Investigación experimental sobre la terapia con gusanos
El contenido de la investigación del proyecto de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales del profesor Wang Jiangning es el siguiente:
Mecanismo de acción:
(1) La secreción de gusanos puede destruir enfermedades no saludables o tejidos anormales, sin dañar el tejido sano. Las enzimas colagenasa, similares a la tripsina y similares a la quimotripsina producidas por los gusanos pueden descomponer el tejido necrótico en una espuma semilíquida y luego digerirlo. Además, sus secreciones contienen ftalida antibacteriana antimicrobiana.
(2) Los gusanos pueden eliminar las bacterias de las heridas. Tienen la capacidad de devorar rápidamente grandes cantidades de bacterias digestivas.
(3) Los gusanos pueden estimular la cicatrización de heridas. En experimentos, alguien descubrió que la estimulación mecánica del movimiento de los gusanos puede hacer que los fibroblastos produzcan colágeno y fibrina, acelerando la formación de tejido de granulación.
(4) Los gusanos secretan sustancias alcalinas y cambian el pH de la herida.
(5) Investigación sobre el efecto antibacteriano de otras secreciones de gusanos vivos
1 Tratamiento aséptico de gusanos vivos
Nuestro método se basa en la alimentación 2 -Eliminar. gusanos después de 3 días. Primero enjuague repetidamente con solución salina fisiológica y coloque las larvas en una solución salina fisiológica de formaldehído al 3,5% durante 5 minutos en una solución de peróxido de hidrógeno al 2% durante 3 minutos en una solución de yodoformo al 5%; en alcohol al 75% durante 3 minutos sin afectar la vitalidad de los gusanos. Diseñamos tratar continuamente los gusanos con las concentraciones anteriores de formaldehído, peróxido de hidrógeno y desinfectante que contiene cloro. Después de cada tratamiento, se lavan con agua destilada. Las pruebas bacterianas y virológicas en la superficie de los cuerpos de los gusanos desinfectados confirman que no hay bacterias. y virus y que los gusanos están libres de bacterias y virus. La vitalidad aún existe y el estado estéril puede usarse para experimentos clínicos y básicos in vivo.
2. Obtención de las secreciones de gusanos vivos
Tomar una cantidad adecuada de gusanos (600) y dividirlos en el grupo de inducción de Staphylococcus aureus (se cultivan 300 larvas con Staphylococcus aureus) 48 horas) y al grupo de control, respectivamente, se les añadió 2 veces el volumen de tampón TNE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM y cóctel inhibidor de proteasa que contenía 10 amperios; micro; g/ml de leupeptina, 1 amperio). ; micro g/ml de aprotinina y PMSF 1 mM, Na3VO4 3 mM) durante 10 minutos, homogeneizar completamente el homogeneizado y centrifugar (12000 Xg, 40 °C, 10 min). en baño maría hirviendo durante 2 minutos (12000Xg, 4OC, 10min) y tomar el sobrenadante, que es el extracto crudo.
