Recolección y separación del veneno de escorpión
Tipos de toxinas y mapas de secuencia de aminoácidos.
La cantidad de veneno que se obtiene mediante estimulación eléctrica es el doble que la estimulación artificial. Aproximadamente 3.000 escorpiones adultos pueden producir de 6 a 7 g de veneno húmedo, que se puede congelar en 1 g, es decir, cada miligramo de veneno húmedo se puede procesar en 0,14 a 0,16 mg de veneno seco. Cada escorpión puede producir aproximadamente 0,34 mg de veneno seco después de una dosis. Los escorpiones machos son más pequeños que las hembras y producen menos veneno que las hembras. Bajo estimulación de pulso eléctrico, un escorpión hembra puede producir 2,59 mg de veneno húmedo tres veces, y un escorpión macho puede producir 2,01 mg de veneno húmedo tres veces (calculado basándose en tomar un veneno cada siete días). Sin embargo, se debe prestar estricta atención a la higiene para garantizar la pureza del veneno recolectado. Algunos escorpiones no se desintoxican después de encenderlos una vez y deben encenderse nuevamente, pero el tiempo de encendido no debe exceder los 2 segundos y la frecuencia. es de 128 Hz y el voltaje es de 6 a 10 voltios. Para evitar quemar el instrumento y dañar al escorpión. La cantidad de desintoxicación del escorpión varía con la temperatura. Cuando la temperatura es baja, la cantidad de desintoxicación es relativamente pequeña. Cuando la temperatura es inferior a 20°C, la capacidad de desintoxicación de los escorpiones es bastante pequeña. Por debajo de los 10°C, los escorpiones dejan de desintoxicarse. Por lo tanto, la cría de escorpiones a temperatura ambiente debe realizarse tanto como sea posible en junio, cuando la temperatura supera los 25°C. Los escorpiones preñados y los escorpiones con semillas no se pueden utilizar para recolectar veneno. Las escorpiones preñadas en el primer trimestre pueden acumular veneno, pero no pueden acumularlo antes de dar a luz. Los escorpiones utilizados para recolectar veneno son en su mayoría escorpiones adultos comerciales y escorpiones ancianos. El veneno de escorpión se compone principalmente de proteínas y enzimas y pierde actividad fácilmente. Es fácil de deteriorar a temperatura ambiente y debe procesarse hasta convertirlo en polvo venenoso seco para su almacenamiento a largo plazo.
Además de utilizarse inmediatamente para aislamiento y purificación, el veneno de escorpión debe secarse lo antes posible. El propósito de secar el veneno de escorpión es eliminar la mayor cantidad de agua posible del veneno, mejorar la estabilidad del veneno crudo y facilitar el almacenamiento, análisis y venta. Hay dos métodos de secado comúnmente utilizados: uno es usar liofilización al vacío para mantener la actividad de las enzimas en el veneno de escorpión; segundo, si es solo para mantener la toxicidad, se puede usar el secado al vacío.
(1) El secado al vacío (es decir, secado al vacío) es un método para evaporar rápidamente el agua del veneno de escorpión a baja presión. Los equipos de secado al vacío incluyen secadores al vacío, tubos condensadores y bombas de vacío. El pistón en la parte superior de la secadora está conectado al tubo del condensador y el otro extremo del tubo del condensador está conectado a la botella del filtro de succión, la torre de secado y la bomba de vacío en secuencia. El vapor se condensa en el tubo del condensador y luego cae a la botella de absorción. Se colocan en la secadora muestras desecantes (como pentóxido de fósforo, etc.) y veneno de escorpión. Antes de usar, aplique un poco de vaselina alrededor del pistón de la secadora y revise toda la unidad en busca de fugas de aceite. Cuando lo use, coloque el veneno de escorpión y el desecante en un plato plano respectivamente, luego colóquelos en un desecador, encienda la bomba de vacío para bombear aire hasta que la tapa ya no se pueda empujar y luego cierre el pistón y la bomba de vacío en secuencia. Después de que el veneno de escorpión esté seco, afloje lentamente el émbolo para evitar que el aire disperse el polvo de veneno de escorpión seco. Finalmente, saque el polvo seco en condiciones de purificación e inmediatamente empaquete y ciérrelo para su almacenamiento.
