Etiqueta de fusión de proteínas
Las etiquetas de proteínas se pueden dividir aproximadamente en tres categorías según sus funciones: etiquetas de detección, etiquetas de purificación de expresión y etiquetas rastreadoras.
Los métodos de detección de proteínas incluyen la espectrometría de masas, la detección de actividad enzimática y el inmunoensayo. Entre ellos, el inmunoensayo es el método más utilizado que incluye WB (Western Blot) y ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas). IP (inmunoprecipitación). El inmunoensayo requiere que la proteína objetivo se inyecte en el animal como un antígeno, luego el anticuerpo se separa del suero inmunológico y se realiza una detección específica basada en la reacción inmune entre el antígeno y el anticuerpo. La mayor desventaja de este método es que cada vez que se reemplaza una proteína diana, se deben preparar los anticuerpos correspondientes, lo cual es engorroso y costoso. El uso de etiquetas de fusión hace que los inmunoensayos de proteínas sean versátiles y convenientes. Cuando fusionamos una etiqueta específica con la proteína objetivo, las dos se coexpresan. Al detectar la etiqueta de fusión, podemos obtener la expresión de la proteína diana. Después de una investigación a largo plazo, se han desarrollado algunas etiquetas de detección maduras. Las siguientes son algunas introducciones:
1) Ha
La etiqueta HA es una pequeña etiqueta que contiene ***9 aminoácidos. La secuencia de la etiqueta YPYDVPDYA se deriva del antígeno de superficie de la influenza. hemaglutinina del virus. El grupo tiene poco impacto en la estructura espacial de la proteína objetivo y puede fusionarse al extremo N o al extremo C, por lo que puede adquirirse para la detección comercial de anticuerpos anti-HA. Las etiquetas HA se utilizan comúnmente en experimentos de transferencia Western, inmunofluorescencia e inmunoprecipitación y, ocasionalmente, en análisis ELISA y de microarrays.
2) Su
Su etiqueta, también una etiqueta pequeña, se refiere a seis péptidos de histidina. Esta etiqueta tiene poco impacto en la estructura espacial de la proteína objetivo y puede fusionarse al extremo N o al extremo C. Generalmente, la eliminación no es necesaria y no afectará la función de la proteína objetivo. Se pueden adquirir pruebas comerciales de anticuerpos anti-His. Sus etiquetas se utilizan con frecuencia en experimentos de transferencia Western.
3) c-Myc
La etiqueta Myc contiene un fragmento de 10 aminoácidos del protooncogén humano Myc, con la secuencia EQKLISEEDL, y puede fusionarse al N- terminal o C-terminal de la proteína diana. Debido a que se encuentran disponibles anticuerpos monoclonales anti-Myc altamente específicos, se usan ampliamente en experimentos de transferencia Western, inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, pero rara vez se usan para la purificación de proteínas. Actualmente, existen muchos anticuerpos c-Myc comerciales en el mercado.
4) Bandera, bandera 3×
La etiqueta FLAG es una etiqueta peptídica corta popular en la proteína objetivo. Su secuencia es DYKDDDDK y puede fusionarse al C-terminal o al N-. terminal de la proteína. Debido a que contiene el sitio de reconocimiento de la enteroquinasa (DDDDK), que puede eliminarse fácilmente, es más adecuado para la fusión con el extremo N de la proteína diana. Las etiquetas bandera son más hidrófilas que etiquetas similares, por lo que generalmente no desnaturalizan ni inactivan las proteínas unidas a ellas y, a menudo, se utilizan para detectar proteínas diana en sistemas de expresión eucariotas. Actualmente, se ha desarrollado una mejor etiqueta 3×Flag con 22 aminoácidos y un peso molecular de 2,7 KDa. La secuencia de etiquetas de 3×Flag no es única. Algunos documentos utilizan directamente tres símbolos en serie para repetir etiquetas, lo que no favorece la eliminación de etiquetas. Una secuencia comúnmente utilizada es DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK. La inmunogenicidad y afinidad de 3×Flag aumentan enormemente y es adecuado para la detección y purificación de proteínas expresadas de bajo nivel en eucariotas. Hay muchos anticuerpos Flag y 3×Flag disponibles comercialmente en el mercado.
