Experimento de purificación de proteínas
(1) Métodos de separación basados en diferentes solubilidades de proteínas.
1. Salación de proteínas
La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de las proteínas. Generalmente, en condiciones de baja concentración de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, aumenta la solubilidad de la proteína, lo que se denomina solubilidad de la sal. Cuando la concentración de sal continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita una tras otra. Este fenómeno se llama salazón. Cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, los iones de sal de alta concentración (como SO4 y NH4 del sulfato de amonio) tienen una fuerte fuerza de hidratación, que puede agarrar la capa de hidratación de las moléculas de proteína y "deshidratarlas". así las micelas de proteínas Condensación y precipitación. Durante la salazón, si el valor del pH de la solución está en el punto isoeléctrico de la proteína, el efecto será mejor. Debido a los diferentes tamaños de partículas y la hidrofilicidad de las distintas moléculas de proteínas, las concentraciones de sal necesarias para la salinización también son diferentes. Por lo tanto, ajustar la concentración de sal neutra en la solución de proteína mixta puede precipitar varias proteínas en etapas.
Los factores que influyen en el salado son: (1) Temperatura: Salvo las proteínas termosensibles que operan a bajas temperaturas (4 grados), generalmente se pueden realizar a temperatura ambiente. Generalmente, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas. Sin embargo, algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina) son menos solubles a temperaturas más altas (25 grados) que a 0 grados y es más probable que se salten. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas tienen la solubilidad más baja en soluciones salinas concentradas en su punto isoeléctrico. (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otras proteínas (* * * fenómeno de precipitación). Por lo tanto, antes de salar, el suero debe diluirse con una cantidad igual de solución salina fisiológica para que el contenido de proteínas sea de 2,5 a 3,0.
Las sales neutras comúnmente utilizadas en la salazón de proteínas incluyen principalmente sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio. El sulfato de amonio más utilizado tiene las ventajas de un bajo coeficiente de temperatura y una alta solubilidad (la solución saturada a 25 °C es 4,1 M o 767 g/L; la solubilidad saturada a 0 °C es 3,9 M o 676 g/L). Dentro de este rango de solubilidad, muchas proteínas y enzimas pueden salarse. Además, el efecto de eliminación progresiva de sal del sulfato de amonio es mejor que el de otras sales y es menos probable que provoque la desnaturalización de las proteínas. El pH de las soluciones de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo con ácido sulfúrico o amoníaco.
Después de separar la proteína mediante salazón y precipitación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método habitual es la diálisis, es decir, la solución de proteína se coloca en una bolsa para su análisis (a menudo se usa celofán), se dializa con un tampón y el tampón se reemplaza constantemente. Debido a que la diálisis lleva mucho tiempo, es mejor realizarla a bajas temperaturas. Además, también se puede utilizar Glucosa Gel G-25 o G-50 para eliminar sales a través de la columna, lo que requiere menos tiempo.
2. Método de precipitación isoeléctrica
Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es mínima, por lo que la solubilidad es mínima. Varias proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos. La precipitación se puede lograr ajustando el valor del pH de la solución para alcanzar el punto isoeléctrico de la proteína, pero este método rara vez se usa solo y puede combinarse con el método de sal.
3. Método de precipitación con disolventes orgánicos a baja temperatura
El uso de disolventes orgánicos miscibles en agua, como metanol, etanol o acetona, puede reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y precipitarlas. La resolución de este método es mayor que la del método de salazón, pero la proteína se desnaturaliza fácilmente y debe realizarse a baja temperatura.
(2) Diferentes métodos de separación según el tamaño de las moléculas de proteínas.
1. Diálisis y ultrafiltración
La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas de diferentes tamaños moleculares.
La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras pequeñas moléculas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas filtrantes con diferentes tamaños de poro para retener proteínas de diferentes pesos moleculares.
2. Filtración en gel
También conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, es uno de los métodos más eficaces para separar mezclas de proteínas en función del tamaño molecular. Los materiales de relleno más utilizados en las columnas son Sephadex ged y gel de agarosa.
(3) Separar según las propiedades cargadas de las proteínas.
Las proteínas tienen diferentes propiedades de carga y cantidades de carga en diferentes entornos de pH, por lo que pueden separarse.