(2) Liofilización al vacío: primero, precongela el veneno de escorpión a estado sólido en un congelador a baja temperatura (el veneno está contenido en un plato de acero inoxidable) y luego sublima bajo baja temperatura y alto vacío para obtener veneno de escorpión blanco puro. Dado que la liofilización se realiza a baja temperatura y alto vacío, el veneno no forma espuma, no se pega a la pared, está suelto, es fácil de sacar y es fácilmente soluble en agua, lo que es beneficioso para la conservación.
El proceso de separación y purificación del veneno de escorpión es generalmente a través de una columna cromatográfica que separa según el peso molecular, luego a través de una columna de intercambio iónico y finalmente a través de tecnología HPLC de fase reversa para obtener un solo componente. El procedimiento es: primero use cromatografía de intercambio iónico CM-Sephadex C-50 para la separación y luego use Sephadex G-50 para filtrar, o use cromatografía en columna de intercambio iónico CM-Sephadex C-50, Sp-Sephadex C-25 y Sephadex G -50 Separación por filtración en gel. Si se utiliza CM-Sephadex C-50 para la cromatografía de intercambio iónico, los componentes altamente tóxicos se dializan y luego se vuelven a cromatografiar, y luego se usa la filtración en gel Sephadex G-50 para purificar las toxinas. O use cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa para separar el veneno crudo del escorpión de Asia oriental y use dos sistemas diferentes de cromatografía líquida de alto rendimiento para separar repetidamente, usando 0,1% de ácido tricloroacético-agua y 0,1% de ácido tricloroacético-70%. Elución en gradientes de etanol-agua. O extracción secundaria, es decir, cromatografía de intercambio iónico CM-Sephadex C-50, filtración en gel y desalación CM-Sephadex C-10.
Si utiliza la columna de gel de intercambio catiónico Sepharose FF, puede esperar obtener un único ingrediente activo con alta pureza. HPCE y la cromatografía líquida de alto rendimiento pueden mostrar bien la composición y el contenido relativo de péptidos de moléculas pequeñas en el veneno de escorpión, y los resultados son básicamente consistentes. La investigación actual sobre la separación y purificación del veneno de escorpión se centra principalmente en la obtención de péptidos anticancerígenos monocomponentes con alta actividad anticancerígena mediante la selección de cromatografía en gel y cromatografía líquida de alta resolución con diferentes longitudes de columna, caudales y gradientes. Por ejemplo, la cromatografía de tres pasos se utiliza para aislar péptidos antiepilépticos del veneno de escorpión y determinar su secuencia N-terminal de 50 aminoácidos, la cromatografía de intercambio iónico y la cromatografía de exclusión en gel se utilizan para separar los péptidos analgésicos del veneno crudo, y la cromatografía de un solo paso. Columna ultralarga CM Sephadex C -50 y columna de intercambio catiónico de baja presión para la purificación de péptidos analgésicos a partir de veneno crudo. Por ejemplo, el péptido analgésico y antitumoral del escorpión de Asia oriental (AGAP) es un péptido activo de un solo componente aislado y purificado del veneno del escorpión de Asia oriental. Es un polipéptido básico simple con una única cadena peptídica y un punto isoeléctrico. mayor que 10. Contiene aminoácidos básicos y también es rico en aminoácidos hidrofóbicos. La secuencia de aminoácidos de la parte N-terminal del péptido activo es: VRDGY IADDKNCAYF CGRNA YCDDE.
