Modelo cinético del proceso de fermentación de sisomicina.
La sisomicina (SISO) es un importante antibiótico aminoglucósido polibásico, débilmente básico, soluble en agua que contiene dobles enlaces. Es un pseudobiótico de gentamicina-sisomicina. Los antibióticos trisacáridos de gentamicina son cisomicina, el derivado deshidroxilado del antibiótico JI-. 20A, o la droga sintética netilmicina (NET) y el nuevo compuesto cisomicina hidrogenada (es decir, pobre en 5′). En cuanto a las materias primas para la producción de gentamicina C1a, la sisomicina producida en China representa aproximadamente el 80% de la producción mundial. , la investigación sobre la optimización y el control del proceso de fermentación de sisomicina está muy rezagada. Optimizar y controlar el proceso de fermentación es un objetivo importante y un punto de investigación en ingeniería de fermentación, y establecer un modelo matemático es la premisa y la clave para lograr un control óptimo del proceso de fermentación.
Existen muchos informes nacionales y extranjeros sobre la investigación cinética del proceso de fermentación de metabolitos microbianos como nucleótidos, aminoácidos y penicilina, pero para el estudio de las características cinéticas de la fermentación de sisomicina y la optimización de el proceso de fermentación. No existen informes relevantes sobre control.
Basado en el estudio de las características cinéticas de la fermentación discontinua de sisomicina, este estudio explora cuantitativamente los efectos del crecimiento bacteriano, el consumo de sustrato y la síntesis del producto durante el proceso de fermentación discontinua de sisomicina en función de la influencia mutua y. reglas de equilibrio dinámico, se estableció un modelo de cinética de fermentación para guiar la simulación, predicción y control de optimización del proceso de fermentación discontinua de sisomicina.
Materiales y métodos Cultivo inclinado: almidón soluble, nitrato de potasio, cloruro de sodio, salvado, carbonato de calcio, agar, sulfato de magnesio, ácido aspártico, hidrogenofosfato dipotásico, pH 7,0 antes de la digestión, inoculación Luego incubar a 37° C durante 8 a 10 días y almacene las inclinaciones frescas en una cámara frigorífica (-4°C) durante 3 a 7 días antes de su uso.
Cultivo de semillas: almidón de maíz, torta de soja en polvo, peptona, levadura en polvo, sulfato de magnesio, carbonato de calcio, pH 7,0 antes de la desinfección, 35 ℃ después de la inoculación, 24 r/min durante 48 horas antes del trasplante.
Cultivo de fermentación en matraz agitado: almidón de maíz, polvo de torta de soja, maltosa, licor de maceración de maíz, sulfato de magnesio, cloruro de amonio, hidrogenofosfato dipotásico, carbonato de calcio, metionina y cloruro de cobalto, control de pH 7,0 después de la digestión ~7,2; , cantidad de inoculación 10 %, 34 °C, 240 r/min, agitar la fermentación en matraz durante 36 horas, luego cambiar la temperatura a 32 °C, agitar la fermentación en matraz hasta el final de 96 horas, llenar el volumen de un matraz triangular de 50 ml/500 ml. Cultivo de fermentación en tanque Braun de 5 L y producción de fermentación en tanque industrial de 30 m3: el medio de cultivo es el mismo que la fórmula del matraz agitado, la cantidad de inoculación es del 10,0% al 12,5%, el pH posterior a la desinfección se controla en 7,0~7,2 y el disuelto concentración de oxígeno DO≥8,5% (basado en oxígeno puro, pasado Cambie el volumen de ventilación y la velocidad de agitación para el control por fases), fermente a 34 °C durante 36 horas y luego cambie la temperatura a 32 °C para la fermentación. En cierto estado, comienza la alimentación y el ciclo de fermentación dura aproximadamente de 92 a 96 horas. La sisomicina (P) se midió usando el método HPLC, la concentración de células bacterianas (X) se midió usando el método de peso seco de células lavadas, la concentración de azúcar total (St) y la concentración de azúcar reductor (S) se midieron usando el método yodométrico de Fehling, y la glucosa (G) se midió usando el kit de glucosa en sangre del método de la azúcar oxidasa, se midió la maltosa (M) y la actividad aparente de la hidrolasa de almidón (E) se midió usando cromatografía líquida de alta resolución.
