¿Cómo preparar hidrolizado de proteína de seda? Cuantos más detalles mejor, ¡muchas gracias!
1.1 Materiales experimentales
1.1.1 Materias primas y auxiliares
Seda, raíz de kudzu, cidra y ciruela negra se compraron en el Mercado de Xuzhou. El laboratorio proporcionó sacarosa, proteasa neutra (130 000 u/g) y tripsina (4000 u/g), y la fábrica de productos bioenzimáticos Guangxi Haifa proporcionó papaína (650 000 u/g).
1.1.2 Reactivo principal
Reactivo de formaldehído, ácido sulfúrico concentrado, ácido clorhídrico concentrado, hidróxido de sodio, sulfato de sodio anhidro, cloruro de calcio anhidro, agua con cloro, ácido ftálico, hidrógeno potásico, metilo rojo, sulfato de cobre, ácido bórico, extracto de carne, peptona, agar, sal, resinas de intercambio aniónico 731 y 723 y una mezcla de 1 volumen de azul de metileno y 2 volúmenes de indicador rojo de metilo.
1.1.3 Equipo principal
Horno de secado eléctrico a temperatura constante, incubadora eléctrica a temperatura constante, trituradora multifunción, centrífuga a gran escala de baja velocidad, báscula de estante, agitador magnético , acidómetro de precisión, balanza electrónica, baño María digital a temperatura constante, esterilizador de vapor a presión portátil, cocina de inducción.
1.2 Método experimental
1.2.1 Diagrama de flujo
(1) Flujo del proceso de preparación de bebidas a partir de solución de acidólisis.
Desgomado de seda → hidrólisis ácida → desacidificación de resina de intercambio catiónico → aminoácidos de fibroína de seda.
Medicina herbaria china→limpieza→extracción→filtración gruesa→mezcla centrífuga→
Sabor, VC, sacarosa, etc.
Llenado → Sellado → Esterilización → Enfriamiento → Evaluación sensorial e inspección higiénica → Producto terminado.
(2) El proceso tecnológico para la preparación de bebidas a partir de hidrolizado enzimático.
Desgomado de la seda → El cloruro cálcico disuelve la fibroína de la seda → Hidrólisis enzimática → Inactivación enzimática → Elimina el cloruro cálcico de la fibroína de la seda → Aminoácidos.
Materiales medicinales chinos→limpieza→extracción→filtración gruesa→centrifugación→mezcla→relleno.
Sabor, VC, sacarosa, etc.
→Sellado→esterilización→enfriamiento→evaluación sensorial e inspección higiénica→producto terminado.
1.2.2 Método de desgomado de la seda
Hervir la seda lavada y seca en soluciones de Na2CO3 al 0,4%, 0,5% y 0,6% durante 20min, 30min y 40min para determinar las mejores condiciones de desgomado.
1.2.3 Método de hidrólisis ácida de la fibroína de seda
Secar la fibroína de seda desgomada y realizar un experimento de factor único. Primero, la acidez es 3 M, la relación sólido-líquido es 1:50, la acidólisis se lleva a cabo a 111 °C durante 15 horas y el contenido de aminoácidos se mide cada hora, para obtener el rango apropiado de tiempo de acidólisis. Luego seleccione una proporción sólido-líquido de 1:50 y el tiempo de acidólisis dentro del rango anterior. A 110°C, se utilizan 1,0M, 1,5M, 2,0M, 2,5M, 3,0M, 3,5M, 4,0M, 5,0M, etc. Finalmente, seleccione la concentración de ácido y el tiempo dentro de un rango adecuado, y seleccionando diferentes relaciones sólido-líquido 1:20, 1:30, 1:40, 1:50, 1:60, 1:70 y 65438. Seleccione un rango adecuado entre los tres niveles de concentración de ácido, relación sólido-líquido y tiempo de acidólisis para realizar un experimento ortogonal de tres factores y tres niveles para encontrar las mejores condiciones de acidólisis.
