¿El estado y la aplicación de la patología molecular?
Aplicación de la patología molecular
1. Tratamiento con imatinib de tumores del estroma gastrointestinal y detección de genes c-kit y PDGFRA.
El mesilato de imatinib (imatinib, anteriormente conocido como STI157, nombre comercial Gleevec o Gleevec) es un modelo de terapia molecular dirigida exitoso en los últimos años, pero en el análisis genético de los GIST aún quedan muchas cuestiones por resolver. resuelto en el tratamiento tipo. El estudio en profundidad de los mecanismos patológicos moleculares de GIST puede proporcionar una base experimental para mejorar su plan de tratamiento molecular dirigido y proporcionar pistas para el descubrimiento de otros objetivos específicos de tumores.
1. La base molecular de imatinib en el tratamiento de tumores del estroma gastrointestinal.
La aparición de imatinib en 2001 marcó una estrategia antitumoral dirigida a las vías de transducción de señales de las células tumorales. logró avances significativos. Imatinib es un inhibidor de la tirosina proteína quinasa y el primer fármaco contra el cáncer desarrollado basándose en la comprensión de los mecanismos de transducción de señales de las células tumorales. La relación genotipo-fármaco entre el protooncogén tirosina quinasa y el imatinib proporciona un modelo significativo para el desarrollo de inhibidores de la transducción de señales dirigidos a otros tumores [1]. Inicialmente, imatinib se desarrolló como un inhibidor específico del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR). Posteriormente, se descubrió que imatinib puede inhibir selectivamente la proteína quinasa Bcr-Abl, inhibiendo así el crecimiento de células leucémicas y la formación de tumores, sin afectar las quinasas que desempeñan un papel en el crecimiento y la proliferación de células normales. Es eficaz para Bcr. -Mieloide crónico Abl positivo El tratamiento de la leucemia tiene muy buenos resultados. Buchdunger et al. descubrieron más tarde que imatinib también bloquea la función del receptor de tirosina proteína quinasa KIT, que recuerda al GIST. El GIST no responde a la quimioterapia ni a la radioterapia tradicionales. Los ensayos clínicos han demostrado que imatinib es muy eficaz en GIST refractarios y/o metastásicos. Se ha utilizado para GIST avanzados irresecables y ha comenzado a utilizarse como terapia adyuvante para pacientes con alto riesgo de recurrencia postoperatoria. Mi país ha utilizado imatinib para tratar GIST desde 2001 y ha logrado resultados considerables.
El GIST es el tumor mesenquimal más común del tracto gastrointestinal. Hay al menos de 2000 a 5000 casos en los Estados Unidos cada año, y la tasa de incidencia en mi país también aumenta año tras año. El GIST puede ocurrir en cualquier parte del tracto gastrointestinal, más comúnmente en el estómago y el intestino delgado, y raramente en el epiplón y la cavidad peritoneal. Estudios recientes han encontrado que los GIST son similares a las células de Cajal del estroma gastrointestinal (ICC) en morfología, inmunofenotipo y ultraestructura, y ambas tienen la característica de expresar la proteína KIT, lo que sugiere que los GIST pueden originarse a partir de células madre que se diferencian en ICC. En la actualidad, se cree generalmente que el GIST no es absolutamente benigno y no se ha encontrado ningún indicador que pueda predecir específicamente una transformación maligna. Según los estándares de clasificación del comportamiento biológico de GIST propuestos por Fletcher en 2000, se puede dividir en riesgo de invasión muy bajo, bajo, medio y alto. El juicio final de malignidad depende de la recurrencia o metástasis del tumor. Esto plantea una tarea urgente para volver a comprender los GIST desde la perspectiva de la patología molecular.
La proteína KIT codificada por el protooncogén c-kit pertenece al receptor transmembrana de tirosina proteína quinasa (RTK) tipo III y consta de una región de tirosina quinasa intracelular, una región transmembrana y una región de unión a ligando. región. La composición del dominio extracelular del sitio.