Para obtener proteínas de alta pureza, la cromatografía de filtración en gel y la cromatografía de intercambio iónico a menudo se utilizan repetidamente. Sin embargo, las desventajas de este método de separación son que la tasa de pérdida de muestra es demasiado alta y la carga de trabajo es grande. . Se están realizando investigaciones sobre el uso de tecnología de ingeniería genética para preparar proteínas específicas del veneno de escorpión, pero el costo es alto y la cantidad limitada. Por lo tanto, el aislamiento del veneno de escorpión crudo sigue siendo la principal fuente de proteínas específicas del veneno de escorpión. El veneno de escorpión sólo se puede conservar durante un corto período de tiempo en un frigorífico normal (1-4°C). Sólo cuando se liofiliza hasta obtener un polvo cristalino se puede conservar su actividad fisiológica. Los principales factores que afectan la estabilidad del polvo seco de veneno de escorpión son la humedad, el aire y la temperatura. Cuando el contenido de humedad del polvo seco es inferior al 10%, puede inhibir la actividad microbiana; cuando el contenido de humedad es inferior al 3%, se inhibirá la actividad química. Por lo tanto, el polvo seco del veneno de escorpión debe envasarse en viales o tubos de ensayo, sellarse con sello fundido o parafina, aislarse del aire y luego almacenarse en un refrigerador de baja temperatura (30°C).
Al transportar veneno fresco de escorpión desde el criadero hasta el departamento de compras, procesamiento o inspección, se debe transportar en botellas de boca ancha y en botellas de hielo (con hielo triturado dentro de las botellas para enfriar). Si el polvo seco de veneno de escorpión se transporta a un lugar distante, también se deben tomar medidas de enfriamiento para evitar la desnaturalización de las proteínas y la inactivación del veneno de escorpión. Los ingredientes activos de la mayoría de las medicinas tradicionales chinas de origen animal no están claros ni se comprenden completamente, y hay poca investigación sobre sus procesos de extracción y purificación. En el proceso de producción de medicamentos patentados chinos, los medicamentos chinos para animales se elaboran básicamente directamente a partir de polvo crudo, y algunos se extraen con agua y alcohol y se refinan mediante el método hidroalcohólico. Dado que la mayoría de los ingredientes activos de la medicina tradicional china animal son macromoléculas como proteínas y polisacáridos o sus productos de hidrólisis, es difícil extraer, separar y purificar completamente estas macromoléculas utilizando métodos convencionales.
Tradicionalmente, el polvo de escorpión se utiliza como medicamento para el veneno de escorpión, que también es un método clínico de uso común. Sin embargo, la cantidad de maicena utilizada es grande y es difícil cumplir con los estándares higiénicos. Al mismo tiempo, la mayoría de los escorpiones se utilizan como medicina utilizando productos procesados en el lugar de origen. El procesamiento de escorpión entero en el área de producción generalmente utiliza hervido o salmuera, pero estos dos métodos tienen muchos puntos irrazonables, como la pérdida y desnaturalización de ingredientes activos, y la calidad es difícil de controlar. Los diferentes contenidos de sal del plomo para cocinar en salmuera. a una dosis clínica inexacta, restringiendo su uso posterior. Las toxinas de escorpión se clasifican principalmente según contengan enlaces disulfuro en su estructura molecular. Una de ellas se puede dividir en canal de Na+, canal de K+, canal de Cl- y canal de Ca2+ (que se encuentra principalmente en la membrana plasmática de las células del músculo esquelético). sus propiedades farmacológicas.
Estos canales iónicos son un tipo de glicoproteína transmembrana con un gran peso molecular en la superficie de la membrana celular. Forman poros hidrófilos especiales en la membrana y son las vías para el intercambio iónico dentro y fuera de la célula. Las membranas celulares de los nervios, músculos, glándulas y otros tejidos pueden generar y conducir señales eléctricas y tener importantes funciones fisiológicas.
Canal iónico de sodio
Según los diferentes modos de acción y sitios de unión, las toxinas de los canales iónicos de sodio se pueden dividir en toxinas alfa y toxinas beta. La alfa-toxina actúa en el sitio 3 del canal de Na+ de manera dependiente del voltaje, retrasando el proceso de inactivación del canal de Na+, desacelerando la atenuación actual del canal de Na+ y prolongando el tiempo del potencial de acción. Según los diferentes objetivos, las toxinas alfa se pueden dividir en cuatro categorías: ① toxinas alfa típicas que son altamente específicas de los mamíferos, ② toxinas alfa de insectos que actúan sobre los insectos, ③ toxinas alfa intermedias que actúan tanto sobre mamíferos como sobre insectos. Las toxinas alfa son similares.