1.2.4 Disolución de fibroína de seda en cloruro cálcico
Preparar diferentes concentraciones (30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65 %) solución de CaCl 2, mida el efecto de disolución de la fibroína de seda que contiene y descubra la concentración óptima de CaCl 2 para disolver la fibroína de seda.
1.2.5 Métodos de investigación del proceso de hidrólisis enzimática (1) Selección de la mejor hidrolasa. Hidrolice la solución de proteína de seda con la dosis óptima de enzima, la temperatura de hidrólisis enzimática, el valor del pH de hidrólisis enzimática y el mismo tiempo de hidrólisis enzimática de las tres proteasas, compare los efectos de hidrólisis enzimática de las tres enzimas y seleccione la enzima con el mejor efecto de hidrólisis según sobre el rendimiento de aminoácidos. (2) Determinación de las condiciones de hidrólisis enzimática. Con base en la proteasa de fibroína de seda óptima determinada en los experimentos anteriores, se realizaron experimentos ortogonales en tres niveles: concentración de sustrato, valor de pH y temperatura para determinar las condiciones óptimas para la hidrólisis enzimática. Las concentraciones de sustrato fueron 4%, 5% y 6% respectivamente, los valores de pH fueron 5,0, 5,5 y 6,0 respectivamente y las temperaturas de hidrólisis enzimática fueron 50°C, 55°C y 60°C respectivamente.
1.2.6 Desacidificación de la solución de acidólisis
Utilizar resina de intercambio catiónico fuertemente ácida 732 para desacidificar la solución de acidólisis.
Cuando el efluente reaccione con la ninhidrina y se vuelva púrpura, deje de cargar la columna y lave la columna de intercambio iónico con agua desionizada hasta que el efluente esté cerca de ser neutro. Luego use amoníaco 0,5 M para eluir los aminoácidos hasta que la ninhidrina ya no se vuelva púrpura.
1.2.7 Extracción del jugo de hierbas medicinales chinas
Extraer la medicina herbaria china lavada y agua purificada en un baño de agua a 90°C en una proporción de 65, 438+0:65 , 438+00 65, 438+0h para obtener el filtrado, luego agregar 8 veces el agua purificada al residuo, extraer en un baño de agua a 90°C durante 0,5 h, combinar el filtrado y el residuo, centrifugar con una gran velocidad baja. -capacidad centrífuga, y reservar.
1.2.8 Preparación de bebidas
Diseñe un experimento ortogonal de 3 factores, 3 niveles, 1 para seleccionar recetas de bebidas. Para clasificar las bebidas, es necesario determinar un estándar de clasificación basado en el color, el aroma, el sabor y el estado organizativo del producto.
1.2.9 Esterilización e inspección higiénica de bebidas
Esterilización de bebidas: Esterilizar el producto terminado a 90°C durante 65,438±05min, 20min y 25min respectivamente, y luego colocarlo en una temperatura constante de 37°C En una incubadora al baño maría, observar su estabilidad y seleccionar el mejor tiempo de esterilización. El número total de bacterias se determinó mediante el método de recuento de colonias en placa.
1.3 Elementos y métodos de prueba
Utilice el método de determinación de nitrógeno micro Kjeldahl para determinar la proteína cruda en la seda. Determinación del contenido de nitrógeno amino mediante método potenciométrico de formaldehído.
1.3.1 Prueba del efecto de desacidificación del hidrolizado de fibroína de seda
Utilice una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte tipo 732 y colóquela en una columna de resina con una altura de 40 cm y un diámetro de 15. Cuando el efluente produce ninhidrina de color púrpura, significa que la resina está saturada y la solución de aminoácidos sale. En este momento, deje de cargar la columna, enjuague la columna de intercambio iónico con agua desionizada hasta que el efluente sea casi neutro y luego use 0,5. Agua con amoniaco para eluir los aminoácidos a ninhidrina. La cetona no reacciona ni desarrolla color, lo que indica que el aminoácido se ha eliminado.