1. Electroforesis
Bajo las mismas condiciones de pH, se pueden separar varias proteínas debido a diferentes pesos y cargas moleculares y a diferente movilidad en el campo eléctrico. Cabe destacar la electroforesis por enfoque isoeléctrico, que utiliza un anfolito como portador. Durante la electroforesis, el anfolito forma un gradiente de pH que aumenta gradualmente desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Cuando una proteína con una determinada carga nada en ella, la posición del pH en su punto isoeléctrico se detiene. Este método se puede utilizar para analizar y preparar una variedad de proteínas.
2. Cromatografía de intercambio iónico
Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE? FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " gt; Celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de la columna de cromatografía de intercambio iónico, la proteína con la carga opuesta al intercambiador de iones se adsorbe en el intercambiador de iones, la proteína adsorbida luego se eluye cambiando el pH o la fuerza iónica. (Consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles)
(4) Cromatografía de afinidad, un método de separación basado en la especificidad del ligando.
La cromatografía limitada es un método muy eficaz para separar proteínas. Aislar una proteína de una mezcla muy compleja de proteínas a menudo requiere solo un paso y la pureza es muy alta. Este método se basa en el hecho de que algunas proteínas pueden unirse específicamente a otra molécula llamada ligando, en lugar de a un ligando. El principio básico es que las proteínas existen como mezclas complejas en tejidos o células, y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes, por lo que el aislamiento, purificación y caracterización de proteínas es una parte importante de la bioquímica. Hasta el momento, no existe un método único o un conjunto de métodos preparados que puedan extraer cualquier proteína de una mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se utilizan varios métodos en combinación.
Existen muchos métodos para la separación y purificación de proteínas, que incluyen principalmente:
(1) Métodos de separación basados en diferentes solubilidades de proteínas.
1. Salación de proteínas
La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de las proteínas. Generalmente, en condiciones de baja concentración de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, aumenta la solubilidad de la proteína, lo que se denomina solubilidad de la sal. Cuando la concentración de sal continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita una tras otra. Este fenómeno se llama salazón. Cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, los iones de sal de alta concentración (como SO4 y NH4 del sulfato de amonio) tienen una fuerte fuerza de hidratación, que puede agarrar la capa de hidratación de las moléculas de proteína y "deshidratarlas". así las micelas de proteínas Condensación y precipitación. Durante la salazón, si el valor del pH de la solución está en el punto isoeléctrico de la proteína, el efecto será mejor. Debido a los diferentes tamaños de partículas y la hidrofilicidad de las distintas moléculas de proteínas, las concentraciones de sal necesarias para la salinización también son diferentes. Por lo tanto, ajustar la concentración de sal neutra en la solución de proteína mixta puede precipitar varias proteínas en etapas.
Los factores que influyen en el salado son: (1) Temperatura: Salvo las proteínas termosensibles que operan a bajas temperaturas (4 grados), generalmente se pueden realizar a temperatura ambiente. Generalmente, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas. Sin embargo, algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina) son menos solubles a temperaturas más altas (25 grados) que a 0 grados y es más probable que se salten. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas tienen la solubilidad más baja en soluciones salinas concentradas en su punto isoeléctrico. (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otras proteínas (* * * fenómeno de precipitación). Por lo tanto, antes de salar, el suero debe diluirse con una cantidad igual de solución salina fisiológica para que el contenido de proteínas sea de 2,5 a 3,0.
Las sales neutras comúnmente utilizadas en la salazón de proteínas incluyen principalmente sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio. El sulfato de amonio más utilizado tiene las ventajas de un bajo coeficiente de temperatura y una alta solubilidad (la solución saturada a 25 °C es 4,1 M o 767 g/L; la solubilidad saturada a 0 °C es 3,9 M o 676 g/L). Dentro de este rango de solubilidad, muchas proteínas y enzimas pueden salarse.
Además, el efecto de eliminación progresiva de sal del sulfato de amonio es mejor que el de otras sales y es menos probable que provoque la desnaturalización de las proteínas. El pH de las soluciones de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo con ácido sulfúrico o amoníaco.