3. Establecimiento de un método para medir la actividad biológica de sustancias antibacterianas.
El impacto de la concentración bacteriana y el medio de cultivo en la formación de placas antibacterianas: las investigaciones han encontrado que diferentes concentraciones bacterianas y los medios de cultivo tienen un impacto en la formación de placas antibacterianas. La formación y el tamaño de la placa tienen efectos obvios. Después de seleccionar, utilizamos la concentración bacteriana que puede producir la placa antibacteriana máxima con sustancias antibacterianas, es decir, 5 valores de DO, 30 ul para difundir. la placa y utilice caseína hidrolizada como medio de cultivo sólido para facilitar el proceso de purificación. Detección sensible de la actividad biológica de la sustancia antimicrobiana. Comparación de la susceptibilidad antibacteriana de diferentes bacterias a sustancias antibacterianas: Se comparó la susceptibilidad antibacteriana de dos bacterias diferentes, bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y bacterias Gram negativas (E. coli), a sustancias antibacterianas. Los resultados se muestran en. la figura
A, B, C: extracto crudo antibacteriano A, D: extracto crudo antibacteriano E, F: sobrenadante del homogeneizado larvario
E, C: sobrenadante del homogeneizado larvario Suero D: Tampón TNE B: Tampón TNE
IV.Resumen
La infección bacteriana secundaria de las heridas ulcerosas es la principal causa de amputación en pacientes con pie diabético. El tratamiento con antibióticos tiene la ventaja de una alta concentración local, pero la aplicación local puede conducir fácilmente a resistencia bacteriana, como lo demuestra el débil efecto antibacteriano de la cefoperazona en Staphylococcus aureus aislado y cultivado en sitios clínicos en este experimento. Los insectos tienen un sistema de defensa inmunológico especial. Muchos insectos pueden producir sustancias inmunes humorales cuando son inducidos por estímulos externos dañinos. Las larvas de mosca viven en un ambiente con muchos microorganismos patógenos, pero ellas mismas no enferman. Se puede ver que el cuerpo de la mosca tiene un sistema de defensa inmunológico único.
El extracto de secreción de hemolinfa de gusanos recolectado en el experimento tiene un fuerte efecto antibacteriano sobre Staphylococcus aureus y su capacidad antibacteriana es más fuerte que la cefoperazona. Creemos que las bacterias dañinas desempeñan un papel inductor hasta cierto punto, estimulando el sistema de defensa del cuerpo de los gusanos para que produzca sustancias que resistan a las bacterias. Las larvas de mosca verde (gusanos) crecen principalmente en ambientes que contienen una gran cantidad de bacterias, como carroña y carne de pescado en descomposición. Se alimentan de tejidos en descomposición y no tienen ningún efecto sobre los tejidos vivos con suministro de sangre. Algunos estudiosos extranjeros han aprovechado esta característica de las larvas de mosca verde para aplicarla en la reparación y tratamiento de heridas infectadas y han obtenido buenos resultados. Después de desinfectar los cuerpos de gusanos viables, las pruebas bacterianas y virológicas en la superficie del cuerpo de los gusanos confirmaron que no había bacterias ni virus. Los gusanos desinfectados se utilizaron para el tratamiento clínico de las heridas de las úlceras del pie diabético. En todos los casos, las heridas mostraron necrosis purulenta. El tejido se extrajo limpiamente, el tejido de granulación fresco creció rápidamente y la superficie de la herida se cultivó sin bacterias. Creemos que cuando los gusanos se arrastran sobre la herida de la úlcera, tragan el tejido necrótico purulento y limpian la herida, el Staphylococcus aureus en el medio ambiente también ingresa al cuerpo del gusano, estimulando el cuerpo del gusano para que produzca ciertas sustancias proteicas antibacterianas para eliminar las bacterias. Estudio sobre el efecto curativo de heridas de secreciones de gusanos vivos en ratas diabéticas
1. Materiales y métodos
1. Replicación del modelo de diabetes: ratas SD macho de 3 meses de edad, con un peso de 300 g. ~ 350 g, adquiridos en el Centro Experimental de Animales de la Universidad Médica de Dalian. Se realizó ayuno 12 horas antes del experimento y se cuantificaron las muestras. El día del experimento, se midió el peso corporal, se extrajo sangre de la vena de la cola y se midió la glucosa en sangre basal con un medidor de glucosa en sangre. Luego, a 30 animales del grupo experimental se les inyectaron 75 mg/kg de. estreptozotocina (Sigma, disuelta en 0,01 mmol/L de tampón citrato antes de su uso, pH 4 2), y a las ratas restantes se les administró una inyección intraperitoneal de dosis iguales de tampón citrato. Una semana más tarde, cuando la concentración de glucosa en sangre del animal es ≥16,7 mmol/L, el modelo de diabetes se replica con éxito.