WBC ha encontrado en el estudio de la literatura sobre las características cinéticas de la fermentación por lotes de sisomicina que existe un efecto obvio de inhibición del producto en el proceso de fermentación por lotes de sisomicina utilizando almidón como principal fuente de carbono, la sisomicina fue durante el lote; En la fermentación de la estrella de arroz, el sustrato de azúcar absorbido y utilizado por las bacterias es principalmente maltosa. En la última etapa de la fermentación, la actividad enzimática del almidón hidrolasa en el caldo de fermentación es insuficiente y la concentración de azúcares fermentables disminuye rápidamente, lo que afectará la síntesis de productos de estrella de arroz Las concentraciones óptimas de glucosa y maltosa para el crecimiento bacteriano son 7,5~15,0 y 10,0~25,0 g/L respectivamente. La concentración de maltosa más adecuada para la síntesis de productos de sisomicina es 10,0~15,0 g/L. Cuando la concentración inicial de almidón es de 65,0 g/L, las características metabólicas microbianas de un proceso de fermentación por lotes industrial típico de sisomicina La fermentación por lotes de sisomicina es un proceso típico de síntesis de metabolitos secundarios. La síntesis del producto está estrechamente relacionada con el crecimiento de. las bacterias. No existe una correlación obvia con el crecimiento. 7 ~ 25 h después de la inoculación es la fase de crecimiento logarítmico de las bacterias, 25 ~ 37 h es el período de transición, durante el cual las bacterias continúan creciendo y comienzan a sintetizar productos, 37 ~. 85 h es el período de síntesis del producto y 85 h. La actividad bacteriana disminuyó después de horas.
En este estudio se estableció un modelo cinético de fermentación que se ajusta a las características metabólicas de los microorganismos para diferentes períodos de fermentación en etapas. Se estableció un modelo cinético para la fase de crecimiento bacteriano de 7 a 25 h y un modelo cinético para la fase de síntesis del producto. se estableció durante 37 a 85 h.
Establecimiento de un modelo cinético para la fase de crecimiento bacteriano
Durante el proceso de fermentación, la tasa de crecimiento de las bacterias productoras de sisomicina está estrechamente relacionada con la temperatura, el valor del pH, la concentración del sustrato, y producto del sistema de fermentación. La concentración está relacionada con la concentración de bacterias. En la fase de crecimiento logarítmico, la concentración del producto no tuvo un efecto inhibidor sobre el crecimiento bacteriano. Dentro del rango de concentración de sustrato experimental para establecer este modelo (ρSf≤15,2 g/L), no se observó ningún efecto del sustrato de azúcar fermentable sobre el crecimiento bacteriano. efecto inhibidor. Por lo tanto, durante la fase de crecimiento celular, cuando la temperatura de fermentación se controla a 34°C y el valor del pH es 7,1, el modelo matemático de la tasa de crecimiento celular se puede expresar mediante la ecuación de Monod: f Durante la fase de crecimiento logarítmico de la célula , el producto de sisomicina aún no se ha formado. En este momento, el consumo de sustrato se utiliza principalmente para el crecimiento y mantenimiento de células bacterianas. Establecer un modelo de consumo total de azúcar basado en el balance de materia: -dρStdt=dρXYXdt+mρX.
El cambio en el azúcar fermentable durante el proceso de fermentación es igual al azúcar fermentable producido por la degradación de la hidrolasa del almidón menos el azúcar fermentable consumido para el crecimiento y mantenimiento de las bacterias. La cantidad de azúcar fermentable consumida es igual. a Cantidad total de azúcar consumida. El balance de materia de azúcares fermentables durante el proceso de fermentación se puede expresar como: dρSfdt=ESf-dρXYXdt+mρX⑶
Bajo las condiciones de este experimento, la tasa de producción de azúcares fermentables en el caldo de fermentación durante el crecimiento bacteriano La fase se puede expresar como: ESf =-0.007 6t2+0.257 4t-1.314 7⑷ Por lo tanto, la ecuación ⑴~ forma el modelo cinético de la etapa de crecimiento bacteriano.
Estimación de parámetros y evaluación de aplicabilidad del modelo
En el proceso de fermentación por lotes de sisomicina, los cuatro parámetros indeterminados (μm, KS, YX y m) utilizan MathCAD para la estimación de mínimos cuadrados. La función objetivo J es la desviación relativa de los datos experimentales Yij y los datos de cálculo del modelo Zij de las tres variables de estado (ρSt, ρSf y ρX) en 7 momentos de muestreo dentro de 7 a 25 horas de fermentación cuadrada.
