Por favor, dígame cómo hacer un experimento de huellas dactilares de ADN, es urgente.

1. Extraer el ADN contenido en diversas muestras biológicas como cabello, manchas de sangre, manchas de esperma, tejido humano o huesos.

2. Seleccione la endonucleasa de restricción emparejada con la sonda para cortar el ADN de cadena larga en la posición, de modo que el ADN de cadena larga con alto peso molecular se corte en muchos fragmentos pequeños de diferentes longitudes.

3. En un aparato de electroforesis en gel con una placa de goma larga, se electroforetan los fragmentos de ADN completamente digeridos enzimáticamente. Cada fragmento digerido enzimáticamente se separará según su longitud en el campo eléctrico.

4. Primero use una solución alcalina para desnaturalizar los fragmentos de ADN bicatenario separados de la placa de gel en fragmentos de ADN monocatenario y luego intercale la placa de gel en una membrana de nailon para producir estos ADN monocatenario. .

Los segmentos se secaron, transfirieron y montaron permanentemente sobre una membrana de nailon.

5. Hibrida la sonda de ADN radiactivo con el fragmento de ADN monocatenario de la membrana de nailon.

6. Cuando la película radiactiva se superpone a la película de nailon, la sonda radiactiva de la película de nailon emitirá rayos X para exponer la película, desarrollando así fragmentos de ADN de diferentes longitudes hibridados con la sonda de la película. Este patrón de bandas de fragmentos de ADN característicos se denomina huella digital de ADN.

Adjunto se encuentran algunos conocimientos científicos populares sobre el ADN:

1 El establecimiento y desarrollo de las huellas dactilares del ADN

Las investigaciones del siglo pasado creen que cualquier análisis genético se basa En el análisis genético basado en marcadores, el valor de cualquier marcador genético radica en su variabilidad (es decir, polimorfismo). El estudio de los polimorfismos genéticos juega un papel muy importante para impulsar el desarrollo de la antropología, la genética, la inmunología y la medicina forense, además de dilucidar la patogénesis de determinadas enfermedades e incluso ayudar en el diagnóstico. Sin embargo, estudios anteriores utilizaron principalmente varios fenotipos externos, defectos fisiológicos, isoenzimas y proteínas polimórficas como marcadores genéticos, y utilizaron métodos de análisis indirectos para inferir los genes genéticos correspondientes.

A finales de la década de 1970, con la aparición de las enzimas de restricción y la tecnología del ADN recombinante y el rápido desarrollo de la biología molecular, la investigación sobre marcadores genéticos se centró en la propia molécula de ADN. Dado que todo tipo de información genética está contenida en las moléculas de ADN, las diferencias entre individuos biológicos son esencialmente diferencias en las moléculas de ADN, por lo que el ADN se considera el marcador genético más confiable. Las diferencias en ciertas secuencias de ADN pueden reflejarse en cambios en la longitud de los fragmentos de restricción, llamados polimorfismos de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), que son causados ​​por mutaciones puntuales, reordenamientos, inserciones o eliminaciones del ADN [1]. Con el estudio en profundidad del RFLP, se ha descubierto la secuencia más variable del genoma: la secuencia de ADN altamente variable, que ha dado un gran paso adelante en el desarrollo y aplicación de marcadores genéticos de ADN.

En 1980, Wyman y White describieron los primeros marcadores multialélicos de ADN humano con alto polimorfismo. Pronto, se descubrió la misma firma hipervariable en la región 5' del gen de la insulina y en la región 3' del oncogén C-Haras I. Se encontraron tres marcadores adicionales alrededor del grupo de genes de la α-globina [2]. En 1982, Bell et al. [3] demostraron que estas regiones altamente polimórficas están concatenadas con unidades de secuencia corta repetidas, y que las diferencias en el número de unidades repetidas contribuyen a esta alta variabilidad. Debido a estas características estructurales, estas regiones se denominan minisatélites o regiones hipervariables o números variables de repeticiones en tándem.