2. Producción de modelos de heridas: tomar 20 ratas diabéticas replicadas artificialmente y 10 ratas del grupo normal, anestesiarlas con una inyección intraperitoneal de ketamina 5 clorhidrato (50 mg/kg) y luego afeitarles la espalda. , desinfección de rutina. En condiciones estériles, utilice un punzón especial para hacer un agujero redondo en las partes superior e inferior de la columna media del lomo de la rata, tan profundo como el subcutáneo, con un diámetro de 1,8 cm y un área de herida de 2,54 cm2. Después de la hemostasia, se envolvió al paciente con una gasa esterilizada, se le alimentó en una sola jaula y se le dio agua y alimento racionados. Todos los experimentos se completaron en un laboratorio de animales limpio.
3. Configuración de ungüento estimulante muscular de la medicina tradicional china: se compone de quince medicinas tradicionales chinas como astrágalo crudo, cáscara de cañón, rehmannia glutinosa, madreselva, coptis, etc. crecimiento, desintoxicación y estasis sanguínea Afiliado a la Universidad de Dalian Proporcionado por la farmacia china del hospital.
4. Agrupación experimental: dividida en grupo de tratamiento de medicina tradicional china (TLSJ DM) alimentado con crema Shengsheng de medicina china 3 ml/animal/día; grupo de tratamiento de gusanos simples (MDT DM), grupo de control normal (NORM); y modelo El grupo control (DM) fue alimentado con solución salina fisiológica 3ml/animal/d. Las heridas del grupo de tratamiento con medicina tradicional china y del grupo de tratamiento con gusanos se comprimieron en húmedo con 1,5 ml de cada una de secreciones de gusanos y se aplicaron secreciones de gusanos en la superficie superior de la herida y se aplicó solución salina normal en la superficie inferior de la herida. Cubrir con una gasa esterilizada, vendar y asegurar. Alimentación en jaula única. Cambie el vendaje regularmente una vez al día hasta que la herida sane.
2. Indicadores de observación
1. Estándar de curación: convertir al área del plano de la herida después de pesar en una balanza. Todos los datos medidos se expresan como x ± s. El estándar de curación de heridas es que la costra sea inferior al 5% del área de la herida o que el área de curación sea ≥95%, lo que significa curación completa.
2. Examen patológico: tome tejido de la herida de cada grupo de animales los días 7, 14 y 21 después de la cirugía, fije las muestras en formalina al 10%, cortes incluidos en parafina y realice una tinción HE de rutina.
3. Inmunohistoquímica: Los niveles de bFGF y CTGF en cada grupo se tomaron del borde de la piel de la herida de los animales en cada grupo los días 7, 14 y 21 después de la cirugía, aproximadamente 0,5 x 0,5 cm2.
Después de usar inmunohistoquímica SABC para detectar secciones de tejido, las secciones se desparafinaron con xileno y se graduaron de alcohol a agua, se lavaron dos veces con PBS (0,01 M) durante 3 minutos y se incubaron con 3H2O2 a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar la peroxidasa. 3 minutos, recuperación del antígeno en microondas a 100°C durante 10 minutos, agregar solución bloqueadora de suero animal durante 10 minutos, verter, agregar solución de trabajo de anticuerpo primario diluido a 37°C, almacenar en una caja húmeda a 4°C durante la noche y lavar con PBS durante 3 minutos 3 veces, agregar solución de trabajo de anticuerpo secundario biotinilado, incubar en una caja húmeda a 37°C durante 20 minutos, desparafinar con alcohol a agua, operar de la misma manera que arriba, lavar con PBS 3 veces por 3. minutos, agregue la etiqueta de enzima SABC y manténgalo en una caja húmeda a 37 ° C. Incube durante 20 minutos, lave tres veces con PBS durante 3 minutos, desarrolle el color con DAB y controle bajo el microscopio. agregue PBS para detener el desarrollo del color, enjuague con agua corriente durante 10 minutos, contrateñir con hematoxilina durante 30 segundos, vuelva al azul con agua corriente durante 10 minutos, deshidrate, transparente y selle los portaobjetos con goma sólida y neutra. Para cada sección, se seleccionaron aleatoriamente 4 campos de visión no superpuestos en la piel de la herida bajo un microscopio de aumento de 10 × 20, y se contaron las células positivas para bFGF y CTGF.