Se dimeriza después de unirse a su ligando factor de células madre (SCF), activa su propia actividad tirosina proteína quinasa, fosforila los residuos del receptor y une la proteína de transducción de señales con el dominio funcional SH2 en el citoplasma al receptor, activando así las vías de transducción de señales posteriores. como la vía Ras/Raf/MEK/MAPK, PLC? /Vía DAG/IP3, vía PI-3K/AKT, vía JAK/STAT, etc. , provocando una serie de cambios celulares y regulando funciones celulares que incluyen proliferación, adhesión, apoptosis y diferenciación durante la tumorigénesis [2]. Por lo tanto, la expresión de la oncoproteína KIT es un evento central en GIST y también es un criterio específico y sensible reconocido para determinar GIST (CD117 positivo). Esclarecer la vía de señalización KIT también tiene importancia clínica. Dado que los pacientes con GIST pueden eventualmente desarrollar resistencia a la terapia inhibidora de KIT, la gente está tratando de encontrar moléculas proteicas importantes en las señales posteriores como nuevos objetivos para la resistencia a la terapia inhibidora de KIT.
2. La importancia de la detección del gen C-kit en el tratamiento de tumores del estroma gastrointestinal con imatinib.
En 1998, se informó que existen mutaciones en el gen c-KIT en los GIST, lo que hace que KIT La proteína aún puede mantener su propia actividad tirosina proteína quinasa en ausencia de unión al ligando, activando así vías de transducción de señales posteriores. Actualmente se cree que esta mutación de la ganancia de función del kit es un mecanismo importante de GIST. Entre ellas, las mutaciones en el exón 11 del gen kit que codifica el dominio casi transmembrana son las más comunes y representan de 50 a 92 casos. Además, las mutaciones en el exón 9 del dominio extracelular, el exón 13 del dominio quinasa y el exón 17 del dominio fosfotransferasa representaron de 8 a 13 y de 0 a 4, respectivamente. Entre ellos, el exón 11 tiene varias formas de mutación, incluidas mutaciones por eliminación en el marco, mutaciones puntuales y mutaciones de inserción ITD repetidas en tándem de reconocimiento en el marco. Hay pocos informes sobre la detección molecular de GIST en China y la mayoría de ellos se centran en mutaciones en el exón 11. El tamaño de la muestra es pequeño y la tasa de mutación es baja, respectivamente 30,8 (14/52) y 41,5 (34/82). sin 9 y 65438. Nuestro estudio en una pequeña muestra de 60 casos de GIST mostró que se detectaron mutaciones del kit en 38 casos (63,3), todos los cuales fueron positivos para CD117: 35 casos (58,3) tenían mutaciones en el exón 11 y 2 casos (3,3) tenían mutaciones en el exón 9. mutaciones. Sólo 65438. Entre 100 muestras de GIST, se detectaron mutaciones de Kit en 68 (no publicado). Parece que la tasa de mutación del exón 9 de GIST en mi país es significativamente menor que en el extranjero, porque algunos estudios han señalado que el exón 9 pertenece a un subtipo de mutación especial, que a menudo ocurre fuera del estómago, y su comportamiento biológico es altamente invasivo. La proporción de este tipo de GIST (originalmente diagnosticado como maligno) en China es significativamente mayor que en el extranjero, y no es raro que ocurra fuera del estómago. Es necesario un estudio a gran escala para determinar si existen diferentes sitios de mutación genética en el GIST chino. Recientemente, muchos estudios han intentado correlacionar las tasas de mutación con las características histológicas y el comportamiento clínico. Los primeros informes indicaron que las mutaciones son más comunes en los GIST con estadio avanzado o alto riesgo de invasión, pero la mayoría de los informes actuales sugieren que las mutaciones genéticas no tienen una correlación significativa con el tamaño del tumor, la mitosis o el estadio progresivo. La literatura nacional relevante es que las mutaciones son comunes en personas con alto riesgo de invasión. Nuestros resultados preliminares muestran que incluso los GIST de menos de 1 cm de diámetro que se descubren accidentalmente debido a otras enfermedades tienen una proporción considerable de mutaciones en el exón 11, lo cual es consistente. con Antonescu CR Los resultados son consistentes. Por lo tanto, es necesario realizar análisis estadísticos en muestras grandes para encontrar los patrones entre los genotipos de GIST de mi país y las características patológicas y clínicas, y aclarar aún más el papel de las mutaciones del kit en la aparición de GIST.