Utilice el método de resolución de problemas de optimización proporcionado por MathCAD para resolver mediante programación el sistema de ecuaciones diferenciales y realice una búsqueda de optimización de los parámetros indeterminados para obtener los valores de los parámetros indeterminados cuando la función objetivo alcance el valor mínimo. . De acuerdo con los datos experimentales y el modelo anterior, finalmente se calculó que el valor de la función objetivo J del período de crecimiento bacteriano era 0,011. Los resultados de la estimación de los parámetros del modelo cinético del período de crecimiento bacteriano se muestran en la Tabla 1. Los valores predichos. del modelo cinético del proceso de fermentación discontinua se ajusta a los datos experimentales como se muestra en la figura.
Para examinar la aplicabilidad del modelo para reflejar las condiciones de fermentación por lotes de sisomicina bajo diferentes concentraciones de azúcar total, se utilizó el modelo cinético establecido para probar las concentraciones iniciales de azúcar total de 70,0, 60,0 y 50,0 g. /L respectivamente. %, 1,9% y 5,8% respectivamente. La investigación muestra que este modelo cinético puede describir y predecir mejor la fase de crecimiento de las células bacterianas en el proceso de fermentación por lotes de sisomicina con una concentración inicial de azúcar total de 50,0 a 70,0 g/l.
La fermentación de sisomicina es un tipo de síntesis de producto desacoplada y crecimiento de células bacterianas. Mantener una alta concentración de células bacterianas durante el período de síntesis del producto es beneficioso para la síntesis de productos de sisomicina. A partir del modelo cinético establecido, se puede encontrar que el crecimiento de células bacterianas durante la fermentación requiere el consumo de una gran cantidad de sustratos de azúcar, basándose en la concentración máxima de células bacterianas que puede ocurrir en el proceso de fermentación por lotes de 11,2 a 11,8 g/. L, el modelo YX es 0,43 g/g, y para el cálculo se utiliza una concentración celular inicial estadísticamente significativa, en teoría, es necesario consumir aproximadamente 15,9 ~ 17,3 g/L de azúcar fermentable antes de alcanzar la concentración celular máxima. Sin embargo, debido a factores como el mantenimiento y consumo de células bacterianas en el proceso de fermentación real, el azúcar fermentable real consumido es mayor que este valor. 1) Cuando se utiliza el medio de cultivo natural con almidón como principal fuente de carbono para la fermentación discontinua de sisomicina, se establecen respectivamente los modelos cinéticos de la etapa de crecimiento bacteriano y la etapa de síntesis del producto. En la fase de crecimiento bacteriano, el modelo matemático de la tasa de crecimiento bacteriano se puede expresar mediante la ecuación de Monod. En la fase de síntesis del producto, la tasa de crecimiento bacteriano se ajusta a la ecuación de Contois. La síntesis de sisomicina se ajusta a la ecuación de Luedeking-Piret, que puede modificarse mediante la ecuación de Levenspiel.
2) Se estimaron los parámetros del modelo para el modelo cinético de la etapa de crecimiento bacteriano y la etapa de síntesis del producto respectivamente. Los parámetros del modelo cinético μm, KS, KX ym durante el período de crecimiento bacteriano son: 0,058 h-1, 4,046 g/L, 0,433 g/g, 0,000 1 g/(g·h) respectivamente. las desviaciones de ajuste J son 0,011; los parámetros del modelo cinético μm, KX, K2, N, YX, YP y m durante el período de síntesis del producto son: 0,058 h-1, 60,556 g/g, 1,198 g/(g·h); ), 0,606, 0,090 g/g respectivamente, 0,095 g/g, 0,001 73 g/(g·h), la suma de los cuadrados de las desviaciones de ajuste J es 0,027.
3) El modelo cinético establecido puede describir y predecir mejor el proceso de fermentación por lotes de sisomicina con una concentración de azúcar total inicial de 50,0 ~ 70,0 g/L. Los valores experimentales y las simulaciones de las variables de estado del modelo. La suma de las desviaciones relativas al cuadrado de los valores es inferior al 6%. Este estudio proporciona una base para la optimización del proceso y el control de la fermentación discontinua de sisomicina. 4) El uso de maltosa en alta concentración como solución de alimentación para la fermentación por lotes alimentados puede ralentizar eficazmente la disminución de la concentración de azúcares fermentables causada por una actividad aparente insuficiente de la hidrolasa de almidón en las etapas media y tardía de la fermentación, y ayudar a mejorar significativamente la fermentación occidental. Nivel de fermentación de somicina.