Después de separar la proteína mediante salazón y precipitación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método habitual es la diálisis, es decir, la solución de proteína se coloca en una bolsa para su análisis (a menudo se usa celofán), se dializa con un tampón y el tampón se reemplaza constantemente. Debido a que la diálisis lleva mucho tiempo, es mejor realizarla a bajas temperaturas. Además, también se puede utilizar Glucosa Gel G-25 o G-50 para eliminar sales a través de la columna, lo que requiere menos tiempo.
2. Método de precipitación isoeléctrica
Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es mínima, por lo que la solubilidad es mínima. Varias proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos. La precipitación se puede lograr ajustando el valor del pH de la solución para alcanzar el punto isoeléctrico de la proteína, pero este método rara vez se usa solo y puede combinarse con el método de sal.
3. Método de precipitación con disolventes orgánicos a baja temperatura
El uso de disolventes orgánicos miscibles en agua, como metanol, etanol o acetona, puede reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y precipitarlas. La resolución de este método es mayor que la del método de salazón, pero la proteína se desnaturaliza fácilmente y debe realizarse a baja temperatura.
(2) Diferentes métodos de separación según el tamaño de las moléculas de proteínas.
1. Diálisis y ultrafiltración
La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas de diferentes tamaños moleculares.
La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras pequeñas moléculas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas filtrantes con diferentes tamaños de poro para retener proteínas de diferentes pesos moleculares.
2. Filtración en gel
También conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, es uno de los métodos más eficaces para separar mezclas de proteínas en función del tamaño molecular. Los materiales de relleno más utilizados en las columnas son Sephadex ged y gel de agarosa.
(3) Separar según las propiedades cargadas de las proteínas.
Las proteínas tienen diferentes propiedades de carga y cantidades de carga en diferentes entornos de pH, por lo que pueden separarse.
1. Electroforesis
Bajo las mismas condiciones de pH, se pueden separar varias proteínas debido a diferentes pesos y cargas moleculares y a diferente movilidad en el campo eléctrico. Cabe destacar la electroforesis por enfoque isoeléctrico, que utiliza un anfolito como portador. Durante la electroforesis, el anfolito forma un gradiente de pH que aumenta gradualmente desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Cuando una proteína con una determinada carga nada en ella, la posición del pH en su punto isoeléctrico se detiene. Este método se puede utilizar para analizar y preparar una variedad de proteínas.
2. Cromatografía de intercambio iónico
Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE? FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " gt; Celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de la columna de cromatografía de intercambio iónico, la proteína con la carga opuesta al intercambiador de iones se adsorbe en el intercambiador de iones, la proteína adsorbida luego se eluye cambiando el pH o la fuerza iónica. (Consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles)
(4) Cromatografía de afinidad, un método de separación basado en la especificidad del ligando.
La cromatografía limitada es un método muy eficaz para separar proteínas. Aislar una proteína de una mezcla muy compleja de proteínas a menudo requiere solo un paso y la pureza es muy alta. Este método se basa en el hecho de que algunas proteínas pueden unirse específicamente a otra molécula llamada ligando, en lugar de a un ligando. El principio básico es que las proteínas existen como mezclas complejas en tejidos o células, y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes, por lo que el aislamiento, purificación y caracterización de proteínas es una parte importante de la bioquímica. Hasta el momento, no existe ningún método o conjunto de métodos preparados que puedan extraer cualquier proteína de una mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se utilizan varios métodos en combinación.
Existen muchos métodos para la separación y purificación de proteínas, que incluyen principalmente:
(1) Métodos de separación basados en diferentes solubilidades de proteínas.
1. Salación de proteínas
La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de las proteínas. Generalmente, en condiciones de baja concentración de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, aumenta la solubilidad de la proteína, lo que se denomina solubilidad de la sal. Cuando la concentración de sal continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita una tras otra. Este fenómeno se llama salazón. Cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, los iones de sal de alta concentración (como SO4 y NH4 del sulfato de amonio) tienen una fuerte fuerza de hidratación, que puede agarrar la capa de hidratación de las moléculas de proteína y "deshidratarlas". así las micelas de proteínas Condensación y precipitación. Durante la salazón, si el valor del pH de la solución está en el punto isoeléctrico de la proteína, el efecto será mejor. Debido a los diferentes tamaños de partículas y la hidrofilicidad de las distintas moléculas de proteínas, las concentraciones de sal necesarias para la salinización también son diferentes. Por lo tanto, ajustar la concentración de sal neutra en la solución de proteína mixta puede precipitar varias proteínas en etapas.