1.3.2 Detección del efecto de desionización de la resina de intercambio aniónico
Seleccione la solución de fibroína de seda disuelta con la solución de CaCl2_2 para eliminar el Ca2+ a través de una columna de resina de intercambio catiónico con una altura de columna de 40 cm y un diámetro de φ 15. Use solución de NaOH para detectar si hay Ca2+ en el efluente. Cuando no haya precipitado blanco, elimine el Cl- a través de una resina de intercambio aniónico con una altura de columna de 40 cm y φ 15. Use AgNO3_3 para detectar si hay. hay Cl- en el efluente. Cuando no haya precipitado blanco, detenga la columna.
2 Resultados y Discusión
2.1 Determinación de las condiciones de desgomado de la seda
Los componentes secundarios de la seda se distribuyen principalmente en la sericina. Para garantizar la calidad de los aminoácidos de la fibroína de seda, es necesario el desgomado. La fibroína de seda es insoluble en agua, mientras que la sericina es soluble en agua. Aunque la sericina es hidrófila, lleva mucho tiempo separarse de la fibroína de seda en un medio acuoso y requiere un tratamiento a alta temperatura, por lo que se utiliza Na2CO3 como medio de separación. Entre ellos, tasa de eliminación de sericina (%) = contenido de proteína en la solución de sericina (g) × 100% de la cantidad total de sericina (g). Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1 Plan de diseño experimental ortogonal de Na2CO3 y resultados de eliminación de fibroína de seda
Tiempo de procesamiento (minutos) concentración (%) tasa de eliminación de sericina (%)
1 1 (20) 1(0,4) 48,5
2 1 2(0,5) 35,7
3 1 3(0,6) 59,8
4 2(30) 1 60,3
5 2 2 100
6 2 3 100
7 3(40) 1 73,9
8 3 2 100
9 3 3 100
Como se puede ver en la Tabla 1, hervir en una solución de NaCO3 al 0,5% durante 30 minutos tiene el mejor efecto desgomado. Para evitar que el agua se evapore durante la ebullición y afecte la concentración de NaCO3, es necesario tapar el recipiente. Después del desgomado, la seda se convierte en fibroína de seda y la sericina existe en medio acuoso.
2.2 Experimento de hidrólisis ácida de factor único
Utilizar 1g de fibroína de seda para hidrolizar en H2SO4 3M, con una relación sólido-líquido de 1:60 y 110°C. Se descubrió que la fibroína de seda se puede disolver completamente en H2SO4 durante 3 horas. La hidrólisis de aminoácidos se midió entre 4 y 15 horas, y el contenido de aminoácidos fue mayor entre 8 y 10 horas. Después de 10 horas, hubo pocos cambios o incluso comenzó a disminuir.
A una relación sólido-líquido de 1:60 y 110°C durante 8 horas, compare la relación entre diferentes concentraciones de H2SO4 y el contenido de nitrógeno amino.
Los resultados muestran que una concentración de acidólisis demasiado baja o demasiado alta afectará el contenido de aminoácidos, y es apropiado controlarlo a 3 M ~ 4 M ~ 4 m
La fibroína de seda se acidoló a 3 M H2SO4 a 110 °C durante 8 horas y se determinó el contenido de sólidos. Efecto de la proporción de líquido sobre la hidrólisis ácida. La fibroína de seda se puede remojar al menos en una proporción sólido-líquido de 1:20, que es la proporción mínima sólido-líquido. Resultados: El mejor efecto de hidrólisis se logró cuando la relación sólido-líquido fue de 1:50 ~ 1:70.
2.3 Prueba ortogonal de hidrólisis ácida
Del experimento de un solo factor de hidrólisis ácida, se puede ver que los principales factores que afectan la hidrólisis ácida son la concentración de ácido, la relación sólido-líquido y el tiempo. entonces cada factor se selecciona Tres niveles. Los resultados experimentales se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2 Resultados y análisis de la prueba ortogonal de hidrólisis ácida
Columna A B C
Factor tiempo (h) Transformación ácida (m) Rendimiento de aminoácidos sólido-líquido (% )
Experimento 1 1(8)1(3)1(1:50)69.1.