5) La etiqueta S
s es un péptido corto derivado del extremo N de la ribonucleasa A pancreática (RNasa A), y su secuencia de aminoácidos es KETAAAKFERQHMDS. La etiqueta S generalmente se construye en el extremo N o C de la proteína diana, y se pueden usar anticuerpos comerciales de etiqueta S para inmunoensayos.
Además, existe una fuerte interacción entre la etiqueta S y la proteína S (también derivada de la ARNasa A), por lo que la etiqueta S se puede utilizar para la purificación de proteínas. Sin embargo, debido a las duras condiciones de elución, para obtener proteínas funcionales, se recomienda utilizar proteasa para escindir la etiqueta y luego eluir la proteína objetivo.
6) T7
La etiqueta T7 es una etiqueta de epítopo derivada de la proteína de la cápside del fago T7. La secuencia es MASMTGGQQMG. Puede fusionarse con el extremo N o C de la proteína diana. Se pueden adquirir ensayos de anticuerpos anti-T7 disponibles comercialmente. Las etiquetas T7 se utilizan comúnmente en experimentos de transferencia Western.
7) V5
La etiqueta V5 es un péptido corto de epítopo pequeño (Pk) presente en las proteínas P y V del paramixovirus del virus de los simios tipo 5 (SV5), y su secuencia es Son los 95-108 residuos de aminoácidos de la subunidad α de la ARN polimerasa y pueden fusionarse con el extremo N o C de la proteína diana. En la literatura, V5 está fusionado principalmente al extremo C de la proteína diana y se usa comúnmente en transferencia Western, inmunofluorescencia y detección de inmunoprecipitación en sistemas de expresión de células de mamíferos e insectos.
Existen muchos métodos para purificar proteínas, como el intercambio iónico, la cromatografía hidrofóbica, los tamices moleculares y la cromatografía de afinidad. Entre ellos, la cromatografía de afinidad es sin duda el mejor que utiliza la combinación de marcadores de matriz y proteínas. Unión específica entre ellos para obtener un alto rendimiento y una alta pureza de la proteína diana. A continuación se muestran algunas etiquetas de purificación de uso común.
1) His
La etiqueta His se refiere principalmente a una etiqueta de fusión compuesta por seis histidinas, concretamente His6, que puede fusionarse con el C-terminal o N-terminal de la proteína objetivo. . Su etiqueta es la "más bella" en el campo de la purificación de proteínas. En 1987, Hochuli et al. propusieron por primera vez el uso de etiquetas de histidina para purificar proteínas, y sus etiquetas siguen siendo las más utilizadas en el campo de la purificación de proteínas. Las cadenas laterales de los residuos de histidina tienen una fuerte atracción hacia los iones de níquel inmovilizados y pueden usarse en cromatografía de quelación de metales inmovilizados (IMAC). El peso molecular de la etiqueta es pequeño, sólo aproximadamente 0,84 kD, y generalmente no afecta la función de la proteína diana. Además, las etiquetas His también se pueden utilizar para análisis inmunológicos, y las proteínas fusionadas a las etiquetas His tienen baja inmunogenicidad, por lo que las proteínas purificadas se pueden inyectar directamente en animales para la inmunización y preparación de anticuerpos.
2) Impuesto sobre bienes y servicios
La etiqueta GST (glutatión azufre transferasa) es una de las etiquetas más utilizadas en la purificación de proteínas. GST es una etiqueta grande y una proteína completa con un peso molecular de aproximadamente 26 KD. Por un lado, la GST tiene una alta solubilidad y puede aumentar la solubilidad de la proteína diana; por otro lado, puede expresarse en grandes cantidades en E. coli para mejorar la expresión de la proteína diana; Por lo tanto, se usa ampliamente para la expresión de diversas proteínas de fusión y puede expresarse en células huésped como E. coli y levadura. La proteína de fusión marcada con GST se puede purificar directamente del lisado bacteriano a través de una resina de afinidad que contiene glutatión reducido Sefarosa y eluir con glutatión reducido 10 mM para obtener una proteína de fusión de alta concentración y pureza. Sin embargo, debido al gran tamaño de la etiqueta GST, generalmente es necesario quitarla, por lo que GST generalmente se fusiona con el extremo N del objetivo. En los casos en los que la proteína objetivo es una enzima activa, la etiqueta también se puede conservar si la GST no tiene ningún efecto sobre la actividad de la enzima después de la verificación de la actividad. Actualmente, existen muchos anticuerpos GST comercializados disponibles para la detección específica de proteínas diana.
