¿Qué es la hibridación fluorescente in situ (FISH) y cómo se realiza?

La hibridación in situ por fluorescencia (FISH) es una tecnología citogenética molecular. Es una tecnología no radiactiva desarrollada a finales de la década de 1980 basada en la tecnología de hibridación in situ radiactiva original. En la actualidad, esta tecnología se ha utilizado ampliamente en muchos campos, como la investigación de la estructura del genoma de animales y plantas, el análisis de la variación de la estructura fina de los cromosomas, el análisis de infecciones virales, el diagnóstico prenatal humano, la genética de tumores y la investigación de la evolución del genoma.

1. Principio del método experimental:

El principio básico de FISH es utilizar como sondas ácidos nucleicos monocatenarios marcados conocidos, según el principio de complementariedad de bases, con materiales desconocidos. en el material a analizar los ácidos nucleicos monocatenarios se unen heterosexualmente para formar ácidos nucleicos híbridos bicatenarios que pueden detectarse. Dado que las moléculas de ADN están dispuestas linealmente a lo largo del eje longitudinal del cromosoma, la sonda se puede hibridar directamente con el cromosoma para localizar un gen específico en el cromosoma. En comparación con la hibridación in situ radiomarcada tradicional, la hibridación in situ fluorescente tiene las características de rapidez, señal de detección fuerte, alta especificidad de hibridación y tinción múltiple, por lo que ha recibido una amplia atención en el campo de la citogenética molecular.

Las sondas utilizadas para la hibridación se pueden clasificar aproximadamente en tres categorías: 1) Sondas de secuencia repetida específica de cromosoma, como las sondas satélite α y satélite III, cuyos sitios objetivo de hibridación suelen tener un tamaño superior a 1 Mb y no contienen secuencias de repeticiones dispersas, que se unen estrechamente al sitio objetivo, tienen una fuerte señal de hibridación y son fáciles de detectar 2) sondas de cromosomas completos o de regiones cromosómicas específicas, que se componen de fragmentos de nucleótidos extremadamente diferentes en un cromosoma o en un determinado segmento; de un cromosoma, y ​​pueden estar compuestos por fragmentos grandes específicos de un cromosoma clonados en fagos y se obtienen plásmidos 3) Sondas de posición específica, constituidas por una o varias secuencias clonadas;

La sonda se puede marcar con fluoresceína mediante métodos de marcaje directo o indirecto. El marcaje indirecto utiliza sondas de ADN marcadas con biotina. Después de la hibridación, se utiliza para la detección avidina o estreptavidina conjugada con fluoresceína. Al mismo tiempo, se puede utilizar un complejo de avidina-biotina-fluoresceína para convertir la señal de fluorescencia en fragmentos. Se puede detectar un valor de 500 pb. El método de etiquetado directo consiste en unir directamente la fluoresceína al nucleótido de la sonda o al esqueleto de pentosa fosfato, o incorporar el nucleósido trifosfato de fluoresceína al marcar la sonda utilizando el método de traducción de mella. El método de etiquetado directo tiene pasos de detección simples, pero debido a que no puede realizar la amplificación de la señal, la sensibilidad no es tan buena como la del método de etiquetado indirecto.

2. Métodos y pasos experimentales

1. Desnaturalización de la sonda

Incubar la sonda en un baño de agua a temperatura constante a 75°C durante 5 minutos, luego inmediatamente colóquelo a 0°C de 5 a 10 minutos para desnaturalizar la sonda de ADN bicatenario.

2. Desnaturalización de las muestras

(1) Hornee las muestras de portaobjetos de cromosomas preparadas en una incubadora a 50 °C durante 2 a 3 horas. (Las muestras teñidas con Giemsa deben difuminarse con fijador antes de hornearlas en secciones).

(2) Saque la muestra del portaobjetos y sumérjala en una solución desnaturalizante con una fracción de volumen de 70 formamida/2×SSC a 70-75 °C durante 2-3 minutos.