Experimento 2 2(9) 2(3.5) 2(1∶60) 73.2
Experimento 3 3(10)3(4)3(1:70)71.9 p>
Experimento 4 2 1 2 87.2
Experimento 5 2 2 3 89.1
Experimento 6 2 3 1 86.5
Experimento 7 3 1 3 78,4
Experimento 8 3 2 1 80,3
Experimento 933279,6
El valor medio es 1 71 400 78,233 78,633.
Promedio 2 87.600 80.867 80.000
Promedio 3 79.433 79.333 79.800
Rango 16.200 2.634 1.367
Tasa de hidrólisis ácida en la Tabla 2 La más alta La combinación es A2B2C3, pero la combinación ideal en la Tabla 4 es A2B2C2, por lo que en comparación con A2B2C2, los resultados muestran que el rendimiento de aminoácidos de la fibroína de seda es del 89,8%, que es ligeramente mejor que A2B2C3, por lo que se determinan las condiciones óptimas para la hidrólisis ácida. ser: concentración de ácido 3,5 M, relación sólido-líquido 1: 60, 110 ℃.
2.4 Resultados de la disolución de la fibroína de seda con cloruro cálcico
La solubilidad de la fibroína de seda en solución de CaCl2_2 es bastante especial cuando la concentración es inferior al 35% o superior al 55%. casi insoluble, como se muestra en la Tabla 3, el 40% es óptimo.
La relación entre la concentración de CaCl_2 y la disolución de la fibroína de seda
1 2 3 4 5 6 7 8
Concentración de cloruro de calcio 30% 35% 40% 45 % 50 % 55% 60% 65%
La solubilidad de la fibroína de seda es 0 14,5% 100% 32,5% 15,5% 000.
2.5 Determinación de la hidrolasa óptima
La papaína hidroliza la fibroína de seda a pH 6,0, temperatura 50°C, E/S=10% y concentración de fibroína de seda 4%. Los resultados mostraron que la tasa de hidrólisis enzimática aumentó rápidamente dentro de las primeras 65438 ± 0 h, alcanzó 0,07 mg/ml en 3 h y luego aumentó lentamente. La tripsina hidroliza la fibroína de seda a un pH de 8,0, una temperatura de 40 °C, E/S = 2 % y una concentración de fibroína de seda del 4 %. El valor máximo en 7 horas fue de 0,053 mg/ml. La proteasa neutra hidroliza la fibroína de seda a pH 7,0, temperatura 50°C, E/S=2% y concentración de fibroína de seda 4%, alcanzando 0,065 mg/ml en 3 horas. Por tanto, la papaína tiene el mejor efecto de hidrólisis.
2.6 Prueba ortogonal de papaína hidrolizando fibroína de seda
Determinar la mejor combinación de condiciones para que la papaína hidrolice la fibroína de seda mediante una prueba ortogonal. Las condiciones óptimas de hidrólisis enzimática de la papaína son: pH 5,5, temperatura 55°C, concentración de sustrato 5% y dosis de enzima 10%. Finalmente, a partir de 1.001 g de fibroína de seda se pueden obtener 0,1.001.1,84 g de aminoácidos. De la comparación entre la hidrólisis ácida y la hidrólisis enzimática de la fibroína de seda, se concluyó que la hidrólisis ácida es significativamente mejor que la hidrólisis enzimática.