3) MBP
La etiqueta MBP (proteína de unión a maltosa) es una de las etiquetas más utilizadas en la purificación de proteínas y también es una etiqueta grande. Su peso molecular supera los 40 kDa y está codificado por el gen masculino de E. coli K12. MBP puede aumentar la solubilidad de las proteínas diana en las bacterias, especialmente las proteínas eucariotas, y también puede aumentar la expresión de las proteínas de fusión. MBP se puede combinar con resina de afinidad de almidón reticulada y la proteína de fusión combinada se puede eluir con maltosa 10-20 mM en condiciones suaves para obtener alta pureza y alta concentración de la proteína objetivo. Las características y uso de MBP son muy similares a los de GST, y también existen anticuerpos comerciales especializados para su detección. Cabe señalar que las secuencias MBP se presentan en dos formas. Un tipo contiene un péptido señal en el extremo N, que es adecuado para expresar y purificar proteínas tóxicas, y generalmente está fusionado en el extremo N. Las secuencias sin un péptido señal pueden fusionarse en el extremo N o C; y generalmente están fusionados en el extremo N.
4) Etiqueta CBD del Distrito Central de Negocios, generalmente se refiere al dominio de unión a quitina de Bacillus subtilis, con un peso molecular de aproximadamente 5 kDa. La etiqueta fue introducida por NEB Company y utilizada junto con su sistema Impact (diseñado para purificar con etiquetas de unión a quitina por afinidad) para la expresión y purificación de proteínas diana (tóxicas). En el sistema IMPACT, el CBD y una proteína inteína de levadura forman una etiqueta de fusión de doble efecto. Los intrones son elementos de empalme de proteínas, similares a los intrones del genoma. Las inteínas se someten a una escisión N-terminal automediada a baja temperatura y en condiciones reductoras, que pueden liberar la proteína diana ligada. Es decir, después de colgar el producto de expresión de fusión en la columna de cromatografía de afinidad, solo es necesario eluir con una solución que contenga DTT, mercaptoetanol o cisteína a baja temperatura (4 ° C) para eluir la proteína objetivo. La etiqueta de fusión permanece en la columna de purificación, lo que hace que sea muy sencillo eliminar el agente reductor de molécula pequeña. Más tarde, NEB lanzó el sistema IMPACT-CN (es decir, la etiqueta de fusión se puede seleccionar en el terminal C o N de la proteína objetivo) y el sistema IMPACT-TWIN, más flexible y conveniente. Aquellos que estén interesados pueden descubrirlo por sí mismos.
(He utilizado este sistema, pero el efecto no es tan bueno como se anuncia. Hay dos razones: 1) Debido a que el DTT se utiliza como cuerpo cortante, no es adecuado para la purificación de proteínas que contienen enlaces disulfuro internos. 2) Los genes de fusión tienen un alto riesgo de autoescisión in vitro e in vivo, lo que dificulta la obtención de la proteína objetivo al purificar proteínas altamente tóxicas. )
5) Streptococcus tag
Strep tag, generalmente llamado Strep-tag II, es un péptido corto con una longitud de 8 aminoácidos, la secuencia es WSHPQFEK y puede fusionarse al extremo N o al extremo C de la proteína diana. La proteína de fusión Strep tag se une específicamente a la matriz de la columna de estreptoavidina, y se puede usar D-biotina o sus derivados como eluyente para lograr una purificación específica de la proteína de fusión. Debido a que las columnas de anticuerpos son muy caras, el marcaje con estreptavidina no se utiliza habitualmente en la purificación de proteínas.
6) Halo tag
Halo tag es un derivado genéticamente modificado de la deshalogenasa bacteriana, que puede unirse eficazmente a varios ligandos sintéticos Halo-Tag con un peso molecular de 33 KDa. fusionado al extremo N o C de proteínas recombinantes y expresado en sistemas procarióticos y eucariotas.