En 1985, Jeffreys et al. [4] utilizaron la secuencia repetida en tándem (unidad repetitiva de 33 pb) en el primer intrón del gen de la mioglobina como sonda para detectar 8 genes de la biblioteca de genes humanos. Un clon recombinante que contiene repeticiones en tándem (microsatélites). El análisis de secuencia muestra que la longitud y secuencia de estas ocho unidades repetidas de microsatélites no son exactamente iguales, pero todas tienen la misma secuencia central, a saber, GGCCAGGA/GGG. Utilizaron dos sondas policoreminisato-llite) 33.6 y 33.15 para la hibridación Southern y obtuvieron un patrón de hibridación que contiene más de 10 bandas en condiciones de baja rigurosidad. Las posiciones de las bandas en los patrones de hibridación de diferentes individuos son tan diferentes como las huellas dactilares humanas, que Jeffrey llama huellas dactilares de ADN [5], también conocidas como huellas dactilares genéticas.

La tecnología de toma de huellas dactilares de ADN RFLP no puede promoverse ampliamente debido a su método complejo, ciclo largo y condiciones experimentales exigentes.

En 1990, Williams et al. [6] informaron por primera vez sobre la tecnología AP-PCR, y Welsh y McCell y [7] también llevaron a cabo este trabajo de forma independiente, lo que hizo que la tecnología de huellas dactilares de ADN se utilizara más ampliamente. La tecnología AP-PCR utiliza 1 o 2 cebadores diseñados aleatoriamente para amplificar el ADN molde. Generalmente, primero se realizan de 1 a 6 ciclos de PCR en condiciones de baja rigurosidad, es decir, con una concentración alta de Mg2+ (superior a la concentración de 1,5 mmol/L de Mg2+ de la PCR tradicional) y una temperatura de hibridación baja (de 36 °C a 50 °C). DO). El principio básico es: en condiciones de renaturalización de baja rigurosidad, la secuencia complementaria imperfecta del cebador y el ADN molde forma una falta de coincidencia, y el cebador mal emparejado se extiende a lo largo de la cadena plantilla bajo la acción de la ADN polimerasa para sintetizar una nueva cadena. Cuando la otra cadena sencilla del ADN molde también tiene un cebador que no coincide dentro de una cierta distancia, se puede amplificar el ADN entre los dos cebadores que no coinciden. Sin embargo, este desajuste no se produce al azar. Debe existir una determinada secuencia complementaria entre el cebador y el molde, especialmente en el extremo 3’ del cebador, que puede producir diferentes fragmentos de amplificación o combinaciones. Mediante la tecnología de huellas dactilares de ADN, se pueden obtener fragmentos diferenciales en muestras de ADN pareadas para clonación, secuenciación, mapeo cromosómico e investigación de la función biológica de fragmentos de genes.

Yang Jianchang de mi país y otros [8] establecieron con éxito una nueva tecnología de huellas dactilares de ADN utilizando el principio de PCR, llamada tecnología de huellas dactilares de ADN humano con cebador aleatorio (APHDP). Además, han desarrollado software de aplicación para procesar datos de huellas dactilares de ADN y aplicarlos a la identificación personal, la calidad genética y las características relacionadas con enfermedades.

Dos tipos de sondas utilizadas en la tecnología de huellas dactilares de ADN

Desde el establecimiento de la tecnología de huellas dactilares de ADN, esta tecnología se ha utilizado ampliamente en las relaciones evolutivas de animales y plantas, análisis de relaciones genéticas y medicina forense. Precisamente porque la tecnología de huellas dactilares de ADN ha demostrado una gran vitalidad en el análisis de ácidos nucleicos, muchos estudiosos han trabajado mucho en torno a las sondas utilizadas en esta tecnología. Además de las sondas utilizadas por Jeffrey et al. [5], se han producido muchas sondas de alto nivel mediante síntesis química artificial o extracción de tejidos biológicos y luego amplificación. Hasta ahora, las sondas utilizadas en la tecnología de huellas dactilares de ADN incluyen la sonda 33.15, 33.6 [5], el fago MB [9], el clon repetido porcino p83, PGB 725, Poly (GT) que contiene 18.1, (GTG) 5/. Al mismo tiempo, se han logrado grandes avances en el etiquetado de sondas. Según sus estructuras, se pueden dividir a grandes rasgos en sondas de microsatélites y sondas de repetición de secuencia simple. Las repeticiones de secuencia simple incluyen sondas de microsatélite y sondas de oligonucleótidos. La secuencia central de las sondas de microsatélites es de 33 pb, que a menudo se ubica en la región frontal antes que los autosomas humanos. Las sondas de microsatélites tienen entre 10 y 20 pb, mientras que las sondas de oligonucleótidos tienen menos de 10 y 20 pb y están ampliamente distribuidas por todo el cuerpo. En cromosomas humanos, o dentro de regiones intergénicas o intrones.