La toxina beta se une a la posición 4 del canal de Na+, afectando el proceso de activación del canal de Na+ y moviendo la curva de activación dependiente del voltaje del canal de Na+ hacia el potencial negativo. Según la especificidad de la toxina β-escorpión por los canales de sodio de insectos y mamíferos y la diferencia en los síntomas cuando actúa sobre los insectos, se puede dividir en: toxina β anti-mamíferos, toxina β excitadora anti-insectos y anti-insectos. toxina β inhibidora y TsVII o toxina gamma-escorpión. La toxina β-escorpión antimamíferos es altamente tóxica para los mamíferos y puede regular la corriente del canal de sodio en el cerebro de los mamíferos bajo abrazadera de parche, incluso si la excitotoxina antiinsectos se inyecta en mamíferos (como el cerebro de ratón), todavía está en su interior. el nivel de miligramos, no tóxico; la toxina inhibidora antiinsectos puede inducir parálisis retardada en los insectos mediante inyección. Utilizando técnicas de patch-clamp, las toxinas inhibidoras antiinsectos desplazan los potenciales de acción de la membrana axonal en la dirección de una fuerte despolarización. La cuarta toxina beta es muy activa en los canales de sodio de los insectos y los mamíferos. Por ejemplo, la toxina Lqhβ1 tiene un efecto inhibidor típico cuando se inyecta en larvas de mosca doméstica.
Canal de iones de potasio
El primer tipo está representado por la caribdotoxina (CTX). Hay tres pares de enlaces disulfuro en la molécula y el modo de emparejamiento es C1-C4, C2-. C5, C3-C6. Sin embargo, CTX es menos selectiva para los subtipos de canales de potasio, lo que ha llevado a su uso generalizado. A partir de la década de 1990, ChTx se desarrolló como un producto de laboratorio. Puede bloquear los canales de K+ activados por Ca2+ de alta conductancia (BKCa), los canales de K+ dependientes de voltaje (como los canales de K+ Shaker en linfocitos y Drosophila), los canales de K+ de tipo A (ovocitos) y los canales de K+ activados por Ca2+ de pequeña conductancia (Aplysia neuronas), que actúan como KV 65438+ dependiente de voltaje en células nerviosas, células sanguíneas y osteoclastos. Se caracterizan por un residuo de ácido piroglutámico en su extremo N, con una similitud de secuencia de aminoácidos del 70%, y los residuos conservados de Phe y Trp están ubicados en las posiciones segunda y 14 de la molécula, respectivamente. Toxinas similares incluyen CTX-Lq2, 1beriotoxina (1bTX), BmTX y PBTX.
La segunda categoría está representada por la noxistoxina (NTX), que fue aislada por primera vez de la toxina del escorpión Centruroides noxius en México. Incluye ocho péptidos aislados de cinco venenos de escorpión. Bloqueador de canales de potasio. Actúa principalmente sobre los canales de K+ dependientes de voltaje, prolonga la duración del potencial de acción y tiene un efecto inhibidor débil sobre los canales de K+ activados por Ca2+ (KCa). Este tipo de toxina tiene un 80% de similitud en la secuencia de aminoácidos con el primer tipo de toxina de escorpión, pero sólo un 40% de similitud. NTx puede bloquear reversiblemente los canales de potasio rectificadores retardados en muestras de axones de calamar, BKCa en muestras de músculo esquelético de rata y canales de potasio dependientes del voltaje en linfocitos T humanos de una manera dependiente de la dosis. Toxinas similares incluyen MgTX, CoTX1, CITX, TsKa y HTX.
La tercera categoría está representada por la Kaliotoxina (KTX), que se aisló por primera vez del veneno crudo del escorpión norteafricano Androctonus Martetanicus Mauretanicus. Incluye 9 péptidos purificados de 7 tipos de venenos de escorpión. , que consta de 37-38, consta de residuos de aminoácidos. Este tipo de toxina tiene entre un 80% y un 90% de similitud en la secuencia de aminoácidos y es entre un 40% y un 50% similar a la primera y segunda categoría. Bloquea los canales de potasio dependientes del voltaje, incluidos los canales de K+ activados por Ca2+ de alta conductancia (BKCa). Toxinas similares incluyen Ag-itoxina 2 (AgTX 2), AeTX 3, KTX 2 y KTX 3.