Los factores que influyen en el salado son: (1) Temperatura: Salvo las proteínas termosensibles que operan a bajas temperaturas (4 grados), generalmente se pueden realizar a temperatura ambiente. Generalmente, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas. Sin embargo, algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina) son menos solubles a temperaturas más altas (25 grados) que a 0 grados y es más probable que se salten. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas tienen la solubilidad más baja en soluciones salinas concentradas en su punto isoeléctrico. (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otras proteínas (* * * fenómeno de precipitación). Por lo tanto, antes de salar, el suero debe diluirse con una cantidad igual de solución salina fisiológica para que el contenido de proteínas sea de 2,5 a 3,0.
Las sales neutras comúnmente utilizadas en la salazón de proteínas incluyen principalmente sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio. El sulfato de amonio más utilizado tiene las ventajas de un bajo coeficiente de temperatura y una alta solubilidad (la solución saturada a 25 °C es 4,1 M o 767 g/L; la solubilidad saturada a 0 °C es 3,9 M o 676 g/L). Dentro de este rango de solubilidad, muchas proteínas y enzimas pueden salarse. Además, el efecto de eliminación progresiva de sal del sulfato de amonio es mejor que el de otras sales y es menos probable que provoque la desnaturalización de las proteínas. El pH de las soluciones de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo con ácido sulfúrico o amoníaco.
Después de separar la proteína mediante salazón y precipitación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método habitual es la diálisis, es decir, la solución de proteína se coloca en una bolsa para su análisis (a menudo se usa celofán), se dializa con un tampón y el tampón se reemplaza constantemente. Debido a que la diálisis lleva mucho tiempo, es mejor realizarla a bajas temperaturas. Además, también se puede utilizar Glucosa Gel G-25 o G-50 para eliminar sales a través de la columna, lo que requiere menos tiempo.
2. Método de precipitación isoeléctrica
Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es mínima, por lo que la solubilidad es mínima. Varias proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos. La precipitación se puede lograr ajustando el valor del pH de la solución para alcanzar el punto isoeléctrico de la proteína, pero este método rara vez se usa solo y puede combinarse con el método de sal.
3. Método de precipitación con disolventes orgánicos a baja temperatura
El uso de disolventes orgánicos miscibles en agua, como metanol, etanol o acetona, puede reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y precipitarlas. La resolución de este método es mayor que la del método de salazón, pero la proteína se desnaturaliza fácilmente y debe realizarse a baja temperatura.
(2) Diferentes métodos de separación según el tamaño de las moléculas de proteínas.
1. Diálisis y ultrafiltración
La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas de diferentes tamaños moleculares.
La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras pequeñas moléculas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas filtrantes con diferentes tamaños de poro para retener proteínas de diferentes pesos moleculares.
2. Filtración en gel
También conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, es uno de los métodos más eficaces para separar mezclas de proteínas en función del tamaño molecular. Los materiales de relleno más utilizados en las columnas son Sephadex ged y gel de agarosa.
(3) Separar según las propiedades cargadas de las proteínas.
Las proteínas tienen diferentes propiedades de carga y cantidades de carga en diferentes entornos de pH, por lo que pueden separarse.
1. Electroforesis
Bajo las mismas condiciones de pH, se pueden separar varias proteínas debido a diferentes pesos y cargas moleculares y a diferente movilidad en el campo eléctrico. Cabe destacar la electroforesis por enfoque isoeléctrico, que utiliza un anfolito como portador. Durante la electroforesis, el anfolito forma un gradiente de pH que aumenta gradualmente desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Cuando una proteína con una determinada carga nada en ella, la posición del pH en su punto isoeléctrico se detiene. Este método se puede utilizar para analizar y preparar una variedad de proteínas.
2. Cromatografía de intercambio iónico
Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE? FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " gt; Celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de la columna de cromatografía de intercambio iónico, la proteína con la carga opuesta al intercambiador de iones se adsorbe en el intercambiador de iones, la proteína adsorbida luego se eluye cambiando el pH o la fuerza iónica. (Consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles)
(4) Cromatografía de afinidad, un método de separación basado en la especificidad del ligando.