Aún no está claro si la mutación KIT en sí está relacionada con el pronóstico del paciente. Los estudios han demostrado que la mutación KIT es un indicador de pronóstico independiente de supervivencia, es decir, la tasa de supervivencia a 5 años de las personas con mutaciones es menor que la de las personas sin mutaciones. Y algunos estudios han señalado que la tasa de supervivencia de las mutaciones puntuales en el exón 11 es mayor que la de las mutaciones de deleción e inserción.
La aplicación de imatinib puede mejorar significativamente el pronóstico de los pacientes. Se ha demostrado que la ubicación de las mutaciones del kit puede afectar la respuesta de GIST al imatinib. Algunos estudios clínicos y in vitro han demostrado que las mutaciones en el sitio de la quinasa son ineficaces contra los inhibidores, como la mutación D816V en la región de la quinasa asociada con la hiperplasia de los mastocitos.
Afortunadamente, la mayoría de las mutaciones KIT se encuentran en regiones reguladoras, es decir, dominios distintos de tirosina quinasa, lo que permite que el inhibidor bloquee eficazmente el sitio de la enzima. Además, en comparación con aquellos con mutaciones en el exón 11 y aquellos sin mutaciones en el exón 9, la tasa de respuesta parcial de imatinib es significativamente mayor, el tiempo de supervivencia promedio es prolongado y la enfermedad progresa lentamente [4 ~ 5].
Al mismo tiempo, algunos estudios creen que imatinib puede ejercer y potenciar su efecto antitumoral al promover la actividad de las células NK. Incluso para los GIST con baja expresión de KIT, el imatinib tiene cierto efecto terapéutico.
Por lo tanto, la detección de mutaciones en el gen c-kit en muestras quirúrgicas de pacientes es de gran importancia para determinar el pronóstico de la aplicación de imatinib.
Detección de 3.3. Gen PDGFRA y tumores del estroma gastrointestinal
En los últimos años, los investigadores han prestado cada vez más atención a la aparición de mutaciones del kit de deleción de GIST. Dado que se descubrió que KIT se activaba incluso en GIST que contenían kit de tipo salvaje, la atención se centró en los receptores tirosina quinasas (RTK) relacionados con KIT. Este tipo de RTK incluye el protooncogén FMS, que codifica el receptor del factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF1), dos genes PDGFR: incluidos PDGFRA y PDGFRB, es un protooncogén relacionado con FMS. Entre ellos, el gen PDGFRA y el gen kit se encuentran cerca del cromosoma 4 humano y sus secuencias de aminoácidos son altamente homólogas. Recientemente, informes extranjeros han detectado mutaciones de PDGFRA en GIST de entre 28 y 67 años, sin mutaciones de PDGFRA y las mutaciones de kit son independientes entre sí. Por tanto, se considera que la adquisición de mutaciones funcionales de PDGFRA puede ser otra causa de GIST. Por un lado, la vía de transducción de señales de PDGFRA es similar al kit, y las mutaciones funcionales de PDGFRA pueden transformar las células de Cajal del intestino delgado; por otro lado, las mutaciones funcionales de PDGFRA pueden unirse al kit de tipo salvaje y activarlo en las células 293T; Este hallazgo confirma aún más el papel central de la activación de las RTK tipo III en la promoción de la aparición de GIST. No hay informes de mutaciones de PDGFRA en China. Detectamos mutaciones de PDGFRA en 3 de 60 casos (5), lo que representa 50 de los casos sin expresión de KIT. Todos son mutaciones puntuales D842V del exón 18 (dominio de bucle de activación), que es la forma de mutación más común. No se detectaron mutaciones en el exón 12 (dominio yuxtamembrana). Al igual que en el informe de Medeiros et al., esta mutación fue más común en casos malignos del epiplón/mesenterio. Un gran número de estudios de casos recientes sobre Lasota J han demostrado que las mutaciones de PDGFRA ocurren principalmente en el estómago y que la mayoría de los comportamientos biológicos son "benignos" [6]. Por lo tanto, es necesario estudiar el estado de las mutaciones de PDGFRA en mi país ampliando el número de casos.
Se ha confirmado que las mutaciones del exón 18 de PDGFRA no tienen un impacto significativo sobre los inhibidores, pero los informes de que 30 casos de mutaciones del exón PDGFRA todavía son sensibles al imatinib sugieren que se debe prestar atención al diagnóstico y detección de KIT- GIST negativos. Mutaciones genéticas correspondientes para determinar si pueden tratarse con imatinib.