La cuarta categoría está representada por LTX1, P05 y BmP05, todos compuestos por 31 residuos de aminoácidos, con una similitud de secuencia de aminoácidos del 84%. Son muy tóxicos para los ratones, siendo la dosis letal de la inyección intracerebroventricular inferior a 2 μg/kg. Pueden competir con la apamina por la unión a los receptores de apamina en las membranas sinápticas del ratón y pueden bloquear específicamente los canales de potasio sensibles a la apamina (baja conductancia, activados por Ca2+, activados por Ca2+, canales de K+ sensibles a APAMINA, SKCa) en diferentes tipos de células).
La quinta categoría es la toxina TSK, un 35-péptido aislado de la toxina del escorpión serru-latus producida en Brasil, que contiene una estructura única -Cys-Asp-Cys- en el extremo C terminal. Actúa específicamente sobre los canales de K+ (SKCa) activados por el Ca2+ de pequeña conductancia sensible a la apamina. RodriguesAR y otros estudiosos descubrieron que TsTX-Ka puede bloquear el canal Kvl.3 (un subtipo de canal Shaker K+) en ovocitos de Xenopus con alta afinidad y reversibilidad.
La sexta categoría está representada por MTX (Mauxotoxina), que se aísla de la toxina del escorpión maurus en el norte de África. Incluye cinco polipéptidos aislados de tres venenos de escorpión, que varían en tamaño de 34 a 37 residuos de aminoácidos. variar. La molécula de MTX contiene cuatro pares de enlaces disulfuro que se diferencian de otras toxinas: C1-C4, C2-C5, C3-C6 y C7. Otros métodos de emparejamiento son: C1-C5, C2-C6, C3-C7, C4-C8. Puede bloquear canales de K+ dependientes del voltaje, como los canales Fly ShakerK+, Apamin o canales de K+ sensibles a KTX. Toxinas similares incluyen Pi1, HTX1, Pi4, etc.
El séptimo grupo, representado por P01, consta de 28-29 residuos e incluye cuatro péptidos aislados de tres venenos de escorpión. Es el grupo más pequeño de toxinas de escorpión descubierto hasta ahora, con una similitud en la secuencia de aminoácidos del 76%. Actúa principalmente sobre el canal de K+ activado por Ca2+ de pequeña conductancia (SKCa) que es sensible a la apamina, pero su capacidad de unión es relativamente débil. Es muy tóxico para los ratones (no responde a la inyección intracerebroventricular al nivel de mg). Por lo tanto, aunque estos cuatro péptidos se clasifican como toxinas de los canales de potasio debido a su similitud estructural, sus funciones principales aún están por explorar. Toxinas similares incluyen BmP01 y LPII.
La octava categoría está representada por BmP02, que incluye tres polipéptidos aislados de dos venenos de escorpión: BmP02, BmP03 y LP1. Los 28 polipéptidos aislados del veneno crudo del escorpión chino del este asiático contenían 3 pares de enlaces disulfuro y se diferenciaban solo en un residuo en sus secuencias de aminoácidos. Tiene un efecto débil sobre el canal de K+ (SKCa) activado por el Ca2+ de pequeña conductancia sensible a la apamina y no tiene toxicidad letal para los ratones. Estudios adicionales han demostrado que BmP02 puede debilitar la corriente transitoria de iones de potasio salientes en los cardiomiocitos de conejo, por lo que BmP02 puede usarse como una herramienta para estudiar los canales transitorios de iones de potasio salientes.
La novena categoría son los bloqueadores de los canales de K+ representados por BTK-2, que se aísla del veneno crudo del escorpión rojo indio (Buthus tamulus). Está compuesto por 32 aminoácidos entrecruzados por 6 cisteínas conservadas, con un peso molecular de 3452 Da. BTK-2 comparte entre un 40 % y un 70 % de similitud de secuencia con otros bloqueadores de canales de K+.