En 1988, Wu Xinyao et al. [12] de China se basaron en el principio de que las huellas dactilares del ADN son secuencias repetitivas en el genoma humano y en la homología del gen de la proteína básica de mielina (MBP) humana y de ratón. ADNc Basado en el hecho de que la precisión es superior al 90%, una sección del extremo 3' del CDN MBP de ratón (una secuencia altamente repetitiva en la región no expresada, que es casi completamente homóloga a este tipo de secuencia repetitiva en el genoma humano). Se usó un fragmento de 0,81 kb de longitud como sonda para detectar fragmentos de restricción de ADN humano digeridos con Hae. Hay un total de 22 bandas en la población y no hay dos bandas entre 30 individuos no relacionados que sean exactamente iguales, lo que indica que este método tiene una alta especificidad individual. Esta es la primera vez que mi país ha encontrado una sonda de huellas dactilares de ADN por sus propios medios.

3 Aplicación de la tecnología de huellas dactilares de ADN 3.1 En comparación con los métodos anteriores de identificación del tipo de sangre, la tecnología de huellas dactilares de ADN tiene ventajas incomparables en el campo de la medicina forense. Se ha convertido en una herramienta para la identificación criminal, pruebas de paternidad y determinación de relaciones genéticas entre individuos [513]. Posteriormente, los académicos nacionales Li Boling[14], Jiang Xianhua[15], Wu Xinyao y otros[12] también estudiaron sucesivamente esta tecnología y la aplicaron a la identificación de casos reales, resolviendo casos difíciles que no pudieron resolverse en el pasado. como trazas de manchas de sangre, identificación personal de algunos fragmentos corruptos, etc.

3.2 Aplicación en ciencias animales y vegetales

3.2.1 La investigación sobre demografía biológica puede estimar el desequilibrio de ligamiento, comparar frecuencias alélicas y estimar la recombinación entre diferentes individuos. La tasa ayuda a establecer la posición y relación de un individuo en la población en estudios demográficos, especialmente en estudios de población de hongos. Muchos hongos pueden reproducirse tanto sexual como asexualmente, pero no está claro cuándo, cómo y en qué medida se reproducen. Utilizando la tecnología de huellas dactilares de ADN, se puede distinguir la descendencia sexual y asexual y se puede determinar la distribución natural de los hongos en un área determinada [1, 16].

3.2.2 Determinación de la distancia genética entre especies, clasificación e identificación de especies Jeffreys et al. [5] creen que las repeticiones en tándem con un alto número de copias (VNTR) entre diferentes miembros de una población son particularmente adecuadas como secuencias multiplexadas. En el análisis genético, la inestabilidad de secuencias repetidas simples puede provocar cambios rápidos en la longitud de VNTR. La distancia genética se puede determinar en función de la frecuencia con la que los VNTR se segregan y recombinan dentro de una familia o población reproductora. La relación genética entre individuos se puede determinar mediante la fórmula estadística: D = 2Nab / (Na + Nb) Cuanto mayor es el valor d, más cercana es la relación genética y cuanto menor es la distancia genética, menor es el valor D, más lejana; Cuanto mayor sea la relación genética, mayor será la distancia genética. Por lo tanto, la tecnología de huellas dactilares de ADN se puede utilizar para detectar la relación genética entre diferentes especies, la misma especie y diferentes individuos de la misma especie. También se puede utilizar para determinar los padres de la descendencia híbrida, separar grupos de descendencia híbrida y detectar múltiples. líneas casi isogénicas (o líneas similares). Morfología, localización de genes detectados. Welsh et al. [7] analizaron las huellas dactilares del ADN de cepas de Borrelia burgdorferi y descubrieron que el agente causante de la enfermedad de Lyme en realidad está compuesto por tres poblaciones diferentes. Luo Chaoquan et al. [12] utilizaron AP-PCR para identificar cepas de Toxoplasma gondii, siendo pioneros en el uso de tecnología de huellas dactilares de ADN para la clasificación biológica en mi país.