3. Método de procesamiento de datos: Expresado como media ± desviación estándar, se utilizó la prueba t pareada antes y después del tratamiento en el mismo grupo, se utilizó análisis de varianza unidireccional para la comparación entre grupos y SPSS10. 0 se utilizó para el análisis estadístico de los datos.
IV.Resultados
1. Observaciones generales: Después de 1 semana de modelado, las ratas modelo mostraron un aumento en la ingesta de agua, producción de orina y ingesta de alimentos, y mostraron una reacción lenta, cansada y color de pelaje opaco. Al final del experimento, las ratas del grupo de control normal estaban vivaces y activas, con pelajes brillantes, ingesta normal de alimentos y las heridas básicamente se reparaban solas. Las ratas del grupo de control del modelo mostraron una pérdida significativa de peso corporal, un aumento del consumo de agua y de la producción de orina, una exudación y erosión graves de las heridas, y un agrandamiento y profundización continuos de las heridas, mientras que otras condiciones no mejoraron. El color del pelaje de las ratas del grupo de tratamiento con medicina tradicional china todavía era brillante, su peso y su ingesta de agua no disminuyeron significativamente, su frecuencia de actividad fue normal, su ingesta de alimentos fue aceptable y sus heridas se recuperaron como nuevas. En el grupo de tratamiento con gusanos simples, el color del pelaje de las ratas era apagado, su actividad aumentó ligeramente y sus heridas se recuperaron, pero el tejido de la piel formado era más delgado. El grupo de tratamiento con medicina tradicional china fue significativamente mejor que el grupo de control modelo y el grupo de tratamiento con gusanos simples. Cambios en el azúcar en sangre: a excepción del grupo de control normal, se encontró que los valores de azúcar en sangre de cada grupo experimental en cada momento no tenían diferencias significativas entre los grupos (Pgt; 0,05) mediante un análisis de varianza unidireccional (Pgt; 0,05). Por lo tanto, no se pueden considerar los factores que afectan la cicatrización de heridas debido a los valores de azúcar en sangre entre los grupos.
2. Cambios en el área de la herida y el tiempo de curación de la herida: el área de la herida en el grupo modelo posterior a la lesión aumentó gradualmente, acompañada de ulceración y exudación, y la tasa de mortalidad de las ratas fue mayor. La velocidad de curación temprana de las heridas del grupo de secreción de gusanos y del grupo de medicina tradicional china miogénica Tori fue más lenta y no hubo diferencias significativas entre los grupos Pgt 0,05; significativamente reducido.
En el nuevo estudio participaron pacientes con úlceras venosas. Durante su hospitalización de dos semanas, los investigadores seleccionaron a los pacientes al azar y los dividieron en dos grupos de más de 50 personas. Un grupo recibió terapia con gusanos y el otro grupo recibió terapia tradicional de limpieza de heridas con bisturí. Durante el tratamiento, los pacientes de ambos grupos tenían los ojos vendados y no sabían qué tipo de terapia estaban recibiendo.
Los gusanos utilizados en el tratamiento son larvas de mosca verde, que se envasan en pequeños frascos y se colocan sobre la herida del paciente durante el tratamiento, dos veces por semana. Los gusanos secretan una sustancia que se filtra en la herida, disuelve el tejido muerto y luego lo come, degradándolo aún más en sus intestinos. La Dra. Anne-Dommartin, del Centro Médico Universitario de Caen, Francia, y sus colegas dijeron que no hubo diferencias en el dolor o las sensaciones de retorcimiento entre los dos grupos. Sus hallazgos se publican en el Journal of Dermatology.
Una semana después, en promedio, dos tercios del área de la herida de los pacientes que se sometieron a limpieza quirúrgica estaba cubierta de esfacelo, lo que puede dificultar la cicatrización de la herida. Por el contrario, sólo el 55% del área de la herida estaba cubierta de esfacelo en los pacientes que recibieron terapia con gusanos.