas GFP. (3) Se encontró en el experimento que es difícil establecer una línea celular estable con GFP, lo que puede estar relacionado con la participación de GFP en el proceso de apoptosis; (4) También debe tenerse en cuenta que debido al peso molecular relativamente pequeño de la propia GFP. Grande, la GFP expresada como una proteína de fusión puede afectar la localización celular y otras propiedades de la propia proteína, por lo que se requiere un análisis cuidadoso cuando se utiliza GFP como; un marcador.