Por supuesto, esta agrupación no es absoluta. Varias toxinas se superponen en estructura, especialmente en actividades biológicas. Por ejemplo, CTX no solo actúa sobre BKCa, sino también sobre Kv en linfocitos, Kv en agitadores de Drosophila, canal A (KA) expresado en ovocitos de Xenopus y SKCa en Aplysia. NTX no sólo inhibe el Kv, sino que también inhibe débilmente los canales de potasio activados por calcio (KCa). MTX no solo inhibe los canales de potasio agitadores, sino que también inhibe la unión de apamina y KTX a la membrana sinaptosómica del cerebro de rata.
Canales de calcio
Solo se han aislado dos de estas toxinas: IpTxA y Maurocalcine, que fueron aisladas de toxinas crudas del escorpión Pandinus imperator y del escorpión maurus palmatus. Ambos están compuestos por 33 residuos de aminoácidos, tienen 3 pares de enlaces disulfuro en la molécula y tienen una homología del 82%. La LD50 de ratón es de 20 μg/ratón y puede actuar de forma reversible sobre el receptor de rianodina de tipo muscular (RyRtipo 1).
Las toxinas de los canales de calcio son ricas en residuos básicos y pueden unirse a moléculas de ácidos grasos cargadas negativamente en la membrana celular, destruir la bicapa lipídica y entrar en la membrana para interactuar con los receptores de rianodina intracelulares. El mecanismo molecular de unión a los RyR es el mismo que el del anillo II-III del receptor de dihidroxipirimidina, que activa la liberación de Ca2+ en el retículo endoplásmico mediante la interacción con el receptor de rianodina.
Canal de cloruro
La toxina del canal de cloruro es un polipéptido separado y purificado del veneno de escorpión mediante filtración en gel y HPLC. Tiene afinidad específica por los canales de cloruro específicos de glioma (GCC), pero no en el tejido cerebral normal. El peso molecular es 4070, con 4 enlaces disulfuro y 36 residuos de aminoácidos. Toxinas similares incluyen BeI1, BeI5, AmmP2, etc. La clorotoxina puede inhibir la invasión y metástasis del glioma primario. Según su objetivo, se pueden dividir en toxinas de mamíferos (MTx, contenido de hasta 10%-50%), toxinas de vertebrados y toxinas de insectos, en concreto toxinas antiescorpiones (ITx, contenido inferior al 1%) y neurotoxinas de crustáceos (CTx). La clasificación se basa en las reacciones tóxicas de los polipéptidos del veneno de escorpión inyectados en diferentes animales de experimentación, como ratones, linos o moscas domésticas, crustáceos isópodos, o inyectados en diferentes animales o muestras aisladas. Las toxinas de los mamíferos se pueden dividir en alfa y beta según sus efectos farmacológicos y electrofisiológicos. Las toxinas alfa atenúan la corriente de sodio al inhibir la inactivación de los canales iónicos de sodio en la membrana celular, prolongando significativamente la duración del potencial de acción, mientras que las toxinas beta afectan principalmente la activación de los canales de sodio, moviendo la curva de activación del sodio dependiente del voltaje hacia la membrana negativa. potencial, es decir, efectos excitadores de despolarización causados por Sin embargo, las investigaciones existentes muestran que las definiciones de MTx y CTx no son estrictas ni claras. MTx y CTx tienen diferentes grados de toxicidad para los tres animales, pero son más sensibles al efecto de parálisis de los mamíferos y crustáceos, mientras que la definición de ITx es relativamente razonable.
En 1971, Zlotkin et al. tomaron la iniciativa en purificar la toxina antiinsectos del escorpión Aa IT del escorpión africano Androctons australis y establecieron un método de identificación para la toxina antiinsectos del escorpión. Este método utilizó larvas de sarcófagos como material de identificación y, más tarde, también algunos insectos como moscas domésticas, cucarachas y langostas. Según el efecto de acción, se puede dividir en tipo CP, que tiene un efecto de contracción y parálisis rápida, y tipo FP, que relaja lentamente los músculos del insecto hasta la parálisis completa.
Según la clasificación de los sitios receptores y los efectos electrofisiológicos, el ITx se puede dividir en excitatorio, inhibidor y alfa. Tipo a y tipo b Por supuesto, entre las toxinas antiinsectos, también hay toxinas que son tóxicas para los mamíferos (o crustáceos) y los insectos, pero algunas de ellas son mucho más tóxicas para los insectos que para los mamíferos.