3.3 Aplicación en epidemiología Debido a que la huella dactilar del ADN tiene las siguientes características: ① puede reflejar la variabilidad del genoma; ② tiene una alta variabilidad; ③ es una herencia simple y estable; Por tanto, en comparación con los métodos epidemiológicos generales, tiene ventajas incomparables y es una herramienta eficaz para las investigaciones epidemiológicas. Jan DA et al. [17], Denise Chevrel-Dellagi et al. [18] utilizaron la secuencia IS6110 como sonda para analizar la huella genética de cepas de Mycobacterium tuberculosis, investigar los tipos de tuberculosis en el mundo, analizar la situación epidémica, y mejorar los métodos para controlar la tuberculosis. Yang Zhenhua et al. [19] aislaron cepas de Mycobacterium tuberculosis de 67 pacientes para realizar análisis de huellas dactilares de ADN y descubrieron que cuando se aisló PTBN12, fue fácil identificar vínculos epidémicos, lo que proporcionó pruebas sólidas para el control rápido de la enfermedad. En China, Tong Xiaomei et al. [20] utilizaron tecnología de huellas dactilares de ADN polimórfico amplificado aleatorio para realizar análisis epidemiológicos de patógenos en 14 recién nacidos con infecciones hospitalarias y descubrieron que las huellas dactilares de ADN de cepas de Staphylococcus warneriensis portadas en niños eran consistentes con las narices del personal médico. Los patógenos portados por todos los pacientes eran exactamente los mismos, lo que demuestra que el patógeno de esta infección fue Staphylococcus Warneris y la fuente de infección fue el personal médico que portaba el patógeno. Guo Yongjian et al. [21] realizaron análisis de huellas dactilares RAPD y tipificación serológica en 31 cepas de Pseudomonas aeruginosa detectadas en 30 casos de 121 recién nacidos obstétricos en 6 meses. Los resultados mostraron que hubo un brote de Pseudomonas aeruginosa entre los recién nacidos obstétricos, y el tipo 0:6/R:1 fue la cepa epidémica fulminante.

3.4 Diagnóstico y tratamiento de enfermedades En vista de las características anteriores de las huellas dactilares de ADN, las huellas dactilares de ADN se utilizan ampliamente en el diagnóstico y tratamiento de determinadas enfermedades. Morral [22] et al. encontraron que hay una pequeña región satélite que flanquea el exón 9 del gen de la FQ, y el alelo 2.6 a menudo está relacionado con △F508, con tasas de asociación del 50,6% y el 41,6%. △F508 es la mutación patogénica más importante. Si solo se encuentra el alelo 2.6 en el patrón de electroforesis de un paciente sospechoso, la enfermedad puede diagnosticarse de manera preliminar. Se han encontrado regiones altas de microsatélites en o junto a genes como la enfermedad de Wilson, la neurofibromatosis periférica, la enfermedad renal multifascicular del adulto, la distonía dopaminérgica, la ataxia de Frecbrech**, el síndrome de Kallmunm, la retinopatía, etc., permitiendo así obtener un diagnóstico genético. Okamoto R [23] utilizó tecnología de huellas dactilares de ADN para predecir la recurrencia de la leucemia mielógena crónica después del trasplante de médula ósea y logró el éxito.

3.5 Investigación sobre tumores El tumor es un proceso de cambio multifactorial y multietapa. Las razones son complejas y variadas, pero en última instancia se trata de cambios en el ADN.