(3) Deshidrate inmediatamente la muestra a través de una serie de series de hielo y etanol con una fracción de volumen de 70, una fracción de volumen de 90 y una fracción de volumen de 100, durante 5 minutos cada vez, y luego airee. seco.

3. Hibridación

Deje caer 10 μL de sonda de ADN desnaturalizada o pre-hibridada sobre la muestra del portaobjetos desnaturalizada y deshidratada, cúbrala con un cubreobjetos de 18×18 y cubra el portaobjetos con Parafilm y colóquelo en una caja oscura y húmeda a 37°C para la hibridación durante la noche (alrededor de 15 a 17 horas). Dado que la solución de hibridación es menor, la temperatura de hibridación es alta y la duración es larga, para mantener la muestra húmeda, este proceso se realiza en una caja húmeda.

4. Elución

Este paso ayuda a eliminar las sondas unidas no específicamente, reduciendo así el fondo.

(1) Al día siguiente de la hibridación, saque la muestra de la incubadora a 37 °C y retire suavemente el cubreobjetos con una hoja de afeitar.

(2) Coloque la muestra del portaobjetos hibridada en formamida de fracción volumétrica 50/2×SSC precalentada a 42-50 °C y lávela tres veces durante 5 minutos cada vez.

(3) Lavar 3 veces en 1×SSC precalentado a 42-50°C, 5 minutos cada vez.

(4) Lave suavemente la muestra del portaobjetos en 2×SSC a temperatura ambiente.

(5) Sacar el portaobjetos y secar de forma natural.

(6) Agregue 200 μl de solución de contratinción (solución de tinción PI/antifade o DAPI/antifade) gota a gota sobre la muestra del portaobjetos y cúbrala con un cubreobjetos.

5. Amplificación de la señal de hibridación (aplicable a sondas marcadas con biotina)

(1) Añadir 150 μL de solución bloqueadora I al sitio de hibridación del portaobjetos y cubrir con plástico. envolver Cubrir e incubar a 37°C durante 20 minutos.

(2) Retire la envoltura de plástico, agregue 150 μLavidin-FITC a la muestra, cubra con una envoltura de plástico y continúe incubando a 37 °C durante 40 minutos.

(3) Sacar la muestra y lavarla tres veces en eluyente precalentado de 42 a 50°C, durante 5 minutos cada vez.

(4) Añadir 150 μL de solución de bloqueo II al sitio de hibridación de la muestra del portaobjetos, cubrir con una envoltura de plástico e incubar a 37 °C durante 20 minutos.

(5) Retire la envoltura de plástico, agregue 150 μL de antiavidina a la muestra, cubra con una envoltura de plástico nueva e incube a 37 °C durante 40 minutos.

(6) Saque la muestra, póngala en un eluyente nuevo que haya sido precalentado a 42-50 °C y lávela 3 veces, 5 minutos cada vez.

(7) Repita los pasos (1), (2) y (3) y luego lave en 2×SSC a temperatura ambiente.

(8) Sacar el portaobjetos y secar de forma natural.

(9) Agregue 200 μLPI/tinte antidecoloración gota a gota a la muestra del portaobjetos y cúbrala con un cubreobjetos.

6. Montaje

Se pueden utilizar diferentes tipos de líquido de montaje. Si el líquido de montaje no contiene Mowiol (lo que puede hacer que el líquido de montaje produzca un efecto autosellante), para evitar que se evapore la solución entre el cubreobjetos y el portaobjetos, se puede usar esmalte de uñas para sellar alrededor de la cubierta. deslizar. Las muestras de portaobjetos sellados se pueden almacenar en una caja oscura en un refrigerador entre -20 y -70 °C durante varios meses.

7. Observe los resultados de FISH bajo un microscopio de fluorescencia

Primero encuentre el campo de visión con la fase de división celular bajo la fuente de luz visible y luego encienda la fuente de luz de excitación de fluorescencia. La longitud de onda de excitación de FITC es de 490 nm. Las células se tiñen de rojo con PI, mientras que la ubicación de la sonda marcada con FITC emite fluorescencia verde.