7) SNAP tag
SNAP-tag es un mutante de la O6-metilguanina-ADN metiltransferasa humana, con una longitud de 182 aminoácidos y un peso molecular de aproximadamente 19 kDa, puede fusionarse con cualquier proteína diana y además puede marcarse específicamente con ligandos apropiados (como tintes fluorescentes). Cuando la proteína de fusión SNAP-Tag purificada o no purificada se mezcla con un sustrato con benzoguanina fijada en la superficie, la proteína puede interactuar específicamente con el sustrato para formar un enlace de valencia, y la proteína de fusión se fija indirectamente en la superficie del sustrato y puede ser más Conveniente y rápidamente lograr el propósito de estudiar la función de las proteínas o purificar las proteínas. SNAP-Tag es una nueva generación de tecnología de etiquetado de proteínas que no solo es altamente específica sino también estable. Su mayor ventaja es que es adecuado para la detección y purificación de proteínas en diversos entornos, como células vivas, soluciones o fases sólidas (como SDS-PAGELS).
8)SUMO
La etiqueta SUMO es un pequeño modificador similar a la ubiquitina que tiene solo 18 homologías con la ubiquitina en su estructura primaria, pero sus tres estructuras jerárquicas y funciones biológicas son muy similares. . Se descubrió que SUMO puede usarse como etiqueta de fusión, que no solo mejora la expresión de la proteína de fusión, sino que también resiste la proteólisis, promueve el plegamiento correcto de la proteína diana y mejora la solubilidad de la proteína recombinante. Además, el uso de enzimas proteolíticas SUMO puede reconocer la etiqueta SUMO intacta y escindir eficientemente SUMO de la proteína de fusión. Esta etiqueta se utiliza principalmente para mejorar la expresión de la proteína diana y no es una etiqueta de purificación común. Para uso en purificación, se puede utilizar doble etiquetado.
9) NusA, TrxA, DsbA
La etiqueta NusA es un factor de terminación de la transcripción inversa que puede aumentar la solubilidad y expresión de proteínas de fusión. La etiqueta TrxA es tiorredoxina, que está presente en casi todos los organismos.
No sólo puede aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión, sino también promover la purificación de extractos periplásmicos bacterianos y ayudar a genes extraños a formar enlaces disulfuro. La etiqueta DsbA es una isomerasa de enlace disulfuro de proteína, que puede aumentar la solubilidad de la proteína objetivo y ayudar a formar enlaces disulfuro.
Estas tres etiquetas se utilizan principalmente para mejorar la expresión de la proteína diana y no se utilizan para la purificación en sí. Las proteínas sólo pueden purificarse cuando están unidas a otra etiqueta de afinidad. Además, todas estas tres etiquetas tienen la función de localización pericitoplasmática, por lo que generalmente están fusionadas al extremo N de la proteína diana. Estas tres son etiquetas grandes que pueden afectar las propiedades de la proteína de fusión y, por lo general, deben eliminarse después de la purificación.
El marcado de seguimiento se refiere principalmente al uso de la fluorescencia de la propia etiqueta o la fluorescencia o luz visible emitida por el sustrato catalítico para detectar la localización, transferencia e interacción de la proteína objetivo en el organismo. Las etiquetas trazadoras generalmente tienen pesos moleculares más grandes, por lo que es necesario agregar una secuencia conectora entre la etiqueta y la proteína objetivo para evitar interacciones entre las dos proteínas. Las etiquetas trazadoras se pueden utilizar en combinación con etiquetas de detección para la detección y análisis de proteínas diana o con etiquetas de purificación para una purificación posterior.