En términos generales, las huellas dactilares del ADN de los tejidos cancerosos y las metástasis son diferentes de las de los tejidos normales o de las células de la sangre periférica. Por lo general, faltan una o varias bandas, la densidad de una o varias bandas se reduce o aparecen nuevas bandas en los tejidos cancerosos. Thein et al. [24] utilizaron 33.6 y 33.15 como sondas para estudiar los cambios en las huellas dactilares del ADN de pacientes con tumores gastrointestinales y descubrieron que las huellas dactilares del ADN de los tejidos cancerosos en pacientes con tumores gastrointestinales habían cambiado y creían que las mutaciones somáticas tienen atributos de especie. Especificidad. Liu Shuang et al. [25] utilizaron la tecnología de análisis RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatorio, ADN polimórfico amplificado aleatorio) para analizar tejidos cancerosos y no cancerosos de 6 pacientes con cáncer de hígado y descubrieron que las huellas dactilares RAPD del ADN genómico en todos los cánceres de hígado. Los tejidos tenían diferencias, entre los cuales tres genomas de cáncer de hígado coincidentes tienen el mismo fragmento amplificado aleatoriamente de 0,9 Kb. Yang Jianchang et al [8] utilizaron la tecnología APHDFF para detectar huellas dactilares de ADN en sangre de 28 pacientes con cáncer de nasofaringe y descubrieron que la frecuencia de la misma. tres fragmentos de ADN fue significativamente menor en personas sanas. Wang Dai et al. [26] utilizaron sondas LE11.8 y Mb para detectar reordenamientos genéticos en células de sangre periférica o de médula ósea de 12 niños con leucemia mieloide aguda mediante hibridación Southern. Los resultados mostraron que las huellas dactilares del ADN de inicio inicial o recaída aumentaban o disminuían en comparación con las de aquellos en remisión completa, por lo que se creía que había reordenamientos genéticos en las células leucémicas en niños con leucemia mieloide aguda.

Referencia:

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Encuestado: xy_vanilla-Juren Nivel 4 8-11 13:31.

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Otras respuestas*** 3

La tecnología de huellas dactilares de ADN es una nueva tecnología en tecnología de la biología. Es un medio importante para distinguir diferencias entre diferentes tipos de organismos y entre la misma especie a nivel molecular. Tiene aplicaciones muy importantes en identificación forense, investigación sobre el origen y la evolución de especies, establecimiento de bases de datos de huellas dactilares de ADN de animales, plantas y microbios, investigación sobre cría de animales, investigación sobre el cáncer, diagnóstico de enfermedades, pruebas de paternidad, etc. Se explican brevemente el progreso de la investigación y las aplicaciones de la tecnología de huellas dactilares de ADN.

Encuestado: Shui Xin·Yu Jun - Mago en prácticas Nivel 2 8-11 13:33

Huella digital de ADN: se refiere a un polimorfismo de ADN completamente específico de cada individuo. Sus capacidades de reconocimiento individual son. suficiente para igualar una mano.

Huellas dactilares, de ahí el nombre. Se puede utilizar para identificación personal y pruebas de paternidad.

Identificación de huellas dactilares de ADN

________________________________________

En 1984, Jefferys, genetista de la Universidad de Leicester en el Reino Unido, y sus colaboradores aislaron microsatélites humanos para Por primera vez, como sonda genética, el ADN se hibrida con fragmentos digeridos de ADN nuclear de células humanas y se obtienen patrones de bandas de hibridación de diferentes longitudes compuestos de alelos de múltiples loci. Este patrón rara vez es exactamente el mismo entre dos personas, por lo que se llama "huella digital de ADN", lo que significa que es única para cada persona como una huella digital humana. Una imagen de una huella digital de ADN aparece como una serie de franjas en una película de rayos X, muy parecida a un código de barras en un producto. La tecnología de huellas dactilares de ADN ha creado una variedad de métodos para detectar polimorfismos de ADN (diferencias en la estructura del ADN entre diferentes individuos o diferentes poblaciones), como el análisis RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción), análisis de secuencia repetida en tándem, análisis RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatoriamente). , etc. Varios métodos de análisis se basan en polimorfismos del ADN y producen huellas dactilares de ADN con una alta especificidad individual.

Debido a que las huellas dactilares del ADN son muy variables, genéticamente estables y aún se heredan de manera mendeliana simple, se han convertido en los marcadores genéticos más atractivos en la actualidad.