La cromatografía limitada es un método muy eficaz para separar proteínas. Aislar una proteína de una mezcla muy compleja de proteínas a menudo requiere solo un paso y la pureza es muy alta. Este método se basa en el hecho de que algunas proteínas pueden unirse específicamente a otra molécula llamada ligando, en lugar de a un ligando. El principio básico es que las proteínas existen como mezclas complejas en tejidos o células, y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes, por lo que el aislamiento, purificación y caracterización de proteínas es una parte importante de la bioquímica. Hasta el momento, no existe ningún método o conjunto de métodos preparados que puedan extraer cualquier proteína de una mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se utilizan varios métodos en combinación. Existen muchos métodos para la separación y purificación de proteínas, que incluyen principalmente:
(1) Métodos de separación basados en diferentes solubilidades de proteínas.
1. Salación de proteínas
La sal neutra tiene un impacto significativo en la solubilidad de las proteínas. Generalmente, en condiciones de baja concentración de sal, a medida que aumenta la concentración de sal, aumenta la solubilidad de la proteína, lo que se denomina solubilidad de la sal. Cuando la concentración de sal continúa aumentando, la solubilidad de la proteína disminuye en diversos grados y precipita una tras otra. Este fenómeno se llama salazón. Cuando se agrega una gran cantidad de sal a la solución de proteína, los iones de sal de alta concentración (como SO4 y NH4 del sulfato de amonio) tienen una fuerte fuerza de hidratación, que puede agarrar la capa de hidratación de las moléculas de proteína y "deshidratarlas". así las micelas de proteínas Condensación y precipitación. Durante la salazón, si el valor del pH de la solución está en el punto isoeléctrico de la proteína, el efecto será mejor. Debido a los diferentes tamaños de partículas y la hidrofilicidad de las distintas moléculas de proteínas, las concentraciones de sal necesarias para la salinización también son diferentes. Por lo tanto, ajustar la concentración de sal neutra en la solución de proteína mixta puede precipitar varias proteínas en etapas.
Los factores que influyen en el salado son: (1) Temperatura: Salvo las proteínas termosensibles que operan a bajas temperaturas (4 grados), generalmente se pueden realizar a temperatura ambiente. Generalmente, la solubilidad de las proteínas disminuye a bajas temperaturas. Sin embargo, algunas proteínas (como la hemoglobina, la mioglobina y la albúmina) son menos solubles a temperaturas más altas (25 grados) que a 0 grados y es más probable que se salten. (2) Valor de pH: la mayoría de las proteínas tienen la solubilidad más baja en soluciones salinas concentradas en su punto isoeléctrico. (3) Concentración de proteínas: cuando la concentración de proteínas es alta, la proteína que se va a separar a menudo precipita junto con otras proteínas (* * * fenómeno de precipitación). Por lo tanto, antes de salar, el suero debe diluirse con una cantidad igual de solución salina fisiológica para que el contenido de proteínas sea de 2,5 a 3,0.
Las sales neutras comúnmente utilizadas en la salazón de proteínas incluyen principalmente sulfato de amonio, sulfato de magnesio, sulfato de sodio, cloruro de sodio y fosfato de sodio. El sulfato de amonio más utilizado tiene las ventajas de un bajo coeficiente de temperatura y una alta solubilidad (la solución saturada a 25 °C es 4,1 M o 767 g/L; la solubilidad saturada a 0 °C es 3,9 M o 676 g/L). Dentro de este rango de solubilidad, muchas proteínas y enzimas pueden salarse.
Además, el efecto de eliminación progresiva de sal del sulfato de amonio es mejor que el de otras sales y es menos probable que provoque la desnaturalización de las proteínas. El pH de las soluciones de sulfato de amonio suele estar entre 4,5 y 5,5. Cuando se sala con otros valores de pH, es necesario ajustarlo con ácido sulfúrico o amoníaco.