Por lo tanto, los GIST se pueden dividir en al menos tres tipos según los cambios a nivel molecular: mutantes kit, mutantes PDGFRA y no mutantes. Por lo tanto, en la mayoría de los casos los GIST pueden considerarse tumores impulsados por un único mecanismo molecular. Sin embargo, la patogénesis de la mayoría de los cánceres humanos es compleja. Si pudiéramos clasificarlos en función de cambios moleculares claros, sería posible abordar cada tipo con tratamientos moleculares específicos. Debido a que la gran mayoría de los GIST tienen una alta expresión de KIT, incluso en ausencia de mutaciones genéticas, no hay investigaciones relevantes sobre qué factores iniciadores conducen a esta parte de los GIST. La mutación Kit es un evento temprano en el GIST, y la mayoría de los GIST "benignos" con mutaciones no progresan a "malignos", lo que indica que la mutación Kit en sí no causa la transformación maligna del GIST. Se desconocen los factores que conducen a la transformación maligna de los tumores del estroma gastrointestinal.
4. Detección del gen C-kit y del gen PDGFRA y resistencia al tratamiento con imatinib de tumores del estroma gastrointestinal.
Aunque imatinib ha logrado logros alentadores en el tratamiento de tumores del estroma gastrointestinal, inevitablemente surgen problemas de resistencia. Los estudios preliminares sugieren que la resistencia involucra mecanismos dependientes o independientes del kit. En la mayoría de los casos, la resistencia aún puede deberse a la reactivación del KIT. En algunos casos, las mutaciones presentes en o cerca del sitio de interacción fármaco-proteína, o mutaciones que pueden cambiar la conformación de la proteína y reducir la afinidad entre KIT e imatinib, pueden debilitar la eficacia del fármaco. Recientemente, Chen LL et al. informaron que 5 pacientes con GIST con mutaciones en los exones 9 u 11 sensibles a imatinib desarrollaron resistencia durante el tratamiento y adquirieron una nueva mutación puntual: V654V, ubicada en el dominio de tirosina del kit [7]. Esta resistencia puede deberse a cambios conformacionales en la proteína KIT.
Curiosamente, Debiec-Rychter informó recientemente sobre un nuevo mecanismo: un paciente desarrolló resistencia a imatinib a partir de la mutación kit-G565R a través de la mutación secundaria PDGFRA D842V [8]. Este fenómeno sugiere que la resistencia al imatinib se puede lograr mediante mutaciones en otra quinasa, como la PDGFRA. La insensibilidad al imatinib en algunos casos puede estar relacionada con la amplificación del gen c-kit o PDGFRA. Por lo tanto, no se recomienda la quimioterapia convencional para pacientes con GIST, que puede promover la progresión de la clonalidad y la diferenciación asociadas con la evolución de la enfermedad y producir cambios genéticos que afectan la respuesta al fármaco. El mecanismo de resistencia a los medicamentos independiente de KIT se basa en el descubrimiento de que existe una pérdida completa de la expresión de KIT. La interfase FISH confirmó la pérdida del kit marcado/gen PDGFRA. Al mismo tiempo, también descubrieron que varias mutaciones resistentes a imatinib son sensibles a PKC412, otro inhibidor de KIT y PDGFR. Esto proporciona pistas significativas para la búsqueda de alternativas a la resistencia al imatinib. Las razones del desarrollo de resistencia a los medicamentos en algunos casos no están claras y muchas cuestiones aún requieren más estudio.
En resumen, el estudio en profundidad de los mecanismos moleculares de aparición, desarrollo, tratamiento eficaz y resistencia a los medicamentos de los GIST puede proporcionar bases y nuevos objetivos para la terapia biológicamente dirigida.
2. Detección del tratamiento con Herceptin del cáncer de mama y sobreexpresión del gen HER2/neu (cerbB2).
Las bases moleculares de 1. La aplicación de Herceptin en el tratamiento del cáncer de mama
HER2/neu es un miembro de la familia EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico), que juega un papel importante en la transducción de señales celulares y es responsable del crecimiento celular. diferenciación y supervivencia. Normalmente HER2/neu se expresa sólo en el feto. En la edad adulta, hay baja expresión sólo en unos pocos tejidos. Se ha demostrado que la sobreexpresión del producto genético normal de HER2/neu desempeña un papel clave en la transformación maligna, como el cáncer de ovario, el adenocarcinoma de pulmón y el carcinoma primario de células renales. especialmente cáncer de mama, y es un indicador de mal pronóstico.