La huella dactilar del ADN tiene las siguientes características: 1. Alta especificidad: las investigaciones muestran que la probabilidad de que dos individuos aleatorios tengan el mismo patrón de ADN es solo de 3×10-11, si se utilizan dos sondas para comparar al mismo tiempo, la probabilidad de que dos individuos sean iguales es inferior a 5×; 10-19. La población mundial es de unos 5 mil millones, o 5×109. Por lo tanto, a menos que sean gemelos idénticos, es casi imposible que dos personas tengan la misma huella genética. 2. Herencia estable: el ADN es material genético humano y sus características se heredan de los padres. Se descubrió que casi todas las bandas de la huella dactilar del ADN se pueden encontrar en el mapa de uno de los padres, lo que concuerda con la clásica ley de herencia mendeliana, es decir, un promedio del 50% de las características de ambos padres se heredan a la descendencia. 3. Estabilidad de las células somáticas: es decir, las huellas dactilares del ADN producidas por diferentes tejidos como sangre, músculo, cabello, semen, etc. de una misma persona son completamente consistentes.

En 1985, el Dr. Jefferys aplicó por primera vez la tecnología de huellas dactilares de ADN a la identificación forense. En 1989, esta tecnología fue aprobada por el Congreso de los Estados Unidos como medio formal de evidencia forense. La policía china ha utilizado tecnología de huellas dactilares de ADN para resolver miles de casos difíciles. La tecnología de huellas dactilares de ADN tiene muchas ventajas que los métodos de pruebas forenses tradicionales no tienen. Por ejemplo, todavía puede extraer ADN de manchas de semen y muestras de sangre de hace cuatro años para su análisis. Si se utiliza ADN mitocondrial para el examen, el tiempo se ampliará. Además, también se utilizó tecnología de huellas dactilares de ADN para identificar los cadáveres descubiertos de mil años de antigüedad, los restos del zar Nicolás, que fue ejecutado durante la Revolución Rusa, y los restos del fallecido Secretario de Comercio de Estados Unidos, Brown, y su séquito, que fueron asesinados en un accidente en la antigua Yugoslavia no hace mucho.

Además, se utiliza en medicina humana para identificar individuos, determinar parentesco, diagnóstico médico y encontrar marcadores genéticos relacionados con enfermedades; se puede utilizar en el origen y evolución de poblaciones animales en la evolución animal; Clasificación de especies, se puede utilizar para distinguir diferentes especies y también tiene el potencial de distinguir diferentes cepas de la misma especie. También se utiliza ampliamente en el mapeo y mejoramiento de genes de cultivos.

El funcionamiento básico del método de toma de huellas dactilares de ADN: extraer ADN de muestras biológicas (el ADN generalmente está parcialmente degradado), sitios altamente variables (como el sistema VNTR, ADN de microsatélites repetidos en tándem, etc.) o utilizar tecnología de PCR Amplificar el ADN genómico completo, luego digerir enzimáticamente el ADN amplificado en fragmentos de ADN, separarlos por peso molecular mediante electroforesis en gel de agarosa, transferirlos a un filtro de nailon y luego etiquetar la sonda de ADN microsatélite con propiedades complementarias en la membrana. Hibridación de fragmentos de ADN de secuencias de bases.

La electroforesis en gel de agarosa es un método común para separar, identificar y purificar fragmentos de ADN. La posición del ADN en el gel se puede determinar tiñéndolo con una baja concentración del tinte fluorescente bromuro de etidio. Si se desea, también se pueden recuperar bandas de ADN del gel para utilizarlas en diversas operaciones de clonación. Los geles de agarosa tienen una resolución menor que los geles de poliacrilamida, pero su rango de separación es más amplio. El ADN de 200 pb a casi 50 kpb de longitud se puede separar mediante geles de agarosa de diversas concentraciones. El ADN con una longitud de más de 100 kb se puede separar mediante electroforesis en gel con campo eléctrico pulsado, en la que la dirección del campo eléctrico cambia periódicamente.

En operaciones rutinarias de ingeniería genética, la electroforesis en gel de agarosa es la más utilizada. Por lo general, utiliza un dispositivo de electroforesis horizontal para realizar la electroforesis bajo un campo eléctrico de intensidad y dirección constantes. Las moléculas de ADN se cargan negativamente en un tampón de gel (generalmente alcalino) y migran del electrodo negativo al electrodo positivo en un campo eléctrico. La movilidad de las moléculas de ADN se ve afectada por el tamaño y la conformación de la molécula. Efectos de la intensidad y dirección del campo eléctrico, composición de la base, temperatura y tinte incrustado.