1) GFP, EGFP, YFP
La etiqueta GFP (proteína fluorescente verde) contiene 238 aminoácidos y su peso molecular es de aproximadamente 26,9 KDa. La proteína que se encuentra en Aequorea victoria puede emitir fluorescencia verde bajo irradiación UV, y la fusión con la proteína objetivo no afectará significativamente el ensamblaje y la función de la proteína nativa. La etiqueta EGFP es una proteína fluorescente verde mejorada. En comparación con GFP, la etiqueta EGFP tiene una mayor eficiencia de plegado (mayor fluorescencia debido a una mayor proporción de proteína plegada correctamente), una intensidad de fluorescencia más fuerte y propiedades de fluorescencia más estables. Las etiquetas YFP (Proteína Fluorescente Amarilla, YFP) pueden verse como mutantes de proteína fluorescente verde con fluorescencia desplazada hacia el espectro rojo. Una vez que estas etiquetas se fusionan con la proteína objetivo, la proteína de fusión se puede observar en el cuerpo mediante microscopía de enfoque láser. A menudo se utiliza en experimentos como la localización subcelular, el análisis de localización de fluorescencia y las imágenes de fluorescencia in vivo. Se puede agregar una etiqueta de seguimiento al extremo N o al extremo C de la proteína objetivo, según la situación específica, como el seguimiento de la localización celular. Si la secuencia de posicionamiento está ubicada en el extremo N de la proteína diana, la etiqueta debe agregarse en el extremo C; si la secuencia de posicionamiento está ubicada en el extremo C, la etiqueta debe agregarse en el extremo N; si la secuencia de posicionamiento está ubicada en el medio, se puede agregar en el extremo N o en el extremo C.
2) Luciferasa
La luciferasa (Luc) se utiliza a menudo como "proteína informadora" en la investigación de biología molecular. Existen luciferasa de luciérnaga, luciferasa de Renilla y luciferasa de Guarinella, que pueden catalizar la fluorescencia de los sustratos de luciferina. Como marcador, Luc se utiliza a menudo en imágenes in vivo, análisis de fármacos y otros campos. Los plásmidos que llevan etiquetas de luciferasa (Luc) se transfectan en células, se introducen en animales de investigación como ratas y ratones, y luego se inyecta el sustrato de luciferina. Las imágenes de bioluminiscencia (BLI) se utilizan para detectar cambios en la intensidad de la luz para monitorear el desarrollo de enfermedades o el efecto terapéutico de los medicamentos en tiempo real. El efecto del ATP en este sistema de reacción también se puede utilizar para indicar energía o signos vitales basados en cambios en la intensidad de la bioluminiscencia.
3) Gus tag
Gus tag es una β-glucuronidasa bacteriana que puede catalizar la hidrólisis de muchos β-glucurónidos. Esta enzima puede hidrolizar X-Gluc para producir una sustancia azul. El producto inicial es un derivado indol incoloro, que forma el tinte 5,5'-dibromo-4,4'-dicloroíndigo después de la oxidación y la dimerización. Este tinte índigo confiere a las partes o sitios con actividad GUS un color azul, que se puede observar a simple vista o al microscopio. Dado que no existe actividad gus endógena en la mayoría de las células vegetales, los genes GUS se utilizan ampliamente como genes indicadores en plantas transgénicas. Cuando se utiliza como etiqueta de fusión, la etiqueta gus se puede colocar en el extremo N o C de la proteína diana. La proteína de fusión resultante generalmente todavía tiene actividad GUS, lo que proporciona condiciones convenientes para estudiar sitios celulares específicos donde se encuentran genes extraños. expresado.
Por supuesto que no. Casi cualquier etiqueta se puede utilizar como etiqueta de detección. Sin embargo, estos marcadores se utilizan ampliamente, tienen una alta sensibilidad de detección y los anticuerpos y reactivos correspondientes son relativamente maduros. Son las etiquetas de detección más utilizadas y pueden usarse como primera opción al agregar etiquetas de detección.
Por supuesto, no existen límites funcionales absolutos entre las etiquetas de detección, las etiquetas de purificación y las etiquetas de seguimiento. Todas las etiquetas de detección también se pueden utilizar para la purificación, pero los anticuerpos correspondientes deben prepararse e inmovilizarse en la matriz de purificación. Por ejemplo, la etiqueta S requiere que la proteína S se fije en una resina de purificación y es necesario comprar materiales especiales para la columna de purificación, lo cual es muy costoso. Por supuesto, también se pueden usar métodos comunes, como usar proteína A para adsorber anticuerpos y luego usar anticuerpos para adsorber la proteína objetivo para la fusión, pero la eficiencia de la purificación puede no ser demasiado alta, la capacidad de adsorción es limitada y el costo. es alto (el precio del material de la columna de proteína A es Ni-NTA de 5 a 10 veces el material de la columna). Aunque este método puede alcanzar una pureza extremadamente alta, no se utiliza mucho.