2.7 Mezclado de bebidas
Se debe prestar atención al ajuste del sabor durante la producción de la bebida. Los principales factores que afectan el sabor de la bebida son la concentración de aminoácidos, la concentración de hierbas medicinales chinas y la concentración de azúcar. Por lo tanto, se diseñó un experimento ortogonal de 3 factores y 3 niveles para optimizar la fórmula de la bebida. Como se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4 Análisis y resultados de la mezcla de bebidas
Columna A B C
Factor Aminoácido Medicina herbaria china Concentración de azúcar Resultados experimentales (%)
Concentración (% )Concentración (%)
Experimento 1 1(0.3)1(2)1(8)7.8
Experimento 2 1 2(3) 2(9) 7.4
Experimento 3 1 3(4) 3(10) 7.2
Experimento 4 2(0.4) 1 2 9
Experimento 5 dos dos tres ocho punto cinco
Experimento 6 2 3 1 8
Experimento 7 3 (0.5) 1 3 7.6
Experimento 8 3 2 1 7
Experimento 9332 Siete coma cinco
La media es 1 7.467 8.133 7.600.
Promedio 2 8.500 7.633 7.967
Promedio 3 7.367 7.567 7.767
Rango 1.133 0.566 0.367
Se puede concluir de la Tabla 4 Fórmula óptima de la bebida: la concentración de aminoácidos es del 0,4%, la concentración de jugo de hierbas chinas es del 2%, la concentración de azúcar es del 9% y se agrega una pequeña cantidad de esencia de melocotón y VC para obtener el producto terminado.
2.8 Prueba de estabilidad en almacenamiento de bebidas
En este experimento, se realizó la esterilización antes y después del enlatado, y el jugo de hierbas chinas se centrifugó, por lo que la bebida obtenida fue clara y transparente. Después del enlatado, se observó la estabilidad a través de diferentes tiempos de esterilización. Esterilizar a 90°C durante 65,438±05 minutos, 20 minutos y 25 minutos respectivamente, y luego colocar en una incubadora de temperatura constante a 37°C para observación. Después de 9 días, no hubo cambios y todavía era una solución clara y transparente de color amarillo-marrón.
Para determinar el tiempo óptimo de esterilización, se realizaron pruebas de bacterias en los productos terminados almacenados durante 9 días. Como resultado, después de la esterilización a 90°C durante 25 minutos, el número total de bacterias fue de 56/ml, lo que cumplió con los estándares nacionales.
3 Estándares de Calidad del Producto
3.1 Índice Sensorial
Color: marrón amarillento, uniforme. Sabor: agridulce, ligeramente amargo con aminoácidos de proteína de seda y hierbas medicinales chinas, sin olor peculiar. Morfología del tejido: el jugo es transparente, sin impurezas y no precipita después de un almacenamiento prolongado.
3.2 Indicadores físicos y químicos
Acidez: pH 3,5 ~ 4,0, número total de bacterias ≤100/ml, coliformes ≤3/ml, no se pueden detectar bacterias patógenas.
4 Conclusión
El rendimiento de aminoácidos de la hidrólisis ácida de la fibroína de seda es mayor que el de la hidrólisis enzimática. El rendimiento de la hidrólisis ácida alcanza el 89,1%, mientras que el rendimiento de la hidrólisis enzimática es solo del 18,1. %. La hidrólisis ácida es más simple que la hidrólisis enzimática y el color y el olor del hidrolizado son mejores, por lo que la hidrólisis ácida se utiliza para elaborar bebidas. La condición óptima para el desgomado es hervir con carbonato de sodio al 0,5% durante 30 minutos. En estas condiciones, la sericina se eliminó completamente sin pérdida de fibroína. La fibroína desgomada se lavó y secó y luego se sometió a hidrólisis ácida. Las condiciones óptimas del proceso para la hidrólisis ácida son: 3,5MH2SO4, relación sólido-líquido 1:60, 10 °C, tiempo 9 h y el rendimiento de aminoácidos llega al 89,8 %. La solución de aminoácidos después de la desacidificación de la resina de intercambio catiónico se mezcló con hierbas medicinales chinas para obtener el plan de mezcla óptimo: la concentración de aminoácidos de fibroína de seda es del 0,4%, la concentración de hierbas medicinales chinas es del 2%, la concentración de azúcar es del 9% y la concentración de VC es 0,2%. De esta forma se elabora una bebida leonada clara, agridulce.