Después de separar la proteína mediante salazón y precipitación, es necesario eliminar la sal de la proteína. El método habitual es la diálisis, es decir, la solución de proteína se coloca en una bolsa para su análisis (a menudo se usa celofán), se dializa con un tampón y el tampón se reemplaza constantemente. Debido a que la diálisis lleva mucho tiempo, es mejor realizarla a bajas temperaturas. Además, también se puede utilizar Glucosa Gel G-25 o G-50 para eliminar sales a través de la columna, lo que requiere menos tiempo.
2. Método de precipitación isoeléctrica
Cuando la proteína está en estado electrostático, la repulsión electrostática entre partículas es mínima, por lo que la solubilidad es mínima. Varias proteínas tienen diferentes puntos isoeléctricos. La precipitación se puede lograr ajustando el valor del pH de la solución para alcanzar el punto isoeléctrico de la proteína, pero este método rara vez se usa solo y puede combinarse con el método de sal.
3. Método de precipitación con disolventes orgánicos a baja temperatura
El uso de disolventes orgánicos miscibles en agua, como metanol, etanol o acetona, puede reducir la solubilidad de la mayoría de las proteínas y precipitarlas. La resolución de este método es mayor que la del método de salazón, pero la proteína se desnaturaliza fácilmente y debe realizarse a baja temperatura.
(2) Diferentes métodos de separación según el tamaño de las moléculas de proteínas.
1. Diálisis y ultrafiltración
La diálisis utiliza una membrana semipermeable para separar proteínas de diferentes tamaños moleculares.
La ultrafiltración utiliza alta presión o fuerza centrífuga para forzar el agua y otras pequeñas moléculas de soluto a través de una membrana semipermeable, mientras las proteínas permanecen en la membrana. Se pueden seleccionar membranas filtrantes con diferentes tamaños de poro para retener proteínas de diferentes pesos moleculares.
2. Filtración en gel
También conocida como cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de tamiz molecular, es uno de los métodos más eficaces para separar mezclas de proteínas en función del tamaño molecular. Los materiales de relleno más utilizados en las columnas son Sephadex ged y gel de agarosa.
(3) Separar según las propiedades cargadas de las proteínas.
Las proteínas tienen diferentes propiedades de carga y cantidades de carga en diferentes entornos de pH, por lo que pueden separarse.
1. Electroforesis
Bajo las mismas condiciones de pH, se pueden separar varias proteínas debido a diferentes pesos y cargas moleculares y a diferente movilidad en el campo eléctrico. Cabe destacar la electroforesis por enfoque isoeléctrico, que utiliza un anfolito como portador. Durante la electroforesis, el anfolito forma un gradiente de pH que aumenta gradualmente desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Cuando una proteína con una determinada carga nada en ella, la posición del pH en su punto isoeléctrico se detiene. Este método se puede utilizar para analizar y preparar una variedad de proteínas.
2. Cromatografía de intercambio iónico
Los intercambiadores iónicos incluyen intercambiadores catiónicos (como carboximetilcelulosa; CM-celulosa) e intercambiadores aniónicos (dietilaminoetilcelulosa; DEAE? FONT FACE= "天" LANG = " ZH-CN " gt; Celulosa), cuando la solución de proteína separada fluye a través de la columna de cromatografía de intercambio iónico, la proteína con la carga opuesta al intercambiador de iones se adsorbe en el intercambiador de iones, la proteína adsorbida luego se eluye cambiando el pH o la fuerza iónica. (Consulte el capítulo sobre tecnología de cromatografía para obtener más detalles)
(4) Cromatografía de afinidad, un método de separación basado en la especificidad del ligando.
La cromatografía limitada es un método muy eficaz para separar proteínas. Aislar una proteína de una mezcla muy compleja de proteínas a menudo requiere solo un paso y la pureza es muy alta. Este método se basa en el hecho de que algunas proteínas pueden unirse específicamente a otra molécula llamada ligando, en lugar de a un ligando. El principio básico es que las proteínas existen como mezclas complejas en tejidos o células, y cada tipo de célula contiene miles de proteínas diferentes, por lo que el aislamiento, purificación y caracterización de proteínas es una parte importante de la bioquímica. Hasta el momento, no existe ningún método o conjunto de métodos preparados que puedan extraer cualquier proteína de una mezcla compleja de proteínas, por lo que a menudo se utilizan varios métodos en combinación.
Tengo una pregunta importante, necesito puntos, ¡elígeme como la mejor respuesta!