La etiqueta está seleccionada. ¿Debería agregarse al extremo N o al extremo C? En muchos informes, las etiquetas generalmente se agregan al extremo C de la proteína objetivo, porque el plegamiento de la proteína comienza desde el extremo N, y al agregar etiquetas al extremo N se corre el riesgo de que la proteína objetivo las incruste. Sin embargo, actualmente no existe un estándar unificado y es mejor consultar la literatura relevante para un análisis específico.
Generalmente, las etiquetas de detección son etiquetas pequeñas que tienen poco impacto en la función y estructura de la proteína objetivo. Se pueden utilizar tanto el extremo N como el extremo C. Cabe destacar que en el caso de etiquetas duales, si son dos etiquetas pequeñas, una a cada lado. Generalmente no se recomienda conectar dos etiquetas diferentes en serie, como una etiqueta de detección de 3 × Bandera y una etiqueta de purificación de His. Luego, la Bandera 3 × debe colocarse en el extremo N y la His en el extremo C, porque es muy. Es probable que sea necesario quitar la bandera 3× después de la purificación, lo que no se puede lograr si se intercambian las dos etiquetas.
Su etiqueta es la más utilizada. Puede usarse tanto para purificación como para detección. En la mayoría de los casos, no es necesario eliminarla. Agregarlo al extremo N puede terminar la traducción prematuramente y los subproductos producidos no son propicios para el aislamiento y la purificación. Cuando se agrega el extremo C, existe la posibilidad de que se inicie la traducción secundaria y los subproductos producidos no son propicios para el aislamiento y la purificación. El His de extremos emparejados es beneficioso para la detección y purificación precisas de la proteína objetivo, pero puede afectar la actividad de la enzima.
La etiqueta de purificación tiene un peso molecular grande y debe eliminarse en la mayoría de los casos, por lo que generalmente se coloca en el extremo N de la proteína objetivo y la etiqueta de detección se coloca en el extremo C. Si es necesario colocar una etiqueta de purificación grande en el extremo C, la etiqueta de detección se puede colocar en el extremo N de la proteína diana o en el extremo C de la proteína de fusión. Sin embargo, la etiqueta de detección no se puede colocar entre la proteína objetivo y la etiqueta de purificación.
En el caso de las etiquetas GFP, la mayoría se utilizan para la localización celular de proteínas diana. La posición de esta etiqueta está determinada por la secuencia de posición. La secuencia de posicionamiento está en el extremo C, GFP debe colocarse en el extremo N y la etiqueta de detección debe colocarse en el extremo N de GFP. En cambio, GFP debe colocarse en el extremo C y la etiqueta de detección debe colocarse en el extremo C de GFP.
Cuando la etiqueta de fusión no tiene ningún efecto sobre la función y estructura de la proteína objetivo, no hay necesidad de eliminar la etiqueta de fusión, no solo para etiquetas pequeñas, sino también para etiquetas grandes como GST y MBP. . Algunas enzimas herramienta de ácido nucleico purificadas por NEB están fusionadas con etiquetas MBP. Expresé MBP-APOBEC3A en una fusión y MBP no afectó la actividad C→T de APOBEC3A. Los sistemas de edición de puntos AE y CE en la tecnología de edición de genes se basan en la proteína Cas y APOBEC. Sus tamaños moleculares varían mucho, pero sus funciones no se afectan entre sí porque sus dominios funcionales son relativamente estables y no tienen interacciones con proteínas. Si la etiqueta de fusión y la proteína diana también satisfacen esta relación, básicamente no hay necesidad de eliminar la etiqueta. Sin embargo, este efecto es impredecible y puede determinarse consultando la literatura relevante o realizando experimentos preliminares.
Las proteasas comúnmente utilizadas para eliminar etiquetas de proteínas y sus secuencias de reconocimiento se muestran en la siguiente tabla.
[1]Etiquetas de proteínas [Wikipedia], sistemas comerciales. Microbiología Aplicada. Biotecnología. , 2002, 60: 523–33.
[5] Nilsson, j. et al (1997) Estrategia de fusión por afinidad para la detección, purificación e inmovilización de proteínas recombinantes. Expresión de proteínas. Priv. , 1997, 11: 1–16.
[6] Malhotra A. Marcado de la expresión de proteínas[M]//Métodos en enzimología. Prensa académica, 2009, 463: 239-258.