Dado que la sobreexpresión de HER2/neu está estrechamente relacionada con la tumorigénesis, se descubrió que un anticuerpo contra HER2/neu regula negativamente su expresión, denominado trastuzumab (Herceptin). Afecta el crecimiento del tumor a través de mecanismos directos e indirectos: el mecanismo directo es que la unión del anticuerpo a HER2/neu altera la función de transducción de señales del receptor. El mecanismo indirecto es que los anticuerpos matan las células tumorales mediante ADCC y citotoxicidad dependiente del complemento, y también pueden inducir la diferenciación celular y la apoptosis. Se ha utilizado con éxito en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama con amplificación o sobreexpresión del gen HER2/neu con o sin metástasis en los ganglios linfáticos axilares. Herceptin, ya sea utilizado solo o en combinación con quimioterapia, es una opción importante en el tratamiento de las metástasis del cáncer de mama, ya sea como opción de primera o segunda línea. Debido a sus pequeños efectos secundarios y la buena tolerancia del paciente, se ha convertido en un ejemplo exitoso de terapia dirigida.
2. Método de detección de la sobreexpresión del gen her 2/neu
Cómo detectar de forma precisa y cómoda casos de cáncer de mama con sobreexpresión del gen HER2/neu para proporcionar información para el tratamiento de Herceptin Judging. el pronóstico basado en él se ha convertido en un tema de constante investigación por parte de los patólogos.
Actualmente, los métodos más utilizados son ELISA, FISH (hibridación in situ por inmunofluorescencia) y IHC (inmunohistoquímica). ELISA se utiliza principalmente para detectar la proteína p185 total en el suero o tejidos frescos de pacientes con cáncer de mama. Este método es sensible, simple, seguro y de bajo costo, pero solo es adecuado para muestras frescas y no para tejidos incluidos en parafina. El método FISH se utiliza para verificar el cariotipo de las células mitóticas, identificar la cantidad de cromosomas y determinar la fuente de las células tumorales. Este método es altamente específico, estable y sensible y puede observar directamente la amplificación del gen HER2/neu. La principal desventaja es que es caro y difícil de popularizar. El método IHC se utiliza ampliamente debido a su simplicidad. Sin embargo, la tasa de falsos negativos es alta y los factores subjetivos tienen un mayor impacto en la interpretación del grado de señales positivas. Estamos intentando detectar la sobreexpresión del gen HER2/neu mediante PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa de monitorización en tiempo real). Este método se basa en analizar el nivel de amplificación del ARNm y detectar productos de amplificación por PCR en tiempo real. No requiere procesamiento general del producto de PCR, evitando así diversos problemas causados por la operación [9]. Todo el proceso de PCR puede monitorearse dinámicamente y ser cuantitativamente práctico. Se enfatiza particularmente que sólo unificando y estandarizando los métodos de detección anteriores podremos proporcionar un estado preciso del gen HER2/neu y proporcionar una base confiable para el tratamiento.
3. Otros
Además de los dos fármacos de éxito mencionados anteriormente, existen muchos fármacos dirigidos molecularmente que también muestran buenas perspectivas de aplicación. Por ejemplo, algunos casos de cáncer de pulmón son eficaces bajo tratamiento con inhibidores de EGFR, que están asociados con mutaciones en el dominio quinasa de EGFR. Recientemente, la inhibición de la angiogénesis mediada por tumores proporciona un nuevo enfoque no citotóxico para la terapia tumoral. Avastin (Bevacizumab, rhumab-VEGF) es el primer anticuerpo monoclonal anti-VEGF recombinante humano que puede unirse y bloquear los efectos del VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), ejerciendo así actividad antitumoral. Su eficacia no sólo está relacionada con la formación de vasos sanguíneos intersticiales, sino también con el nivel de expresión de VEGF en el tumor [10].
Se puede esperar que en el futuro la patología molecular desempeñe un papel más importante en la investigación y aplicación de la terapia molecular dirigida a tumores, y también promueva su estrecha integración con la práctica clínica y la haga más práctica. .