Introducción a la tecnología de imágenes in vivo de células tumorales marcadas con luciferasa
La luciferasa es una molécula de señalización común que se puede utilizar para marcar células tumorales.
1. Método celular
La línea celular estable de cáncer de mama humano MCF-7-luc se obtuvo mediante el cribado G418 y su capacidad de luminiscencia se evaluó in vitro. Al establecer un modelo de tumor trasplantado en un ratón desnudo y utilizar un sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo para detectar el crecimiento y la metástasis del tumor, se proporciona una situación ideal para monitorear los cambios en la eficacia de los fármacos de los tumores trasplantados en ratones desnudos y analizar el efecto terapéutico de los fármacos sobre los tumores.
Determinación de la concentración de detección de G418:
Cultivo en una incubadora de cultivo celular a 37°C, G418 tiene 6 gradientes de concentración de 0, 200, 400, 600, 800 y 1000 μg. /ml. 24 horas después de inocular las células, agréguelas a una placa de 6 pocillos con 2 pocillos para cada concentración. Todas las células morirán en un plazo de 10 a 14 días. Observe el crecimiento celular todos los días. La concentración más baja de G418 es la concentración para la transfección de células MCF-7 clonadas con el plásmido seleccionado.
1) Transfección celular
Inocular células Mcf-7 en la fase de crecimiento logarítmico en una placa de 6 pocillos hasta que la confluencia celular alcance el 80% ~ 90%, luego transfectar Dye TM. La transfección se realizó según las instrucciones del kit Lipofectamine2000. Agregue 8 μg/ml de plásmido pRc/cm v2-luc a 250 μl de medio DMEM libre de suero y anticuerpos. Agregue 10 μl de lipofectaminetm2000 a 250 μl de medio DMEM libre de suero y anticuerpos e incube a temperatura ambiente. durante 5 minutos. Mezcle las dos diluciones anteriores de manera uniforme e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos, luego agregue las células a la placa de pocillos y colóquelas en la incubadora para su cultivo regular.
24 horas después de la transfección, digerir las células con tripsina e inocularlas en una nueva placa de 6 pocillos en una proporción de 1:6. Al mismo tiempo, agregar la concentración determinada experimentalmente de G418 y luego. reemplace el medio de cultivo cada dos días, mantenga la detección de G418 hasta que aparezcan clones resistentes unicelulares. Se seleccionaron clones resistentes individuales en placas de 96 pocillos y luego se transfirieron a placas de 24 pocillos para el subcultivo.
3) Clones positivos identificados por actividad luciferasa.
Cuando un único clon resistente alcanza la quinta generación, se detecta la actividad luciferasa mediante luciferasa seAs-sayAystem. Durante la detección, cada clon se inoculó en una placa de 24 pocillos en una proporción de 65.438+0×65.438+005/pocillo. Después de 24 horas, lisar el lisado celular a 65.438±02.000 rpm, centrifugar a 4°C durante 65.438±00 min y recoger el lisado. Agregue el sobrenadante a una placa blanca de 96 pocillos y agregue 50 l de luciferasa a cada pocillo. Después de permanecer durante 2 segundos, tome el valor de fluorescencia (RLU) durante 10 segundos. Cada clon tiene tres pocillos multiplex. Los clones celulares con valores elevados de RLU se mantuvieron en subcultivo y se detectó actividad luciferasa después de 5 generaciones. Los clones con valores elevados de RLU se retuvieron hasta el paso 30, y el clon con mayor actividad luciferasa fue MCF-7-luc.
Los MCF-4×104, 2×104, 1×104, 5000, 2500, 1250 y 625 se seleccionan mediante la detección de valores de fluorescencia de diferentes números de clones celulares en un grupo. sólo se utilizó el medio de cultivo como control. Se establecieron dos agujeros porosos. El sobrenadante se eliminó de forma rutinaria y se lavó dos veces con PBS. Después de 24 h de incubación con 100 µl de luciferina en PBS hasta una concentración final de 150 µg/ml en cada pocillo, se añadió D-. Se analizó la correlación entre la intensidad de la luminiscencia y el número de células.
4) Dibujar la curva de crecimiento celular
Sembrar células MCF7-luc y células MCF-7 que expresan luciferasa como controles en una placa de 24 pocillos a una densidad de siembra de 2×104/ agujero. De 1 a 7 días después de la inoculación celular, se digirieron 3 células con tripsina cada día y se midió el número de células con un contador celular. Tomando el número de células como ordenada y el número de células como abscisa, se dibujaron dos curvas de crecimiento celular.
Dos.
Modelo animal
Establecimiento de modelo tumoral de xenoinjerto subcutáneo en ratones desnudos BLAB/c Ratones desnudos BLAB/cnu/nu, de 4 a 5 semanas de edad, peso corporal (65438±05±2)g, 3 machos y 3 Sólo mujeres. Se resuspendió MCF-7 en la fase de crecimiento logarítmico en PBS hasta una suspensión de 2,5 x 106/ml, y se inocularon 100 µl por vía subcutánea en la axila dorsal izquierda y derecha de cada ratón desnudo, y se inocularon 6 ratones * * *. Al quinto día después de la inoculación se detectó la intensidad de la señal mediante el sistema de imágenes in vivo de la empresa alemana BERTHOLD. Posteriormente, se realizaron observaciones continuas cada 5 días durante 30 días. Antes de la observación, cada ratón desnudo fue anestesiado con pentobarbital sódico (35 mg/kg de peso corporal) y se le inyectó fluoresceína (invivograda) por vía intraperitoneal a 65.438+0,50 mg/kg de peso corporal. Después de 65.438+00 min, se observó el crecimiento de los tumores subcutáneos. imágenes in vivo y análisis cuantitativo de los valores de fluorescencia en cada momento. Dibuje la curva de crecimiento subcutáneo del tumor.
Observación patológica de tumores subcutáneos trasplantados de células MCF-7-luc en ratones desnudos
Veinticinco días después de que ratones desnudos fueran inoculados por vía subcutánea con células MCF-7-luc, los ratones se sacrificaron quitándoles el cuello y recogiéndolo. El tejido tumoral se hizo en secciones de parafina con un espesor de 3 μm, y se observó la morfología patológica de las células después de la tinción con HE.
La tecnología de imágenes de animales vivos es una nueva tecnología estable y confiable desarrollada recientemente y es un medio poderoso para detectar eventos moleculares y celulares en animales. Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) se pueden utilizar para detectar de forma directa y precisa el tamaño de las lesiones in vivo.
Disponemos de nuestro propio laboratorio independiente de síntesis orgánica que puede producir y sintetizar diversos reactivos quimioluminiscentes. Podemos proporcionar reactivos quimioluminiscentes, sustratos quimioluminiscentes, etiquetas luminiscentes, potenciadores de luminiscencia, sondas colorantes, sustratos cromogénicos para microorganismos y enzimas y reactivos de diagnóstico in vitro.
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